Իմունոմոդուլյատոր մետաբոլիտները ուռուցքային միկրոմիջավայրի (ՈւՄՄ) հիմնական առանձնահատկությունն են, սակայն մի քանի բացառություններով, դրանց ինքնությունը մեծ մասամբ անհայտ է մնում: Այստեղ մենք վերլուծել ենք բարձր աստիճանի սերոզ քաղցկեղով (ՀԳԿ) հիվանդների ուռուցքներից և ասցիտներից վերցված ուռուցքներն ու T բջիջները՝ այս տարբեր ՈւՄՄ բաժանմունքների մետաբոլոմը բացահայտելու համար: Ասցիտները և ուռուցքային բջիջները ունեն մետաբոլիտների մեծ տարբերություններ: Ասցիտի համեմատ, ուռուցք ներթափանցող T բջիջները զգալիորեն հարստացված են 1-մեթիլենկոտինամիդով (ՄՄՆ): Չնայած T բջիջներում ՄՄՆ-ի մակարդակը բարձր է, նիկոտինամիդ N-մեթիլտրանսֆերազի (ֆերմենտ, որը կատալիզացնում է մեթիլ խմբերի փոխանցումը S-ադենոզիլմեթիոնինից նիկոտինամիդ) արտահայտությունը սահմանափակվում է ֆիբրոբլաստներով և ուռուցքային բջիջներով: Ֆունկցիոնալ առումով, ՄՄՆ-ն դրդում է T բջիջներին արտազատել ուռուցքը խթանող ցիտոկին ուռուցքային նեկրոզի գործոն ալֆա: Հետևաբար, ԹՄՄ-ից ստացված ՄՄՆ-ն նպաստում է T բջիջների իմունային կարգավորմանը և ներկայացնում է մարդու քաղցկեղի բուժման իմունաթերապիայի պոտենցիալ թիրախ:
Ուռուցքից առաջացած մետաբոլիտները կարող են խորը արգելակող ազդեցություն ունենալ հակաուռուցքային իմունիտետի վրա, և ավելի ու ավելի շատ ապացույցներ ցույց են տալիս, որ դրանք կարող են նաև ծառայել որպես հիվանդության առաջընթացի հիմնական շարժիչ ուժ (1): Վարբուրգի էֆեկտից բացի, վերջերս սկսվել են աշխատանքներ՝ բնութագրելու ուռուցքային բջիջների նյութափոխանակության վիճակը և դրա կապը ուռուցքային միկրոմիջավայրի (TME) իմունային վիճակի հետ: Մկների մոդելների և մարդու T բջիջների վրա կատարված ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ գլուտամինի նյութափոխանակությունը (2), օքսիդատիվ նյութափոխանակությունը (3) և գլյուկոզի նյութափոխանակությունը (4) կարող են անկախ գործել իմունային բջիջների տարբեր ենթախմբերի վրա: Այս ուղիների մի քանի մետաբոլիտներ արգելակում են T բջիջների հակաուռուցքային գործառույթը: Ապացուցված է, որ տետրահիդրոբիոպտերին (BH4) կոենզիմի շրջափակումը կարող է վնասել T բջիջների բազմացումը, իսկ օրգանիզմում BH4-ի ավելացումը կարող է ուժեղացնել CD4 և CD8-ի միջնորդությամբ հակաուռուցքային իմունային պատասխանը: Բացի այդ, կինուրենինի իմունոսուպրեսիվ ազդեցությունը կարող է վերականգնվել BH4-ի ընդունմամբ (5): Իզոցիտրատ դեհիդրոգենազի (IDH) մուտանտ գլիոբլաստոմայի դեպքում էնանտիոմետաբոլիկ (R)-2-հիդրօքսիգլյուտարատի (R-2-HG) սեկրեցիան կանխում է T բջիջների ակտիվացումը, բազմացումը և ցիտոլիզի ակտիվությունը (6): Վերջերս ցույց է տրվել, որ գլիկոլիզի ենթամթերք հանդիսացող մեթիլգլիօքսալը արտադրվում է միելոիդ ծագման ճնշող բջիջների կողմից, և մեթիլգլիօքսալի T բջիջների փոխանցումը կարող է կասեցնել էֆեկտոր T բջիջների գործառույթը: Բուժման ընթացքում մեթիլգլիօքսալի չեզոքացումը կարող է հաղթահարել միելոիդից ստացված ճնշող բջիջների (MDSC) ակտիվությունը և սիներգիստորեն ուժեղացնել անցակետային բլոկադայի թերապիան մկների մոդելներում (7): Այս ուսումնասիրությունները միասին ընդգծում են TME-ից ստացված մետաբոլիտների հիմնական դերը T բջիջների ֆունկցիայի և ակտիվության կարգավորման գործում:
T բջիջների դիսֆունկցիան լայնորեն նկարագրվել է ձվարանների քաղցկեղի դեպքում (8): Սա մասամբ պայմանավորված է հիպօքսիային և ուռուցքի աննորմալ անոթային կառուցվածքին բնորոշ նյութափոխանակության առանձնահատկություններով (9), ինչը հանգեցնում է գլյուկոզի և տրիպտոֆանի փոխակերպմանը այնպիսի ենթամթերքների, ինչպիսիք են կաթնաթթուն և կինուրենինը: Արտաբջջային լակտատի ավելցուկը նվազեցնում է ինտերֆերոն-γ-ի (IFN-γ) արտադրությունը և խթանում է միելոսուպրեսիվ ենթախմբերի դիֆերենցիացիան (10, 11): Տրիպտոֆանի սպառումը ուղղակիորեն կանխում է T բջիջների բազմացումը և արգելակում T բջիջների ընկալիչների ազդանշանային ուղին (12-14): Այս դիտարկումներից անկախ, իմունային նյութափոխանակության շուրջ մեծ աշխատանք է կատարվել in vitro T բջիջների կուլտուրայում՝ օգտագործելով օպտիմիզացված միջավայրեր, կամ սահմանափակվել է in vivo հոմոլոգ մկան մոդելներով, որոնցից ոչ մեկը լիովին չի արտացոլում մարդու քաղցկեղի տարասեռությունը և ֆիզիոլոգիական մակրո և միկրո միջավայրը:
Ձվարանների քաղցկեղի տարածված առանձնահատկությունը որովայնամզի տարածումն ու ասցիտի ի հայտ գալն է: Ասցիտի մեջ բջջային հեղուկի կուտակումը կապված է հիվանդության առաջադեմ փուլի և վատ կանխատեսման հետ (15): Ըստ հաղորդագրությունների, այս եզակի խցիկը հիպօքսիկ է, ունի անոթային էնդոթելային աճի գործոնի (VEGF) և ինդոլամին 2,3-դիօքսիգենազի (IDO) բարձր մակարդակներ և ներթափանցված է T կարգավորող բջիջներով և միելոիդ արգելակող բջիջներով (15-18): Ասցիտի նյութափոխանակության միջավայրը կարող է տարբեր լինել ուռուցքի միջավայրից, ուստի որովայնամզի տարածքում T բջիջների վերածրագրավորումը պարզ չէ: Բացի այդ, ուռուցքի միջավայրում առկա ասցիտի և մետաբոլիտների միջև հիմնական տարբերությունները և տարասեռությունը կարող են խոչընդոտել իմունային բջիջների ներթափանցմանը և դրանց գործառույթին ուռուցքների վրա, և անհրաժեշտ են հետագա հետազոտություններ:
Այս խնդիրները լուծելու համար մենք մշակեցինք զգայուն բջիջների բաժանման և հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (LC-MS/MS) մեթոդ՝ տարբեր բջիջների տեսակներ (ներառյալ CD4 + և CD8 + T բջիջները), ինչպես նաև ուռուցքների ներսում և դրանց միջև ուսումնասիրելու համար։ Դրա մետաբոլիտները տարածվում են նույն ասցիտի և ուռուցքային միջավայրի բջիջների վրա, որը գտնվում է հիվանդի մոտ։ Մենք այս մեթոդը օգտագործում ենք բարձրաչափ հոսքային ցիտոմետրիայի և միաբջիջ RNA հաջորդականության (scRNA-seq) հետ համատեղ՝ այս հիմնական պոպուլյացիաների նյութափոխանակության վիճակի բարձր ճշգրտությամբ պատկերացում կազմելու համար։ Այս մեթոդը բացահայտեց 1-մեթիլինոտինամիդի (MNA) մակարդակի զգալի աճ ուռուցքային T բջիջներում, և in vitro փորձարկումները ցույց տվեցին, որ MNA-ի իմունոմոդուլյատոր ազդեցությունը T բջիջների ֆունկցիայի վրա նախկինում անհայտ էր։ Ընդհանուր առմամբ, այս մեթոդը բացահայտում է ուռուցքների և իմունային բջիջների միջև փոխադարձ նյութափոխանակության փոխազդեցությունները և եզակի պատկերացում է տալիս իմունային կարգավորման մետաբոլիտների մասին, որոնք կարող են օգտակար լինել T բջիջների վրա հիմնված ձվարանների քաղցկեղի իմունաթերապիայի բուժման հնարավորությունների համար։
Մենք օգտագործել ենք բարձրաչափ հոսքային ցիտոմետրիա՝ միաժամանակ քանակականացնելու գլյուկոզի կլանումը [2-(N-(7-նիտրոֆենիլ-2-օքսա-1,3-դիազա-4-իլ)ամինո)-2-դեօքսիգլյուկոզ (2-NBDG) և միտոքոնդրիալ ակտիվությունը [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20], որոնք կողք կողքի բնորոշ մարկերներ են, որոնք տարբերակում են իմունային և ուռուցքային բջիջների պոպուլյացիաները (աղյուսակ S2 և նկար S1A): Այս վերլուծությունը ցույց է տվել, որ T բջիջների համեմատ, ասցիտը և ուռուցքային բջիջները ունեն գլյուկոզի կլանման ավելի բարձր մակարդակ, բայց ունեն միտոքոնդրիալ ակտիվության ավելի փոքր տարբերություններ: Ուռուցքային բջիջների կողմից գլյուկոզի միջին կլանումը [CD45-EpCAM (EpCAM)+]-ը երեքից չորս անգամ ավելի է, քան T բջիջներինը, իսկ CD4 + T բջիջների կողմից գլյուկոզի միջին կլանումը 1.2 անգամ ավելի է, քան CD8 + T բջիջներինը, ինչը ցույց է տալիս, որ ուռուցք ներթափանցող լիմֆոցիտները (TIL) ունեն տարբեր նյութափոխանակության պահանջներ նույնիսկ նույն TME-ում (Նկար 1A): Ի տարբերություն դրա, ուռուցքային բջիջներում միտոքոնդրիալ ակտիվությունը նման է CD4 + T բջիջների ակտիվությանը, և երկու բջջային տեսակների միտոքոնդրիալ ակտիվությունն ավելի բարձր է, քան CD8 + T բջիջներինը (Նկար 1Բ): Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները ցույց են տալիս նյութափոխանակության մակարդակը: Ուռուցքային բջիջների նյութափոխանակության ակտիվությունն ավելի բարձր է, քան CD4 + T բջիջներինը, և CD4 + T բջիջների նյութափոխանակության ակտիվությունն ավելի բարձր է, քան CD8 + T բջիջներինը: Բջջային տեսակների միջև այս ազդեցություններին չնայած, CD4 + և CD8 + T բջիջների նյութափոխանակության վիճակի կամ դրանց հարաբերական համամասնությունների միջև որևէ կայուն տարբերություն չկա ասցիտի և ուռուցքների դեպքում (Նկար 1Գ): Ի տարբերություն դրա, CD45 բջջային ֆրակցիայում ուռուցքում EpCAM+ բջիջների համամասնությունն աճել է ասցիտի համեմատ (Նկար 1Դ): Մենք նաև նկատել ենք EpCAM+ և EpCAM- բջջային բաղադրիչների միջև նյութափոխանակության հստակ տարբերություն: EpCAM+ (ուռուցքային) բջիջներն ունեն ավելի բարձր գլյուկոզի կլանում և միտոքոնդրիալ ակտիվություն, քան EpCAM- բջիջները, ինչը շատ ավելի բարձր է, քան ֆիբրոբլաստների նյութափոխանակության ակտիվությունը ուռուցքային բջիջներում TME-ում (Նկար 1, Ե և Զ):
(A և B) Գլյուկոզի կլանման միջին ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը (MFI) (2-NBDG) (A) և CD4 + T բջիջների միտոքոնդրիալ ակտիվությունը (MitoTracker մուգ կարմիր) (B) Ներկայացուցչական գրաֆիկներ (ձախ) և աղյուսակային տվյալներ (աջ), CD8 + T բջիջներ և EpCAM + CD45-ուռուցքային բջիջներ ասցիտից և ուռուցքից։ (C) CD4 + և CD8 + բջիջների (CD3 + T բջիջների) հարաբերակցությունը ասցիտում և ուռուցքում։ (D) EpCAM + ուռուցքային բջիջների համամասնությունը ասցիտում և ուռուցքում (CD45−)։ (E և F) EpCAM + CD45-ուռուցքային և EpCAM-CD45-մատրիցային գլյուկոզի կլանումը (2-NBDG) (E) և միտոքոնդրիալ ակտիվությունը (MitoTracker մուգ կարմիր) (F) Ներկայացուցչական գրաֆիկներ (ձախ) և աղյուսակային տվյալներ (աջ) Ասցիտներ և ուռուցքային բջիջներ։ (G) CD25, CD137 և PD1 արտահայտման ներկայացուցչական գրաֆիկներ հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով։ (H և I) CD25, CD137 և PD1 էքսպրեսիան CD4 + T բջիջների (H) և CD8 + T բջիջների (I) վրա: (J և K) Նաիվ, կենտրոնական հիշողության (Tcm), էֆեկտոր (Teff) և էֆեկտոր հիշողության (Tem) ֆենոտիպեր՝ հիմնված CCR7 և CD45RO էքսպրեսիայի վրա: CD4 + T բջիջների (J) և CD8 + T բջիջների (K) ներկայացուցչական պատկերներ (ձախ) և աղյուսակային տվյալներ (աջ) ասցիտների և ուռուցքների դեպքում: P արժեքները որոշվել են զույգ t-թեստով (*P<0.05, **P<0.01 և ***P<0.001): Գիծը ներկայացնում է համապատասխանեցված հիվանդներին (n = 6): FMO, ֆլուորեսցենցիա - մեկ; MFI, ֆլուորեսցենցիայի միջնարժեքի ինտենսիվություն:
Հետագա վերլուծությունը բացահայտեց T բջիջների ֆենոտիպային բարձր լուծվածության կարգավիճակի միջև այլ նշանակալի տարբերություններ: Ուռուցքներում ակտիվացված (Նկար 1, G-ից I) և էֆեկտորային հիշողությունը (Նկար 1, J և K) շատ ավելի հաճախ են հանդիպում, քան ասցիտները (CD3 + T բջիջների համամասնությունը): Նմանապես, ֆենոտիպի վերլուծությունը ակտիվացման մարկերների (CD25 և CD137) և սպառման մարկերների [ծրագրավորված բջջային մահվան սպիտակուց 1 (PD1)] արտահայտությամբ ցույց տվեց, որ չնայած այս պոպուլյացիաների նյութափոխանակության բնութագրերը տարբեր են (Նկար S1, B-ից E), սակայն ոչ մի նշանակալի նյութափոխանակության տարբերություն չի նկատվել հետևողականորեն միամիտ, էֆեկտորային կամ հիշողության ենթաբազմությունների միջև (Նկար S1, F-ից I): Այս արդյունքները հաստատվեցին բջջային ֆենոտիպերը ավտոմատ կերպով վերագրելու համար մեքենայական ուսուցման մեթոդների կիրառմամբ (21), ինչը հետագայում բացահայտեց հիվանդի ասցիտում ոսկրածուծի բջիջների մեծ թվի (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) առկայությունը (Նկար S2A): Բոլոր նույնականացված բջջային տեսակների շարքում այս միելոիդ բջջային պոպուլյացիան ցուցաբերել է գլյուկոզի ամենաբարձր կլանումը և միտոքոնդրիալ ակտիվությունը (Նկար S2, B-ից G): Այս արդյունքները ընդգծում են HGSC հիվանդների մոտ ասցիտի և ուռուցքների դեպքում հայտնաբերված բազմաթիվ բջջային տեսակների միջև առկա ուժեղ նյութափոխանակության տարբերությունները:
TIL-ի մետաբոնոմիկ բնութագրերը հասկանալու հիմնական մարտահրավերը ուռուցքներից բավարար մաքրության, որակի և քանակի T բջիջների նմուշներ մեկուսացնելու անհրաժեշտությունն է: Վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ հոսքային ցիտոմետրիայի վրա հիմնված տեսակավորման և հատիկներով հարստացման մեթոդները կարող են հանգեցնել բջջային մետաբոլիտների պրոֆիլների փոփոխությունների (22-24): Այս խնդիրը հաղթահարելու համար մենք օպտիմալացրել ենք հատիկներով հարստացման մեթոդը՝ վիրաբուժական միջամտությամբ հեռացված մարդու ձվարանների քաղցկեղից TIL-ը մեկուսացնելու և մեկուսացնելու համար՝ LC-MS/MS-ով վերլուծությունից առաջ (տե՛ս Նյութեր և մեթոդներ, Նկար 2Ա): Այս արձանագրության մետաբոլիտների փոփոխությունների վրա ընդհանուր ազդեցությունը գնահատելու համար մենք համեմատել ենք առողջ դոնորների կողմից վերը նշված հատիկների բաժանման քայլից հետո ակտիվացված T բջիջների մետաբոլիտների պրոֆիլները այն բջիջների հետ, որոնք հատիկներով չէին բաժանվել, բայց մնացել էին սառույցի վրա: Այս որակի վերահսկման վերլուծությունը ցույց է տվել, որ այս երկու պայմանների միջև կա բարձր կորելյացիա (r = 0.77), և 86 մետաբոլիտների խմբի տեխնիկական կրկնելիությունն ունի բարձր կրկնելիություն (Նկար 2Բ): Հետևաբար, այս մեթոդները կարող են կատարել բջջային տեսակի հարստացման ենթարկվող բջիջների ճշգրիտ մետաբոլիտների վերլուծություն, այդպիսով ապահովելով HGSC-ում որոշակի մետաբոլիտներ նույնականացնելու առաջին բարձր թույլտվությամբ հարթակը, այդպիսով հնարավորություն տալով մարդկանց ավելի խորը հասկանալ բջջային առանձնահատկությունները՝ սեռական նյութափոխանակության ծրագիրը։
(Ա) Մագնիսական գնդիկներով հարստացման սխեմատիկ դիագրամ։ LC-MS/MS-ով վերլուծությունից առաջ բջիջները կենթարկվեն մագնիսական գնդիկներով հարստացման երեք հաջորդական փուլերի կամ կմնան սառույցի վրա։ (Բ) Հարստացման տեսակի ազդեցությունը մետաբոլիտների առատության վրա։ Յուրաքանչյուր հարստացման տեսակի ± SE-ի համար երեք չափումների միջինը։ Մոխրագույն գիծը ներկայացնում է 1:1 հարաբերակցություն։ Առանցքի պիտակում նշված կրկնվող չափումների ներդասային կորելյացիան (ICC): NAD, նիկոտինամիդ ադենին դինուկլեոտիդ։ (Գ) Հիվանդի մետաբոլիտների վերլուծության աշխատանքային հոսքի սխեմատիկ դիագրամ։ Ասցիտները կամ ուռուցքները հավաքվում են հիվանդներից և կրիոպահպանվում։ Յուրաքանչյուր նմուշի մի փոքր մասը վերլուծվել է հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով, մինչդեռ մնացած նմուշները ենթարկվել են CD4+, CD8+ և CD45- բջիջների հարստացման երեք փուլի։ Այս բջջային ֆրակցիաները վերլուծվել են LC-MS/MS-ի միջոցով։ (Դ) Ստանդարտացված մետաբոլիտների առատության ջերմային քարտեզ։ Դենդրոգրամը ներկայացնում է նմուշների միջև էվկլիդեսյան հեռավորությունների Ուորդի կլաստերացումը։ (Ե) Նմուշի մետաբոլիտային քարտեզի գլխավոր բաղադրիչների վերլուծություն (ԳԿՎ), որը ցույց է տալիս յուրաքանչյուր նմուշի երեք կրկնօրինակ, նույն հիվանդից վերցված նմուշները միացված են գծով։ (Զ) Նմուշի մետաբոլիտային պրոֆիլի ԳԿՎ-ն՝ պայմանավորված հիվանդի հետ (այսինքն՝ մասնակի ավելորդության միջոցով). նմուշի տեսակը սահմանափակված է ուռուցիկ կորպուսով։ PC1, գլխավոր բաղադրիչ 1; PC2, գլխավոր բաղադրիչ 2։
Հաջորդը, մենք կիրառեցինք այս հարստացման մեթոդը՝ վերլուծելու 99 մետաբոլիտ CD4 +, CD8 + և CD45-բջջային ֆրակցիաներում վեց HGSC հիվանդների առաջնային ասցիտներում և ուռուցքներում (Նկար 2C, Նկար S3A և Աղյուսակ S3 և S4): Հետաքրքրության առարկա հանդիսացող պոպուլյացիան կազմում է կենդանի բջիջների սկզբնական մեծ նմուշի 2%-ից մինչև 70%-ը, և բջիջների համամասնությունը մեծապես տարբերվում է հիվանդների միջև: Գնդիկները բաժանելուց հետո, հետաքրքրության առարկա հանդիսացող հարստացված ֆրակցիան (CD4+, CD8+ կամ CD45-) միջինում կազմում է նմուշում առկա բոլոր կենդանի բջիջների ավելի քան 85%-ը: Այս հարստացման մեթոդը թույլ է տալիս մեզ վերլուծել բջջային պոպուլյացիաները մարդու ուռուցքային հյուսվածքի նյութափոխանակությունից, ինչը անհնար է անել մեծ նմուշներից: Այս արձանագրությունն օգտագործելով՝ մենք որոշեցինք, որ l-կինուրենինը և ադենոզինը, այս երկու լավ բնութագրված իմունոսուպրեսիվ մետաբոլիտները, բարձրացված էին ուռուցքային T բջիջներում կամ ուռուցքային բջիջներում (Նկար S3, B և C): Հետևաբար, այս արդյունքները ցույց են տալիս մեր բջիջների բաժանման և զանգվածային սպեկտրոմետրիայի տեխնոլոգիայի ճշգրտությունը և ունակությունը՝ հիվանդի հյուսվածքներում կենսաբանորեն կարևոր մետաբոլիտներ գտնելու համար:
Մեր վերլուծությունը նաև բացահայտեց բջիջների տեսակների ուժեղ նյութափոխանակության տարանջատում հիվանդների ներսում և միջև (Նկար 2D և Նկար S4A): Մասնավորապես, համեմատած այլ հիվանդների հետ, հիվանդ 70-ը ցուցաբերեց տարբեր նյութափոխանակության բնութագրեր (Նկար 2E և Նկար S4B), ինչը ցույց է տալիս, որ հիվանդների միջև կարող է լինել նյութափոխանակության զգալի տարասեռություն: Հարկ է նշել, որ համեմատած այլ հիվանդների հետ (1.2-ից 2 լիտր; աղյուսակ S1), հիվանդ 70-ի մոտ հավաքված ասցիտի ընդհանուր քանակը (80 մլ) ավելի փոքր էր: Հիմնական բաղադրիչների վերլուծության ընթացքում (օրինակ՝ մասնակի ավելորդության վերլուծության միջոցով) հիվանդների միջև տարասեռության վերահսկողությունը ցույց է տալիս բջիջների տեսակների միջև հաստատուն փոփոխություններ, և բջջային տեսակները և/կամ միկրոմիջավայրը հստակորեն ագրեգացված են մետաբոլիտների պրոֆիլի համաձայն (Նկար 2F): Առանձին մետաբոլիտների վերլուծությունը ընդգծեց այս ազդեցությունները և բացահայտեց բջջային տեսակների և միկրոմիջավայրի միջև նշանակալի տարբերություններ: Հարկ է նշել, որ դիտարկվող ամենաէքստրեմալ տարբերությունը MNA-ն է, որը սովորաբար հարուստ է CD45- բջիջներով և CD4+ և CD8+ բջիջներով, որոնք ներթափանցում են ուռուցքը (Նկար 3A): CD4 + բջիջների համար այս ազդեցությունն առավել ակնհայտ է, և CD8 + բջիջների MNA-ն նույնպես, կարծես, ուժեղ ազդեցության է ենթարկվում շրջակա միջավայրից: Այնուամենայնիվ, սա կարևոր չէ, քանի որ վեց հիվանդներից միայն երեքը կարող են գնահատվել ուռուցքի CD8+ միավորների համար: MNA-ից բացի, ասցիտի և ուռուցքների տարբեր տեսակի բջիջներում, TIL-ում վատ բնութագրված այլ մետաբոլիտներ նույնպես տարբեր կերպով հարուստ են (Նկարներ S3 և S4): Հետևաբար, այս տվյալները բացահայտում են իմունոմոդուլյատոր մետաբոլիտների խոստումնալից հավաքածու հետագա հետազոտությունների համար:
(Ա) MNA-ի նորմալացված պարունակությունը CD4+, CD8+ և CD45- բջիջներում ասցիտից և ուռուցքից: Տողային գրաֆիկը ցույց է տալիս միջնարժեքը (գծի), միջքառորդային տիրույթը (շրջանակային հանգույց) և տվյալների տիրույթը, մինչև միջքառորդային տիրույթի (շրջանակային բեղ) 1.5 անգամը: Ինչպես նկարագրված է «Հիվանդի նյութեր և մեթոդներ» բաժնում, օգտագործեք հիվանդի լիմմայի արժեքը՝ P արժեքը որոշելու համար (*P<0.05 և **P<0.01): (Բ) MNA նյութափոխանակության սխեմատիկ դիագրամ (60): Մետաբոլիտներ՝ S-ադենոզիլ-1-մեթիոնին; SAH, S-ադենոզին-1-հոմոցիստեին; NA, նիկոտինամիդ; MNA, 1-մեթիլինոկոտինամիդ; 2-PY, 1-մեթիլ-2-պիրիդոն-5-կարբօքսամիդ; 4-PY, 1-մեթիլ-4-պիրիդոն-5-կարբօքսամիդ; NR, նիկոտինամիդ ռիբոզ; NMN, նիկոտինամիդ մոնոնուկլեոտիդ: Ֆերմենտներ (կանաչ). NNMT, նիկոտինամիդ N-մեթիլտրանսֆերազ; SIRT, սիրտուիններ; NAMPT, նիկոտինամիդ ֆոսֆորիբոզիլ տրանսֆերազ; AOX1, ալդեհիդ օքսիդազ 1; NRK, նիկոտինամիդ ռիբոզիդ կինազ; NMNAT, նիկոտինամիդ մոնո նուկլեոտիդ ադենիլատ տրանսֆերազ; Pnp1, պուրին նուկլեոզիդ ֆոսֆորիլազ: (C) ասցիտի scRNA-seq-ի t-SNE-ն (մոխրագույն) և ուռուցքի (կարմիր; n = 3 հիվանդ): (D) NNMT-ի արտահայտությունը տարբեր բջջային պոպուլյացիաներում, որոնք նույնականացվել են scRNA-seq-ի միջոցով: (E) NNMT-ի և AOX1-ի արտահայտությունը SK-OV-3-ում, մարդու սաղմնային երիկամում (HEK) 293T, T բջիջներում և MNA-ով մշակված T բջիջներում: Ցուցադրված է ծալված արտահայտությունը SK-OV-3-ի համեմատ: Ցուցադրված է SEM-ով արտահայտման պատկերը (n = 6 առողջ դոնոր): 35-ից բարձր Ct արժեքները համարվում են անհայտնաբերելի (UD): (F) SLC22A1-ի և SLC22A2-ի էքսպրեսիան SK-OV-3, HEK293T, T բջիջներում և 8մՄ MNA-ով մշակված T բջիջներում: Ծալված էքսպրեսիան SK-OV-3-ի համեմատ: Ցուցադրված է SEM-ով էքսպրեսիայի պատկերը (n = 6 առողջ դոնոր): 35-ից բարձր Ct արժեքները համարվում են անհայտնաբերելի (UD): (G) Բջջային MNA պարունակությունը ակտիվացված առողջ դոնոր T բջիջներում MNA-ով 72 ժամ ինկուբացիայից հետո: Ցուցադրված է SEM-ով էքսպրեսիայի պատկերը (n = 4 առողջ դոնոր):
ՄՆԱ-ն արտադրվում է մեթիլ խումբը S-ադենոզիլ-1-մեթիոնինից (SAM) նիկոտինամիդի (NA) փոխանցելով նիկոտինամիդ N-մեթիլտրանսֆերազի միջոցով (NNMT; Նկար 3B): NNMT-ն գերարտահայտվում է մարդու քաղցկեղի տարբեր տեսակների դեպքում և կապված է բազմացման, ինվազիայի և մետաստազի հետ (25-27): TME-ում T բջիջներում MNA-ի աղբյուրն ավելի լավ հասկանալու համար մենք օգտագործել ենք scRNA-seq՝ երեք HGSC հիվանդների ասցիտներում և ուռուցքներում NNMT-ի արտահայտությունը բնութագրելու համար բջջային տեսակների միջև (աղյուսակ S5): Մոտավորապես 6500 բջիջների վերլուծությունը ցույց է տվել, որ ասցիտներում և ուռուցքային միջավայրերում NNMT արտահայտությունը սահմանափակվում էր ենթադրյալ ֆիբրոբլաստների և ուռուցքային բջիջների պոպուլյացիաներով (Նկար 3, C և D): Հարկ է նշել, որ PTPRC (CD45 +) արտահայտող որևէ պոպուլյացիայի մեջ NNMT-ի ակնհայտ արտահայտություն չկա (Նկար 3D և Նկար S5A), ինչը ցույց է տալիս, որ մետաբոլիտային սպեկտրում հայտնաբերված MNA-ն ներմուծվել է T բջիջների մեջ: Ալդեհիդ օքսիդազ 1-ի (AOX1) արտահայտությունը MNA-ն վերածում է 1-մեթիլ-2-պիրիդոն-5-կարբօքսամիդի (2-PYR) կամ 1-մեթիլ-4-պիրիդոն-5-կարբօքսամիդի (4-PYR) (Նկար 3B) նույնպես սահմանափակվում է COL1A1 արտահայտող ֆիբրոբլաստների պոպուլյացիայով (Նկար S5A), որոնք միասին ցույց են տալիս, որ T բջիջները զուրկ են ավանդական MNA նյութափոխանակության ունակությունից: Այս MNA-ի հետ կապված գեների արտահայտման օրինաչափությունը ստուգվել է HGSC հիվանդների ասցիտներից վերցված երկրորդ անկախ բջջային տվյալների հավաքածուի միջոցով (Նկար S5B; n = 6) (16): Բացի այդ, MNA-ով բուժված առողջ դոնոր T բջիջների քանակական պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (qPCR) վերլուծությունը ցույց է տվել, որ համեմատած վերահսկիչ SK-OV-3 ձվարանների ուռուցքային բջիջների հետ, NNMT-ն կամ AOX1-ը գրեթե չեն արտահայտվել (Նկար 3E): Այս անսպասելի արդյունքները ցույց են տալիս, որ MNA-ն կարող է արտազատվել ֆիբրոբլաստներից կամ ուռուցքներից դեպի հարակից T բջիջներ TME-ում:
Չնայած թեկնածուների թվում են լուծելի կրող 22 (SLC22) ընտանիքի (SLC22A1, SLC22A2 և SLC22A3) կողմից կոդավորված օրգանական կատիոն փոխադրիչների 1-ից 3 ընտանիքը (OCT1, OCT2 և OCT3), MNA-ի պոտենցիալ փոխադրիչները դեռևս անորոշ են (28): Առողջ դոնոր T բջիջներից ստացված mRNA-ի QPCR-ը ցույց տվեց SLC22A1-ի ցածր արտահայտման մակարդակներ, բայց SLC22A2-ի անհայտանիշ մակարդակներ, ինչը հաստատեց, որ այն նախկինում հաղորդվել էր գրականության մեջ (Նկար 3F) (29): Ի տարբերություն դրա, SK-OV-3 ձվարանների ուռուցքային բջջային գիծը արտահայտում էր երկու փոխադրիչների բարձր մակարդակներ (Նկար 3F):
Օտար MNA-ն կլանելու T բջիջների ունակության հնարավորությունը ստուգելու համար առողջ դոնոր T բջիջները կուլտիվացվել են 72 ժամ MNA-ի տարբեր կոնցենտրացիաների առկայության դեպքում: Էկզոգեն MNA-ի բացակայության դեպքում MNA-ի բջջային պարունակությունը հնարավոր չէ հայտնաբերել (Նկար 3G): Այնուամենայնիվ, էկզոգեն MNA-ով մշակված ակտիվացված T բջիջները ցույց են տվել բջիջներում MNA պարունակության դեղաչափից կախված աճ՝ մինչև 6 մՄ MNA (Նկար 3G): Այս արդյունքը ցույց է տալիս, որ չնայած փոխադրիչի արտահայտման ցածր մակարդակին և ներբջջային MNA նյութափոխանակության համար պատասխանատու հիմնական ֆերմենտի բացակայությանը, TIL-ը դեռևս կարող է կլանել MNA-ն:
Հիվանդների T բջիջներում մետաբոլիտների սպեկտրը և in vitro MNA կլանման փորձերը մեծացնում են այն հավանականությունը, որ քաղցկեղի հետ կապված ֆիբրոբլաստները (CAF) արտազատում են MNA, և ուռուցքային բջիջները կարող են կարգավորել TIL-ի ֆենոտիպը և գործառույթը: MNA-ի ազդեցությունը T բջիջների վրա որոշելու համար առողջ դոնոր T բջիջները ակտիվացվել են in vitro MNA-ի առկայության կամ բացակայության դեպքում, և գնահատվել են դրանց պրոլիֆերացիան և ցիտոկինների արտադրությունը: MNA-ի ամենաբարձր դեղաչափով ավելացումից 7 օր անց պոպուլյացիայի կրկնապատկման թիվը չափավոր նվազել է, մինչդեռ ակտիվությունը պահպանվել է բոլոր դեղաչափերի դեպքում (Նկար 4Ա): Բացի այդ, էկզոգեն MNA-ի բուժումը հանգեցրել է ուռուցքի նեկրոզի գործոն-α (TNFα; Նկար 4Բ) արտահայտող CD4 + և CD8 + T բջիջների համամասնության աճի: Ի տարբերություն դրա, IFN-γ-ի ներբջջային արտադրությունը զգալիորեն նվազել է CD4 + T բջիջներում, բայց ոչ CD8 + T բջիջներում, և ինտերլեյկին 2-ում (IL-2; Նկար 4, C և D) նշանակալի փոփոխություն չի եղել: Հետևաբար, այս MNA-ով մշակված T բջջային կուլտուրաների վերին շերտերի ֆերմենտային կապված իմունոսորբենտային փորձարկումը (ELISA) ցույց տվեց TNFα-ի զգալի աճ, IFN-γ-ի նվազում և IL-2-ի որևէ փոփոխություն (Նկար 4, E-ից G): IFN-γ-ի նվազումը ցույց է տալիս, որ MNA-ն կարող է դեր ունենալ T բջիջների հակաուռուցքային ակտիվության զսպման գործում: MNA-ի ազդեցությունը T բջիջների միջնորդված ցիտոտոքսիկության վրա մոդելավորելու համար, առողջ դոնորի ծայրամասային արյան մոնոնուկլեար բջիջների (PBMC) կողմից արտադրվում են քիմերային հակածնային ընկալիչ T (FRα-CAR-T) բջիջներ, որոնք թիրախավորում են ֆոլաթթվի ընկալիչ α-ն և կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուցով (GFP) -CAR-T) կարգավորվող CAR-T (GFP) բջիջները: CAR-T բջիջները կուլտիվացվել են 24 ժամ MNA-ի առկայությամբ, ապա համատեղ կուլտիվացվել են մարդու SK-OV-3 ձվարանների ուռուցքային բջիջների հետ, որոնք արտահայտում են ֆոլաթթվի ընկալիչ α-ն՝ էֆեկտոր-թիրախ հարաբերակցությամբ 10:1: MNA-ով բուժումը հանգեցրել է FRα-CAR-T բջիջների սպանողական ակտիվության զգալի նվազմանը, որը նման էր ադենոզինով բուժված FRα-CAR-T բջիջների ակտիվությանը (Նկար 4H):
(A) Կենսունակ բջիջների ընդհանուր քանակը և պոպուլյացիայի կրկնապատկումը (PD) անմիջապես կուլտուրայից 7-րդ օրը: Սյունակային գրաֆիկը ներկայացնում է վեց առողջ դոնորների միջին + ՍՄՄ: Ներկայացնում է առնվազն n = 3 անկախ փորձերի տվյալները: (B-ից D) CD3/CD28-ը և IL-2-ը օգտագործվել են T բջիջները իրենց համապատասխան MNA կոնցենտրացիաներով ակտիվացնելու համար 7 օրվա ընթացքում: Վերլուծությունից առաջ բջիջները խթանվել են PMA/իոնոմիցինով GolgiStop-ով 4 ժամ: TNFα (B) արտահայտությունը T բջիջներում: TNFα արտահայտության օրինակելի պատկեր (ձախ) և աղյուսակային տվյալներ (աջ) կենդանի բջիջներում: IFN-γ (C) և IL-2 (D) արտահայտությունը T բջիջներում: Ցիտոկինների արտահայտությունը չափվել է հոսքային ցիտոմետրիայով: Սյունակային գրաֆիկը ներկայացնում է միջինը (n = 6 առողջ դոնոր) + ՍՄՄ: P արժեքը որոշելու համար օգտագործեք դիսպերսիայի միակողմանի վերլուծություն և կրկնվող չափումներ (*P<0.05 և **P<0.01): Ներկայացնում է առնվազն n = 3 անկախ փորձերի տվյալները: (E-ից G) CD3/CD28-ը և IL-2-ը օգտագործվել են T բջիջները իրենց համապատասխան MNA կոնցենտրացիաներով 7 օրվա ընթացքում ակտիվացնելու համար: Միջավայրը հավաքվել է PMA/իոնոմիցինի խթանումից 4 ժամ առաջ և հետո: TNFα-ի (E), IFN-γ-ի (F) և IL-2-ի (G) կոնցենտրացիաները չափվել են ELISA-ի միջոցով: Սյունակային գրաֆիկը ներկայացնում է միջինը (n = 5 առողջ դոնոր) + SEM: P արժեքը որոշվել է դիսպերսիայի միակողմանի վերլուծության և կրկնվող չափումների միջոցով (*P<0.05): Կետավոր գիծը ցույց է տալիս հայտնաբերման հայտնաբերման սահմանը: (H) Բջջային լիզիսի փորձարկում: FRα-CAR-T կամ GFP-CAR-T բջիջները կարգավորվել են ադենոզինով (250μM) կամ MNA-ով (10 mM) 24 ժամվա ընթացքում, կամ թողնվել են չմշակված (Ctrl): Չափվել է SK-OV-3 բջիջների սպանության տոկոսը: P արժեքը որոշվել է Welch t թեստով (*P<0.5 և **P<0.01):
MNA-կախյալ TNFα էքսպրեսիայի կարգավորման մեխանիստական ​​​​հասկացողություն ստանալու համար գնահատվել են MNA-ով մշակված T բջիջների TNFα mRNA-ի փոփոխությունները (Նկար 5Ա): MNA-ով մշակված առողջ դոնոր T բջիջները ցույց են տվել TNFα տրանսկրիպցիայի մակարդակի կրկնակի աճ, ինչը ցույց է տալիս, որ MNA-ն կախված է TNFα տրանսկրիպցիոն կարգավորումից: Այս հնարավոր կարգավորիչ մեխանիզմն ուսումնասիրելու համար գնահատվել են TNFα-ն կարգավորող երկու հայտնի տրանսկրիպցիոն գործոններ՝ ակտիվացված T բջջային միջուկային գործոնը (NFAT) և հատուկ սպիտակուց 1-ը (Sp1), ի պատասխան MNA-ի պրոմոտորի պրոմոտորի հետ կապվելու (30): TNFα պրոմոտորը պարունակում է 6 նույնականացված NFAT կապող տեղամասեր և 2 Sp1 կապող տեղամասեր, որոնք համընկնում են մեկ տեղում [-55 հիմքային զույգ (bp) 5'գլխիկից] (30): Քրոմատինի իմունոպրեցիպիտացիան (ChIP) ցույց է տվել, որ MNA-ով մշակվելիս Sp1-ի կապումը TNFα պրոմոտորի հետ եռապատկվել է: NFAT-ի ներառումը նույնպես մեծացել և կարևորության է հասել (Նկար 5Բ): Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ MNA-ն կարգավորում է TNFα-ի արտահայտությունը Sp1 տրանսկրիպցիայի միջոցով, և ավելի փոքր չափով՝ NFAT-ի արտահայտությունը։
(Ա) MNA-ով մշակված T բջիջների համեմատ, TNFα արտահայտման կրկնապատկման փոփոխությունը MNA-ով մշակված T բջիջներում: Ցուցադրված է SEM-ով արտահայտման պատկերը (n = 5 առողջ դոնոր): Ներկայացնում է առնվազն n = 3 անկախ փորձերի տվյալները: (Բ) NFAT-ից և Sp1-ից հետո 8 մՄ MNA-ով կամ առանց դրա մշակված T բջիջների TNFα պրոմոտորը համակցվել է (Ctrl) և PMA/իոնոմիցինով խթանման հետ 4 ժամ: Իմունոգլոբուլին G-ն (IgG) և H3-ը օգտագործվել են համապատասխանաբար որպես բացասական և դրական վերահսկիչներ իմունոպրեցիպիտացիայի համար: ChIP-ի քանակական որոշումը ցույց է տվել, որ Sp1-ի և NFAT-ի կապումը TNFα պրոմոտորին MNA-ով մշակված բջիջներում մի քանի անգամ աճել է վերահսկիչի համեմատ: Ներկայացնում է առնվազն n = 3 անկախ փորձերի տվյալները: P արժեքը որոշվել է բազմաթիվ t-թեստերով (*** P <0.01): (Գ) HGSC-ի ասցիտի համեմատ, T բջիջները (ոչ ցիտոտոքսիկ) ցույց են տվել TNF-ի աճող արտահայտում ուռուցքում: Գույները ներկայացնում են տարբեր հիվանդների: Ցուցադրված բջիջները պատահականորեն ընտրվել են մինչև 300 և տատանվել են՝ գերբեռնվածությունը սահմանափակելու համար (** Padj = 0.0076): (D) Ձվարանների քաղցկեղի համար MNA-ի առաջարկվող մոդել: MNA-ն արտադրվում է ուռուցքային բջիջներում և ֆիբրոբլաստներում TME-ում և կլանվում է T բջիջների կողմից: MNA-ն մեծացնում է Sp1-ի կապումը TNFα պրոմոտորի հետ, ինչը հանգեցնում է TNFα տրանսկրիպցիայի և TNFα ցիտոկինների արտադրության աճի: MNA-ն նաև առաջացնում է IFN-γ-ի նվազում: T բջիջների ֆունկցիայի արգելակումը հանգեցնում է սպանողականության նվազմանը և ուռուցքի աճի արագացմանը:
Ըստ հաղորդագրությունների, TNFα-ն ունի առջևի և հետևի կախված հակաուռուցքային և հակաուռուցքային ազդեցություններ, սակայն այն հայտնի դեր ունի ձվարանների քաղցկեղի աճի և մետաստազավորման խթանման գործում (31-33): Ըստ հաղորդագրությունների, ձվարանների քաղցկեղով հիվանդների մոտ ասցիտներում և ուռուցքային հյուսվածքներում TNFα-ի կոնցենտրացիան ավելի բարձր է, քան բարորակ հյուսվածքներում (34-36): Մեխանիզմի առումով TNFα-ն կարող է կարգավորել սպիտակ արյան բջիջների ակտիվացումը, գործառույթը և բազմացումը, ինչպես նաև փոխել քաղցկեղի բջիջների ֆենոտիպը (37, 38): Այս արդյունքներին համապատասխան, գեների դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծությունը ցույց տվեց, որ TNF-ը զգալիորեն բարձրացել է ուռուցքային հյուսվածքների T բջիջներում՝ ասցիտի համեմատ (Նկար 5C): TNF արտահայտման աճը նկատելի էր միայն ոչ ցիտոտոքսիկ ֆենոտիպ ունեցող T բջիջների պոպուլյացիաներում (Նկար S5A): Ամփոփելով՝ այս տվյալները հաստատում են այն տեսակետը, որ MNA-ն ունի կրկնակի իմունոսուպրեսիվ և ուռուցքը խթանող ազդեցություն HGSC-ում:
Հոսքային ցիտոմետրիայի վրա հիմնված ֆլուորեսցենտային պիտակավորումը դարձել է TIL նյութափոխանակության ուսումնասիրության հիմնական մեթոդը: Այս ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ծայրամասային արյան լիմֆոցիտների կամ երկրորդային լիմֆոիդ օրգանների T բջիջների համեմատ, մկների և մարդկանց TIL-ները ունեն գլյուկոզի կլանման ավելի բարձր հակում (4, 39) և միտոքոնդրիալ ֆունկցիայի աստիճանական կորուստ (19, 40): Չնայած այս ուսումնասիրության մեջ մենք դիտարկել ենք նմանատիպ արդյունքներ, հիմնական զարգացումը նույն հեռացված ուռուցքային հյուսվածքից ուռուցքային բջիջների և TIL-ի նյութափոխանակության համեմատությունն է: Նախորդ որոշ զեկույցների համաձայն, ասցիտներից և ուռուցքներից ստացված ուռուցքային (CD45-EpCAM +) բջիջներն ունեն գլյուկոզի ավելի բարձր կլանում, քան CD8 + և CD4 + T բջիջները, ինչը հաստատում է, որ ուռուցքային բջիջների կողմից գլյուկոզի բարձր կլանումը կարելի է համեմատել T բջիջների հետ: T բջիջների մրցակցության հայեցակարգը: TME: Այնուամենայնիվ, ուռուցքային բջիջների միտոքոնդրիալ ակտիվությունն ավելի բարձր է, քան CD8 + T բջիջներինը, բայց միտոքոնդրիալ ակտիվությունը նման է CD4 + T բջիջներին: Այս արդյունքները հաստատում են այն ի հայտ եկող թեման, որ օքսիդատիվ նյութափոխանակությունը կարևոր է ուռուցքային բջիջների համար (41, 42): Նրանք նաև ենթադրում են, որ CD8 + T բջիջները կարող են ավելի զգայուն լինել օքսիդատիվ դիսֆունկցիայի նկատմամբ, քան CD4 + T բջիջները, կամ որ CD4 + T բջիջները կարող են օգտագործել ածխածնի այլ աղբյուրներ՝ բացի գլյուկոզից՝ միտոքոնդրիալ ակտիվությունը պահպանելու համար (43, 44): Պետք է նշել, որ մենք ասցիտի դեպքում չենք նկատել գլյուկոզի կլանման կամ միտոքոնդրիալ ակտիվության տարբերություն CD4 + T էֆեկտորների, T էֆեկտոր հիշողության և T կենտրոնական հիշողության բջիջների միջև: Նմանապես, ուռուցքներում CD8 + T բջիջների դիֆերենցիացիայի վիճակը որևէ կապ չունի գլյուկոզի կլանման փոփոխությունների հետ, ինչը ընդգծում է in vitro կուլտուրայի T բջիջների և in vivo մարդու TIL բջիջների միջև նշանակալի տարբերությունը (22): Այս դիտարկումները հաստատվել են նաև անաչառ ավտոմատ բջջային պոպուլյացիայի բաշխմամբ, որը հետագայում ցույց է տվել, որ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + բջիջները, որոնք ունեն ավելի բարձր գլյուկոզի կլանում և միտոքոնդրիալ ակտիվություն, քան ուռուցքային բջիջները, տարածված են, բայց ունեն նյութափոխանակության ակտիվ բջջային պոպուլյացիա: Այս պոպուլյացիան կարող է ներկայացնել scRNA-seq վերլուծության մեջ նույնականացված միելոիդ ճնշող բջիջների կամ պլազմացիտոիդ դենդրիտային բջիջների ենթադրյալ ենթապոպուլյացիան: Չնայած այս երկուսն էլ հայտնաբերվել են մարդու ձվարանների ուռուցքներում [45], դրանք դեռևս կարիք ունեն հետագա աշխատանքի՝ այս միելոիդ ենթաբնակչության նկարագրման համար։
Չնայած հոսքային ցիտոմետրիայի վրա հիմնված մեթոդները կարող են պարզաբանել բջջային տեսակների միջև գլյուկոզի և օքսիդատիվ նյութափոխանակության ընդհանուր տարբերությունները, TME-ում միտոքոնդրիալ նյութափոխանակության համար գլյուկոզի կամ այլ ածխածնի աղբյուրների կողմից արտադրված ճշգրիտ մետաբոլիտները դեռևս որոշված ​​չեն: Մետաբոլիտների առկայությունը կամ բացակայությունը տվյալ TIL ենթաբազմությանը վերագրելը պահանջում է բջջային պոպուլյացիայի մաքրում կտրված հյուսվածքից: Հետևաբար, մեր բջիջների հարստացման մեթոդը, զուգորդված զանգվածային սպեկտրոմետրիայի հետ, կարող է պատկերացում տալ այն մետաբոլիտների մասին, որոնք տարբերակված հարստացված են T բջիջներով և ուռուցքային բջիջների պոպուլյացիաներով համապատասխան հիվանդների նմուշներում: Չնայած այս մեթոդն առավելություններ ունի ֆլուորեսցենտային ակտիվացված բջիջների տեսակավորման համեմատ, որոշակի մետաբոլիտների գրադարաններ կարող են տուժել իրենց ներքին կայունության և/կամ արագ շրջանառության արագության պատճառով (22): Այնուամենայնիվ, մեր մեթոդը կարողացավ նույնականացնել երկու ճանաչված իմունոսուպրեսիվ մետաբոլիտներ՝ ադենոզինը և կինուրենինը, քանի որ դրանք մեծապես տարբերվում են նմուշների տեսակների միջև:
Մեր ուռուցքների և TIL ենթատիպերի մետաբոնոմիկ վերլուծությունը ավելի շատ պատկերացում է տալիս ձվարանների TME-ում մետաբոլիտների դերի մասին: Նախ, հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով մենք որոշեցինք, որ ուռուցքների և CD4 + T բջիջների միջև միտոքոնդրիալ ակտիվության տարբերություն չկա: Այնուամենայնիվ, LC-MS/MS վերլուծությունը բացահայտեց այս պոպուլյացիաների շրջանում մետաբոլիտների առատության զգալի փոփոխություններ, ինչը ցույց է տալիս, որ TIL նյութափոխանակության և դրա ընդհանուր նյութափոխանակության ակտիվության վերաբերյալ եզրակացությունները պահանջում են ուշադիր մեկնաբանություն: Երկրորդ, MNA-ն այն մետաբոլիտն է, որն ամենամեծ տարբերությունն ունի CD45 բջիջների և T բջիջների միջև ասցիտի դեպքում, այլ ոչ թե ուռուցքների դեպքում: Հետևաբար, կոմպարտմենտալիզացիան և ուռուցքի տեղակայումը կարող են տարբեր ազդեցություն ունենալ TIL նյութափոխանակության վրա, ինչը ընդգծում է տվյալ միկրոմիջավայրում հնարավոր տարասեռությունը: Երրորդ, MNA արտադրող NNMT ֆերմենտի արտահայտությունը հիմնականում սահմանափակվում է CAF-ով, որը ավելի փոքր չափով ուռուցքային բջիջներ են, բայց ուռուցքից ստացված T բջիջներում դիտվում են MNA-ի հայտնաբերելի մակարդակներ: NNMT-ի գերարտահայտումը ձվարանների CAF-ում ունի հայտնի քաղցկեղածին ազդեցություն, մասամբ՝ CAF նյութափոխանակության, ուռուցքի ներխուժման և մետաստազավորման խթանման շնորհիվ (27): Չնայած TIL-ի ընդհանուր մակարդակը միջին է, NNMT-ի արտահայտությունը CAF-ում սերտորեն կապված է քաղցկեղի գենոմի ատլասի (TCGA) մեզենքիմալ ենթատիպի հետ, որը կապված է վատ կանխատեսման հետ (27, 46, 47): Վերջապես, MNA-ի քայքայման համար պատասխանատու AOX1 ֆերմենտի արտահայտությունը նույնպես սահմանափակվում է CAF պոպուլյացիայով, ինչը ցույց է տալիս, որ T բջիջները զուրկ են MNA-ն նյութափոխանակելու ունակությունից: Այս արդյունքները հաստատում են այն գաղափարը, որ չնայած այս արդյունքը ստուգելու համար անհրաժեշտ է հետագա աշխատանք, T բջիջներում MNA-ի բարձր մակարդակը կարող է ցույց տալ իմունոսուպրեսիվ CAF միկրոմիջավայրի առկայությունը:
Հաշվի առնելով MNA փոխադրիչների ցածր արտահայտման մակարդակը և MNA նյութափոխանակությանը մասնակցող հիմնական սպիտակուցների աննկատելի մակարդակները, T բջիջներում MNA-ի առկայությունը անսպասելի է: Ո՛չ NNMT-ն, ո՛չ AOX1-ը հնարավոր չէ հայտնաբերել scRNA-seq վերլուծության և երկու անկախ կոհորտների թիրախային qPCR-ի միջոցով: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ MNA-ն չի սինթեզվում T բջիջների կողմից, այլ կլանվում է շրջակա TME-ից: In vitro փորձերը ցույց են տալիս, որ T բջիջները հակված են կուտակել էկզոգեն MNA:
Մեր in vitro ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ էկզոգեն MNA-ն ինդուկցում է TNFα-ի արտահայտությունը T բջիջներում և ուժեղացնում է Sp1-ի կապումը TNFα պրոմոտորի հետ: Չնայած TNFα-ն ունի և՛ հակաուռուցքային, և՛ հակաուռուցքային գործառույթներ, ձվարանների քաղցկեղի դեպքում TNFα-ն կարող է խթանել ձվարանների քաղցկեղի աճը (31-33): TNFα-ի չեզոքացումը ձվարանների ուռուցքային բջիջների կուլտուրայում կամ TNFα ազդանշանի վերացումը մկների մոդելներում կարող է բարելավել TNFα-միջնորդավորված բորբոքային ցիտոկինների արտադրությունը և կանխել ուռուցքի աճը (32, 35): Հետևաբար, այս դեպքում, TME-ից ստացված MNA-ն կարող է գործել որպես պրոբորբոքային մետաբոլիտ՝ TNFα-կախյալ մեխանիզմի միջոցով՝ աուտոկրին օղակի միջոցով, դրանով իսկ խթանելով ձվարանների քաղցկեղի առաջացումը և տարածումը (31): Այս հնարավորության հիման վրա ուսումնասիրվում է TNFα-ի շրջափակումը որպես ձվարանների քաղցկեղի պոտենցիալ թերապևտիկ միջոց (37, 48, 49): Բացի այդ, MNA-ն խաթարում է CAR-T բջիջների ցիտոտոքսիկությունը ձվարանների ուռուցքային բջիջների նկատմամբ՝ ապահովելով MNA-միջնորդավորված իմունային ճնշման լրացուցիչ ապացույցներ: Ամփոփելով՝ այս արդյունքները ենթադրում են մի մոդել, որտեղ ուռուցքները և CAF բջիջները MNA են արտազատում արտաբջջային TME: (i) TNF-ով առաջացած ձվարանների քաղցկեղի աճի խթանման և (ii) MNA-ով առաջացած T բջիջների ցիտոտոքսիկ ակտիվության արգելակման միջոցով սա կարող է ունենալ կրկնակի ուռուցքային ազդեցություն (Նկար 5D):
Ամփոփելով՝ արագ բջիջների հարստացման, մեկ բջջային հաջորդականության և նյութափոխանակության պրոֆիլավորման համադրություն կիրառելով՝ այս ուսումնասիրությունը բացահայտեց HGSC հիվանդների մոտ ուռուցքների և ասցիտային բջիջների միջև հսկայական իմունոմետաբոլոմիկ տարբերությունները: Այս համապարփակ վերլուծությունը ցույց տվեց, որ T բջիջների միջև կան տարբերություններ գլյուկոզի կլանման և միտոքոնդրիալ ակտիվության մեջ, և MNA-ն նույնականացրեց որպես ոչ բջջային ինքնավար իմունային կարգավորող մետաբոլիտ: Այս տվյալները ազդեցություն ունեն այն բանի վրա, թե ինչպես է TME-ն ազդում T բջիջների նյութափոխանակության վրա մարդու քաղցկեղի դեպքում: Չնայած T բջիջների և քաղցկեղի բջիջների միջև սննդանյութերի համար ուղղակի մրցակցություն է գրանցվել, մետաբոլիտները կարող են նաև գործել որպես անուղղակի կարգավորիչներ՝ խթանելով ուռուցքի առաջընթացը և հնարավոր է՝ ճնշելով էնդոգեն իմունային պատասխանները: Այս կարգավորող մետաբոլիտների ֆունկցիոնալ դերի հետագա նկարագրությունը կարող է բացել այլընտրանքային ռազմավարություններ՝ հակաուռուցքային իմունային պատասխանը ուժեղացնելու համար:
Հիվանդների նմուշները և կլինիկական տվյալները ստացվել են Կանադական հյուսվածքների պահոցների ցանցի կողմից հավաստագրված Բրիտանական Կոլումբիայի քաղցկեղի ուռուցքի հյուսվածքների պահոցից: Բրիտանական Կոլումբիայի քաղցկեղի հետազոտությունների էթիկայի կոմիտեի և Բրիտանական Կոլումբիայի համալսարանի կողմից հաստատված արձանագրության համաձայն (H07-00463), բոլոր հիվանդների նմուշները և կլինիկական տվյալները ստացել են տեղեկացված գրավոր համաձայնություն կամ պաշտոնապես հրաժարվել են իրենց համաձայնությունից: Նմուշները պահվում են հավաստագրված BioBank-ում (BRC-00290): Հիվանդների մանրամասն բնութագրերը ներկայացված են S1 և S5 աղյուսակներում: Կրիոպահպանման համար օգտագործվում է վիրակապ՝ հիվանդի ուռուցքի նմուշը մեխանիկորեն քայքայելու, այնուհետև այն 100 միկրոնանոց ֆիլտրի միջով անցկացնելու համար՝ մեկ բջջային սուսպենզիա ստանալու համար: Հիվանդի ասցիտը ցենտրիֆուգացվել է 1500 պտ/րոպե արագությամբ 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում՝ բջիջները գնդիկավորելու և վերին շերտը հեռացնելու համար: Ուռուցքից և ասցիտից ստացված բջիջները կրիոպահպանվել են 50% ջերմային ինակտիվացված մարդու AB շիճուկում (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) և 10% դիմեթիլսուլֆօքսիդում: Այս պահպանված միաբջիջ սուսպենզիաները հալեցվել են և օգտագործվել են ստորև նկարագրված մետաբոլոմիկայի և մետաբոլիտների որոշման համար:
Ամբողջական միջավայրը բաղկացած է 0.22 մկմ ֆիլտրացված 50:50 լրացված RPMI 1640-ից՝ AimV: RPMI 1640 + 2.05 մՄ l-գլուտամին (Thermo Fisher Scientific), լրացված 10% ջերմային ինակտիվացված մարդու AB շիճուկով (Sigma-Aldrich), 12.5 մՄ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 մՄ l-գլուտամին (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x պենիցիլին ստրեպտոմիցինի (PenStrep) լուծույթով (Thermo Fisher Scientific) և 50 μՄԲ-մերկապտոէթանոլով: AimV-ն (Invitrogen) լրացված է 20 մՄ Hepes (Thermo Fisher Scientific) և 2 մՄ l-գլուտամինով (Thermo Fisher Scientific): Հոսքային ցիտոմետրի ներկման բուֆերը բաղկացած էր 0.22 մկմ ֆիլտրացված ֆոսֆատային բուֆերային աղային լուծույթից (PBS; Invitrogen), լրացված 3% ջերմային ինակտիվացված մարդու AB շիճուկով (Sigma): Բջիջների հարստացման բուֆերը բաղկացած է 0.22 մկմ ֆիլտրացված PBS-ից և լրացված է 0.5% ջերմային ինակտիվացված մարդու AB շիճուկով (Sigma-Aldrich):
37°C ջերմաստիճանի լիարժեք միջավայրում բջիջները ներկվել են 10 նՄ MT DR և 100 մկՄ 2-NBDG լուծույթներով 30 րոպե։ Այնուհետև, բջիջները ներկվել են կենսունակության eF506 ներկանյութով 4°C ջերմաստիճանում 15 րոպե։ Վերստին սուսպենզիա են մտցրել բջիջները FC Block (eBioscience) և Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) լուծույթներում, նոսրացնել հոսքային ցիտոմետրի ներկման բուֆերում (արտադրողի հրահանգների համաձայն) և ինկուբացել 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում։ Հոսքային ցիտոմետրի ներկման բուֆերում բջիջները ներկել հակամարմինների հավաքածուով (աղյուսակ S2) 4°C ջերմաստիճանում 20 րոպե։ Վերլուծությունից առաջ բջիջները վերստին սուսպենզիա են մտցրել հոսքային ցիտոմետրի ներկման բուֆերում (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R կոնֆիգուրացիա)։ Բջիջների քանակի տվյալները վերլուծելու համար օգտագործել SpectroFlo և FlowJo V10, իսկ տվյալները ստեղծելու համար՝ GraphPad Prism 8։ 2-NBDG-ի և MT DR-ի միջնարժեքային ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը (MFI) լոգարիթմական նորմալացվել է, ապա զույգային t թեստը օգտագործվել է վիճակագրական վերլուծության համար՝ համապատասխանեցված հիվանդներին հաշվի առնելու համար: Վերլուծությունից հանեք 40-ից պակաս իրադարձություն ունեցող բոլոր պոպուլյացիաները. վիճակագրական վերլուծություն և տվյալների վիզուալիզացիա կատարելուց առաջ մուտքագրեք MFI 1 արժեք ցանկացած բացասական արժեքի համար:
Վերոնշյալ գործընթացային վահանակի ձեռքով դարպասավորման ռազմավարությունը լրացնելու համար մենք օգտագործեցինք ձևի սահմանափակման ծառի (FAUST) (21) ամբողջական ծանոթագրությունը՝ FlowJo-ում մեռած բջիջները հեռացնելուց հետո բջիջները պոպուլյացիային ավտոմատ կերպով վերագրելու համար: Մենք ձեռքով կառավարում ենք արդյունքը՝ միավորելու համար այն պոպուլյացիաները, որոնք, կարծես, սխալ են բաշխված (PD1+-ը PD1-ուռուցքային բջիջների հետ համատեղելով) և պահպանված պոպուլյացիաները: Յուրաքանչյուր նմուշ պարունակում է միջինում ավելի քան 2% բջիջ՝ ընդհանուր առմամբ 11 պոպուլյացիա:
Ֆիկոլի գրադիենտային խտության ցենտրիֆուգացումը կիրառվել է PBMC-ն լեյկոցիտների բաժանման արգասիքներից առանձնացնելու համար (STEMCELL Technologies): CD8 + T բջիջները մեկուսացվել են PBMC-ից՝ օգտագործելով CD8 MicroBeads (Miltenyi) և ընդլայնվել են ամբողջական միջավայրում՝ օգտագործելով TransAct (Miltenyi) 2 շաբաթ՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների: Բջիջները թողնվել են 5 օր IL-7 (10 նգ/մլ; PeproTech) պարունակող ամբողջական միջավայրում, ապա վերստին խթանվել են TransAct-ով: 7-րդ օրը, ըստ արտադրողի հրահանգների, մարդու CD45 MicroBeads (Miltenyi) օգտագործվել են բջիջները հարստացնելու համար երեք հաջորդական փուլերով: Բջիջները ալիքվոտավորվել են հոսքային ցիտոմետրիայի վերլուծության համար (ինչպես նկարագրված է վերևում), և մեկ միլիոն բջիջ ալիքվոտավորվել է երեք անգամ LC-MS/MS վերլուծության համար: Նմուշները մշակվել են LC-MS/MS-ով՝ ինչպես նկարագրված է ստորև: Մենք գնահատել ենք բացակայող մետաբոլիտի արժեքը 1000 իոնային թվով: Յուրաքանչյուր նմուշ նորմալացվում է ընդհանուր իոնային թվով (TIC), լոգարիթմիկ փոխակերպվում և ավտոմատ կերպով նորմալացվում MetaboAnalystR-ում՝ վերլուծությունից առաջ։
Յուրաքանչյուր հիվանդի մեկ բջջային սուսպենզիան հալեցվել և զտվել է 40 մկմ ֆիլտրի միջով ամբողջական միջավայրի մեջ (ինչպես նկարագրված է վերևում): Արտադրողի արձանագրության համաձայն, CD8+, CD4+ և CD45- բջիջների համար նմուշները հարստացնելու համար (սառույցի վրա) օգտագործվել են դրական ընտրության երեք հաջորդական փուլեր՝ մագնիսական գնդիկների բաժանմամբ՝ օգտագործելով MicroBeads (Miltenyi): Ամփոփելով՝ բջիջները վերստին սուսպենդացվում են բջիջների հարստացման բուֆերում (ինչպես նկարագրված է վերևում) և հաշվվում: Բջիջները ինկուբացվել են մարդու CD8 գնդիկների, մարդու CD4 գնդիկների կամ մարդու CD45 գնդիկների (Miltenyi) հետ 4°C ջերմաստիճանում 15 րոպե, ապա լվացվել են բջիջների հարստացման բուֆերով: Նմուշն անցկացրել է LS սյունակով (Miltenyi), և դրական և բացասական ֆրակցիաները հավաքվել են: Տևողությունը կրճատելու և բջիջների վերականգնման փուլը մեծացնելու համար CD8 ֆրակցիան այնուհետև օգտագործվում է CD4+ հարստացման երկրորդ փուլի համար, իսկ CD4 ֆրակցիան՝ հետագա CD45 հարստացման համար: Լուծույթը պահել սառույցի վրա բաժանման ողջ գործընթացի ընթացքում:
Մետաբոլիտների վերլուծության համար նմուշներ պատրաստելու համար բջիջները մեկ անգամ լվացվել են սառցե աղի լուծույթով, և յուրաքանչյուր նմուշին ավելացվել է 1 մլ 80% մեթանոլ, այնուհետև մրրկային խառնվել և արագ սառեցվել հեղուկ ազոտի մեջ: Նմուշները ենթարկվել են սառեցման-հալեցման երեք ցիկլի և ցենտրիֆուգացվել են 14,000 պտ/րոպե արագությամբ 15 րոպե 4°C ջերմաստիճանում: Մետաբոլիտները պարունակող վերին շերտը գոլորշիացվել է մինչև չորանալը: Մետաբոլիտները վերլուծվել են 50 մկլ 0.03% մրջնաթթվի մեջ, մրրկային խառնվելուց հետո, ապա ցենտրիֆուգացվել են մնացորդները հեռացնելու համար:
Մետաբոլիտները արդյունահանեք վերևում նկարագրվածի պես: Վերին շերտը տեղափոխեք բարձր արդյունավետությամբ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի շշի մեջ՝ մետաբոլոմիկայի հետազոտության համար: Օգտագործեք պատահական մշակման արձանագրություն՝ յուրաքանչյուր նմուշը նմանատիպ թվով բջիջներով մշակելու համար՝ խմբաքանակի էֆեկտները կանխելու համար: Մենք իրականացրել ենք գլոբալ մետաբոլիտների որակական գնահատում, որը նախկինում հրապարակվել էր AB SCIEX QTRAP 5500 եռակի քառաբևեռ զանգվածային սպեկտրոմետրում (50): Քրոմատոգրաֆիկ վերլուծությունը և գագաթնակետային մակերեսի ինտեգրումը կատարվել են MultiQuant տարբերակ 2.1 ծրագրաշարի միջոցով (Applied Biosystems SCIEX):
Բացակայող մետաբոլիտի արժեքը գնահատելու համար օգտագործվել է 1000 իոնների հաշվարկ, իսկ յուրաքանչյուր նմուշի TIC-ը օգտագործվել է յուրաքանչյուր հայտնաբերված մետաբոլիտի նորմալացված գագաթնակետային մակերեսը հաշվարկելու համար՝ նմուշի մշակումից գործիքային վերլուծության կողմից ներմուծված փոփոխությունները շտկելու համար: TIC-ի նորմալացումից հետո, լոգարիթմական փոխակերպման և նորմայի գծի ավտոմատ մասշտաբավորման համար օգտագործվել է MetaboAnalystR(51) (լռելյայն պարամետր): Մենք օգտագործել ենք PCA-ն vegan R փաթեթով՝ նմուշների տեսակների միջև մետաբոլոմների տարբերությունների հետազոտական ​​վերլուծություն կատարելու համար, և մասնակի ավելորդության վերլուծություն՝ հիվանդներին վերլուծելու համար: Մենք օգտագործել ենք Ward մեթոդը՝ ջերմային քարտեզի դենդրոգրամ կառուցելու համար՝ նմուշների միջև Էվկլիդեսյան հեռավորությունը խմբավորելու համար: Մենք օգտագործել ենք լիմմա (52) ստանդարտացված մետաբոլիտի առատության վերաբերյալ՝ ամբողջ բջջային տեսակի և միկրոմիջավայրի տարբեր առատ մետաբոլիտները նույնականացնելու համար: Բացատրությունը պարզեցնելու համար մենք օգտագործում ենք խմբի միջին պարամետրը՝ մոդելը նշելու համար, և միկրոմիջավայրում բջջային տեսակները դիտարկել որպես յուրաքանչյուր խումբ (n = 6 խումբ): Նշանակալիության թեստի համար մենք յուրաքանչյուր մետաբոլիտի համար կատարեցինք երեք կրկնվող չափումներ։ Կեղծ կրկնօրինակումից խուսափելու համար լիմմայի նախագծում հիվանդը ներառվեց որպես խոչընդոտ։ Տարբեր հիվանդների միջև մետաբոլիտների տարբերությունները ստուգելու համար մենք լիմմայի մոդելը ճշգրտեցինք՝ հիվանդներին ներառելով ֆիքսված ձևով։ Մենք ներկայացնում ենք բջջային տեսակի և միկրոմիջավայրի միջև նախապես սահմանված հակադրության նշանակալիությունը՝ Padj <0.05 (Բենջամինի-Հոխբերգի ուղղում):
Miltenyi Dead Cell Removal Kit-ի միջոցով ինտենսիվ հարստացումից հետո (>80% կենսունակություն), 10x 5′գենային արտահայտման արձանագրության միջոցով իրականացվել է մեկ բջջային տրանսկրիպտոմի հաջորդականացում ամբողջ կենդանի սառեցված ասցիտի և ուռուցքի նմուշների վրա: Վերլուծվել են համապատասխան ուռուցքներով և ասցիտներով հինգ դեպք, չնայած մեկ ուռուցքի նմուշից ստացված ցածր կենսունակությունը խոչընդոտել է դրա ներառումը: Հիվանդների բազմակի ընտրություն կատարելու համար մենք միավորել ենք յուրաքանչյուր հիվանդի նմուշները 10x քրոմի կարգավորիչի գծերում և առանձին-առանձին վերլուծել ասցիտը և ուռուցքի տեղակայումները: Հաջորդականացումից հետո [Illumina HiSeq 4000 28×98 զույգ ծայր (PE), Քվեբեկի գենոմ; Միջինում ուռուցքի և ասցիտի համար բջջի վրա համապատասխանաբար 73,488 և 41,378 ընթերցումներով]], մենք օգտագործել ենք CellSNP և Vireo (53) (հիմնված CellSNP-ի վրա որպես GRCh38-ի կողմից տրամադրված ընդհանուր մարդկային SNP-ին (VCF) նշանակվում է դոնորի ինքնություն: Մենք օգտագործում ենք SNPRelate-ը՝ հիվանդի գենոտիպի կարգավիճակի (IBS) ամենամոտ ինքնությունը (IBS) որոշելու համար, բացառությամբ չնշանակված բջիջների և դուպլեքսների նման նույնականացված բջիջների և ասցիտի ու ուռուցքի նմուշների միջև համապատասխան դոնորների (54): Այս առաջադրանքի հիման վրա մենք պահպանել ենք ուռուցքում և ասցիտում առատ բջջային ներկայացուցչությամբ երեք դեպք՝ հոսանքն ի վար վերլուծության համար: BioConductor-ի ցրման (55) և սկրանի (56) փաթեթավորման մեջ զանգվածային ֆիլտրացիայի քայլ կատարելուց հետո, վերլուծության համար ստացվել է 6975 բջիջ (համապատասխանաբար՝ 2792 և 4183 բջիջ ուռուցքից և ասցիտից): Մենք օգտագործել ենք igraph-ի (57) Լուվենի կլաստերացումը՝ կիսվող մոտակա հարևանների ցանցի (SNN) համար, որը հիմնված է կլաստերային բջիջներից Ժակարդի հեռավորության վրա՝ արտահայտությամբ: Կլաստերները ձեռքով մեկնաբանվել են ենթադրյալ բջջային տեսակների հիման վրա՝ հիմնվելով մարկերային գեների արտահայտման վրա, և վիզուալիզացվել են t-SNE-ով: Ցիտոտոքսիկ T բջիջները սահմանվում են CD8A և GZMA-ի արտահայտմամբ, բացառությամբ ցածր ռիբոսոմային սպիտակուցի արտահայտմամբ ենթակլաստերների: Մենք օգտվել ենք Իզարի և այլոց (16) հրապարակված տվյալներից, ներառյալ նրանց t-SNE ներդրված տվյալները, որոնք կարող են վերահսկել իմունային բջիջների մարկերների և NNMT արտահայտման միջև արտահայտման համընկնումը:
ՊԲՄԿ-ները լեյկոցիտների բաժանման արգասիքներից (STEMCELL Technologies) առանձնացվել են Ֆիկոլի գրադիենտային խտության ցենտրիֆուգացման միջոցով: CD3 + բջիջները մեկուսացվել են ՊԲՄԿ-ից՝ օգտագործելով CD3 գնդիկներ (Miltenyi): MNA-ի առկայության կամ բացակայության դեպքում CD3+ բջիջները ակտիվացվել են թիթեղին կապված CD3-ով (5 մկգ/մլ), լուծելի CD28-ով (3 մկգ/մլ) և IL-2-ով (300 U/մլ; Proleukin): Ընդարձակման վերջին օրը կենսունակությունը (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) և պրոլիֆերացիան (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) գնահատվել են հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով: Գնահատեք էֆեկտորի ֆունկցիան՝ խթանելով բջիջները PMA-ով (20 նգ/մլ) և իոնոմիցինով (1 մկգ/մլ) GolgiStop-ով 4 ժամ, և վերահսկեք CD8-PerCP-ն (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700-ը (RPA-T4), BioLegend) և TNFα-ֆլուորեսցեինի իզոտիոցիանատը (FITC) (MAb11, BD): Խթանեք qPCR և ChIP բջիջները PMA-ով (20 նգ/մլ) և իոնոմիցինով (1 մկգ/մլ) 4 ժամ: ELISA վերին շերտը հավաքվել է PMA-ով (20 նգ/մլ) և իոնոմիցինով (1 մկգ/մլ) 4 ժամ խթանելուց առաջ և հետո:
Հետևեք արտադրողի արձանագրությանը՝ RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN)-ի միջոցով ՌՆԹ-ն մեկուսացնելու համար: Օգտագործեք QIAshredder (QIAGEN)՝ նմուշը հոմոգենացնելու համար: Օգտագործեք բարձր հզորության ՌՆԹ-ից cDNA հավաքածու (Thermo Fisher Scientific)՝ լրացուցիչ ԴՆԹ (cDNA) սինթեզելու համար: Օգտագործեք TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific)՝ գեների արտահայտությունը քանակականացնելու համար (ըստ արտադրողի արձանագրության) հետևյալ զոնդերով՝ Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [գլիցերալդեհիդ-3-ֆոսֆատ ջրածնի վրա (GAPDH)] և Hs01010726_m1 (SLC22A2): Նմուշները հետազոտվել են StepOnePlus իրական ժամանակի ՊՇՌ համակարգում (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp արագ օպտիկական 96-փոսիկանոց ռեակցիոն թիթեղի (Applied Biosystems) վրա՝ MicroAmp օպտիկական թաղանթով: 35-ից բարձր ցանկացած Ct արժեք համարվում է հայտնաբերման շեմից բարձր և նշվում է որպես չհայտնաբերվող:
Կատարեք ChIP-ը նախկինում նկարագրվածի պես (58): Ամփոփելով՝ բջիջները մշակվել են ֆորմալդեհիդով (վերջնական կոնցենտրացիա՝ 1.42%) և ինկուբացվել են սենյակային ջերմաստիճանում 10 րոպե: Օգտագործեք լրացուցիչ այտուցվածության բուֆեր (25 մՄ Hepes, 1.5 մՄ MgCl2, 10 մՄ KCl և 0.1% NP-40) սառույցի վրա 10 րոպե, այնուհետև վերստին լուծեք իմունոպրեցիպիտացիայի բուֆերում, ինչպես նկարագրված է (58): Այնուհետև նմուշը ուլտրաձայնային մշակման է ենթարկվել հետևյալ ցիկլերով՝ 10 ցիկլ (20 1 վայրկյան տևողությամբ իմունային իմպուլս) և 40 վայրկյան տևողությամբ ստատիկ ժամանակ: Ինկուբացեք ChIP-որակի իմունոգլոբուլին G (Cell Signaling Technology; 1μl), հիստոն H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) և SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) հակամարմինները նմուշի հետ 4°CC ջերմաստիճանում, թափահարեք ամբողջ գիշեր: Ինկուբացրեք սպիտակուց A գնդիկները (Thermo Fisher Scientific) նմուշի հետ 4°C ջերմաստիճանում՝ մեղմ թափահարելով 1 ժամ, այնուհետև օգտագործեք chelex գնդիկներ (Bio-Rad)՝ ԴՆԹ-ն հարստացնելու համար, և օգտագործեք պրոտեինազ K (Thermo Fisher)՝ սպիտակուցի մարսման համար: TNFα պրոմոտորը հայտնաբերվել է ՊՇՌ-ի միջոցով՝ forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ընդհակառակը, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp արտադրանք): Պատկերները ստացվել են Image Lab-ի (Bio-Rad) կողմից և քանակականացվել են ImageJ ծրագրաշարի միջոցով:
Բջջային կուլտուրայի վերին շերտը հավաքվել է վերը նկարագրված եղանակով: Որոշումը կատարվել է մարդու TNFα ELISA հավաքածուի (Invitrogen), մարդու IL-2 ELISA հավաքածուի (Invitrogen) և մարդու IFN-γ ELISA հավաքածուի (Abcam) արտադրողի ընթացակարգերի համաձայն: Արտադրողի արձանագրության համաձայն, վերին շերտը նոսրացվել է 1:100 հարաբերակցությամբ՝ TNFα-ն և IL-2-ը հայտնաբերելու համար, և 1:3 հարաբերակցությամբ՝ IFN-γ-ն հայտնաբերելու համար: 450 նմ-ում կլանումը չափելու համար օգտագործեք EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer):
ՊԲՄԿ-ները լեյկոցիտների բաժանման արգասիքներից (STEMCELL Technologies) առանձնացվել են Ficoll գրադիենտային խտության ցենտրիֆուգացման միջոցով: CD3 + բջիջները մեկուսացվել են ՊԲՄԿ-ից՝ օգտագործելով CD3 գնդիկներ (Miltenyi): MNA-ի առկայության կամ բացակայության դեպքում CD3+ բջիջները ակտիվացվել են թիթեղին կապված CD3-ով (5 մկգ/մլ), լուծվող CD28-ով (3 մկգ/մլ) և IL-2-ով (300 U/մլ; Proleukin) 3 օրվա ընթացքում: 3 օր անց բջիջները հավաքվել և լվացվել են 0.9% աղաջրով, իսկ գնդիկը արագ սառեցվել է: Բջիջների հաշվարկը կատարվել է հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R կոնֆիգուրացիա)՝ օգտագործելով 123count eBeads:
Քաղվածքի մետաբոլիտները վերցվում են վերը նկարագրվածի պես։ Չորացրած քաղվածքը վերականգնվել է 4000 բջջային համարժեք/μկլ կոնցենտրացիայով։ Վերլուծել նմուշը հակադարձ փուլային քրոմատոգրաֆիայի միջոցով (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) և CORTECS T3 սյունակի միջոցով (2.1×150 մմ, մասնիկի չափսը՝ 1.6 մկմ, ծակոտիների չափսը՝ 120 Å; #186008500, Waters)։ Բևեռային զանգվածային սպեկտրոմետր (6470, Agilent), որտեղ էլեկտրոցողման իոնացումը գործում է դրական ռեժիմով։ Շարժական փուլ A-ն 0.1% մրջնաթթու է (H2O-ում), շարժական փուլ B-ն՝ 90% ացետոնիտրիլ, 0.1% մրջնաթթու։ LC գրադիենտը 0-ից 2 րոպե է 100% A-ի համար, 2-ից 7.1 րոպե՝ 99% B-ի համար, և 7.1-ից 8 րոպե՝ 99% B-ի համար: Այնուհետև սյունը կրկին հավասարակշռեք շարժուն փուլ A-ի հետ 0.6 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ 3 րոպեի ընթացքում: Հոսքի արագությունը 0.4 մլ/րոպե է, և սյունակի խցիկը տաքացվում է մինչև 50°C: Պահպանման ժամանակը (RT) և փոխակերպումը (RT = 0.882 րոպե, փոխակերպում 1 = 137→94.1, փոխակերպում 2 = 137→92, փոխակերպում 3 = 137→78) որոշելու համար օգտագործեք MNA-ի մաքուր քիմիական ստանդարտը (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) (RT = 0.882 րոպե, փոխակերպում 1 = 137→94.1, փոխակերպում 2 = 137→92, փոխակերպում 3 = 137→78): Երբ բոլոր երեք անցումները տեղի են ունենում ճիշտ պահպանման ժամանակում, անցում 1-ը օգտագործվում է քանակական որոշման համար՝ յուրահատկությունն ապահովելու համար: MNA-ի (Toronto Research Chemical Company) ստանդարտ կորը ստացվել է հիմնական լուծույթի (1 մգ/մլ) վեց հաջորդական նոսրացումներով՝ համապատասխանաբար 0.1, 1.0, 10 և 100 նգ/մլ և 1.0 և 10մկգ/մլ հեղուկ ստանդարտներ ստանալու համար: Հայտնաբերման սահմանը 1 նգ/մլ է, իսկ գծային արձագանքը 10 նգ/մլ-ից մինչև 10մկգ/մլ է: Նմուշի և ստանդարտի երկու միկրոլիտր յուրաքանչյուր ներարկումն օգտագործվում է LC/MS վերլուծության համար, և խառը որակի վերահսկման նմուշը մշակվում է յուրաքանչյուր ութ ներարկումը՝ վերլուծության հարթակի կայունությունն ապահովելու համար: Բոլոր MNA-ով մշակված բջջային նմուշների MNA արձագանքները գտնվել են վերլուծության գծային միջակայքում: Տվյալների վերլուծությունը կատարվել է MassHunter քանակական վերլուծության ծրագրաշարի միջոցով (v9.0, Agilent):
Երկրորդ սերնդի αFR-CAR կոնստրուկտը վերցված է Սոնգից և այլքից (59): Հակիրճ ասած, կոնստրուկտը պարունակում է հետևյալ բովանդակությունը՝ CD8a առաջնորդող հաջորդականություն, մարդու αFR-սպեցիֆիկ միաշղթա փոփոխական բեկոր, CD8a հանգույց և թաղանթային շրջան, CD27 ներբջջային տիրույթ և CD3z ներբջջային տիրույթ: Ամբողջական CAR հաջորդականությունը սինթեզվել է GenScript-ի միջոցով, ապա կլոնավորվել է երկրորդ սերնդի լենտիվիրուսային արտահայտման վեկտորի մեջ՝ GFP արտահայտման կասետի վերևում, որն օգտագործվել է տրանսդուկցիայի արդյունավետությունը գնահատելու համար:
Լենտիվիրուսը ստացվում է HEK293T բջիջների տրանսֆեկցիայի միջոցով [American Type Culture Collection (ATCC)]: Այն աճեցվել է Dulbecco-ի մոդիֆիկացված Eagle միջավայրում, որը պարունակում է 10% պտղի խոշոր եղջերավոր անասունի շիճուկ (FBS) և 1% PenStrep, և օգտագործվել է CAR-GFP վեկտոր, իսկ փաթեթավորման պլազմիդները (psPAX2 և pMD2.G, Addgene)՝ լիպոֆեկցիոն ամին (Sigma-Aldrich): Վիրուս պարունակող վերին շերտը հավաքվել է տրանսֆեկցիայից 48 և 72 ժամ անց, զտվել և խտացվել է ուլտրակենտրոնացման միջոցով: Խտացված վիրուսային վերին շերտը պահել -80°C ջերմաստիճանում մինչև տրանսդուկցիան:
Առողջ դոնորի լեյկոցիտների բաժանման արգասիքներից (STEMCELL Technologies) PBMC-ները առանձնացվում են Ficoll գրադիենտային խտության ցենտրիֆուգացման միջոցով: CD8+ բջիջները PBMC-ից առանձնացնելու համար օգտագործվում են դրական ընտրության CD8 միկրոգլիկները (Miltenyi): T բջիջները խթանվում են TransAct-ով (Miltenyi) և TexMACS միջավայրում [Miltenyi; լրացված 3% ջերմային ինակտիվացված մարդու շիճուկով, 1% PenStrep-ով և IL-2-ով (300 U/մլ)]: Խթանումից քսանչորս ժամ անց T բջիջները տրանսդուկցվում են լենտիվիրուսով (10 մկլ կոնցենտրացված վիրուսային վերին շերտ 106 բջջի համար): Cytek Aurora-ի վրա տրանսդուկցիայից 1-3 օր անց (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+ վրա) գնահատվում է բջիջների GFP արտահայտությունը` ցույց տալու համար առնվազն 30% տրանսդուկցիայի արդյունավետություն:
CAR-T բջիջները 24 ժամ կուլտիվացվել են Immunocult-ում (STEMCELL Technologies; լրացված 1% PenStrep-ով) հետևյալ պայմաններում՝ չմշակված, մշակված 250 μM ադենոզինով կամ 10 mM MNA-ով: Նախնական մշակումից հետո CAR-T բջիջները լվացվել են PBS-ով և խառնվել 20,000 SK-OV-3 բջիջների հետ [ATCC; McCoy 5A միջավայրում (Sigma-Aldrich)՝ լրացված 10% FBS-ով և 1% PenStrep-ով 10°C-ում: 1 էֆեկտոր-նպատակային հարաբերակցությունը եռակի ուժեղացվել է լրացված Immunocult միջավայրում: SK-OV-3 բջիջները և SK-OV-3 բջիջները, որոնք լիզացվել են դիգիտալիս սապոնինով (0.5 մգ/մլ; Sigma-Aldrich), օգտագործվել են համապատասխանաբար որպես բացասական և դրական վերահսկիչներ: 24 ժամ համատեղ մշակումից հետո, վերին շերտը հավաքվել է, և լակտատ դեհիդրոգենազը (LDH) չափվել է արտադրողի հրահանգների համաձայն (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega): LDH վերին շերտը նոսրացվել է LDH բուֆերում 1:50 հարաբերակցությամբ: Սպանման տոկոսը չափվել է հետևյալ բանաձևով՝ սպանման տոկոսը = ուղղման տոկոսը / առավելագույն սպանման մակարդակը x 100%, որտեղ ուղղման տոկոսը = համատեղ մշակում՝ միայն T բջիջներ, իսկ առավելագույն սպանման մակարդակը = դրական վերահսկողություն - բացասական վերահսկողություն:
Ինչպես նկարագրված է տեքստում կամ նյութերում և մեթոդներում, վիճակագրական վերլուծության համար օգտագործեք GraphPad Prism 8, Microsoft Excel կամ R v3.6.0 ծրագրերը: Եթե նույն հիվանդից հավաքվում են մի քանի նմուշներ (օրինակ՝ ասցիտ և ուռուցք), մենք օգտագործում ենք զույգ t թեստ կամ հիվանդին ներառում ենք որպես պատահական էֆեկտ գծային կամ ընդհանրացված մոդելում՝ ըստ անհրաժեշտության: Մետաբոլոմիկ վերլուծության համար կարևորության թեստը կատարվում է եռակի:
Այս հոդվածի լրացուցիչ նյութերի համար այցելեք http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 կայքը։
Սա բաց մատչելիության հոդված է, որը տարածվում է Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ի պայմաններով, որը թույլ է տալիս օգտագործել, տարածել և վերարտադրել ցանկացած միջավայրում, քանի դեռ վերջնական օգտագործումը առևտրային շահույթի համար չէ, և նախադրյալն այն է, որ բնօրինակ աշխատանքը ճիշտ է: Հղում:
Նշում. Մենք խնդրում ենք ձեզ տրամադրել ձեր էլեկտրոնային փոստի հասցեն միայն այն դեպքում, եթե այն ձեր կողմից խորհուրդ տրվող անձը իմանա, որ դուք ցանկանում եք, որ նա տեսնի էլեկտրոնային նամակը, և որ այն սպամ չէ: Մենք չենք գրանցի որևէ էլեկտրոնային փոստի հասցե:
Այս հարցն օգտագործվում է ձեր այցելու լինելը ստուգելու և ավտոմատ սպամի ուղարկումը կանխելու համար։
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H.BelsonR. ԴեԲերարդինիս), Ռասել Ջոնս (Ռասել Ջոնս), Ֆինեաս Թ. Համիլթոն (Ֆինեաս Թ.
MNA-ն նպաստում է T բջիջների իմունային ճնշմանը և ներկայացնում է մարդու քաղցկեղի բուժման պոտենցիալ իմունաթերապիայի թիրախ։
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H.BelsonR. ԴեԲերարդինիս), Ռասել Ջոնս (Ռասել Ջոնս), Ֆինեաս Թ. Համիլթոն (Ֆինեաս Թ.
MNA-ն նպաստում է T բջիջների իմունային ճնշմանը և ներկայացնում է մարդու քաղցկեղի բուժման պոտենցիալ իմունաթերապիայի թիրախ։
©2021 Գիտության առաջընթացի ամերիկյան ասոցիացիա. բոլոր իրավունքները պաշտպանված են: AAAS-ը HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef և COUNTER ընկերությունների գործընկերն է: ScienceAdvances ISSN 2375-2548.