Պրոպիոնիկ թթուն (ՊՊԹ), որը հակասնկային միջոց է և տարածված սննդային հավելում, մկների մոտ առաջացնում է աննորմալ նյարդային զարգացում, որը ուղեկցվում է ստամոքս-աղիքային դիսֆունկցիայով, որը կարող է պայմանավորված լինել աղիքային դիսբիոզով: Առաջարկվել է սննդային ՊՊԹ-ի ազդեցության և աղիքային միկրոբիոտայի դիսբիոզի միջև կապ, սակայն այն ուղղակիորեն չի ուսումնասիրվել: Այստեղ մենք ուսումնասիրել ենք ՊՊԹ-ի հետ կապված աղիքային միկրոբիոտայի կազմի փոփոխությունները, որոնք կարող են հանգեցնել դիսբիոզի: Չմշակված սննդով (n=9) և ՊՊԹ-ով հարստացված սննդով (n=13) կերակրված մկների աղիքային միկրոբիոմները հաջորդականացվել են երկարատև մետագենոմիկ հաջորդականության միջոցով՝ մանրէային կազմի և մանրէային նյութափոխանակության ուղիների տարբերությունները գնահատելու համար: Սննդային ՊՊԹ-ն կապված էր նշանակալի տաքսոնների առատության աճի հետ, այդ թվում՝ մի քանի Bacteroides, Prevotella և Ruminococcus տեսակների, որոնց անդամները նախկինում ներգրավված են եղել ՊՊԹ-ի արտադրության մեջ: ՊՊԹ-ի ազդեցության տակ գտնվող մկների միկրոբիոմները նաև ունեին լիպիդային նյութափոխանակության և ստերոիդային հորմոնների կենսասինթեզի հետ կապված ավելի շատ ուղիներ: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ՊՊԹ-ն կարող է փոխել աղիքային միկրոբիոտան և դրա հետ կապված նյութափոխանակության ուղիները: Այս դիտարկված փոփոխությունները ցույց են տալիս, որ սպառման համար անվտանգ դասակարգված պահպանիչները կարող են ազդել աղիքային միկրոբիոտայի կազմի և, իր հերթին, մարդու առողջության վրա։
Մարդու միկրոբիոմը հաճախ անվանում են «մարմնի վերջին օրգան» և կարևոր դեր է խաղում մարդու առողջության մեջ (Բաքերո և Նոմբելա, 2012): Մասնավորապես, աղիքային միկրոբիոմը ճանաչվում է իր համակարգային ազդեցությամբ և բազմաթիվ կարևոր գործառույթներում ունեցած դերով: Կոմենսալ մանրէները առատ են աղիքներում՝ զբաղեցնելով բազմաթիվ էկոլոգիական խորշեր, օգտագործելով սննդանյութեր և մրցակցելով պոտենցիալ պաթոգենների հետ (Ջանդհյալա և այլք, 2015): Աղիքային միկրոբիոտայի բազմազան մանրէային բաղադրիչները կարող են արտադրել կարևոր սննդանյութեր, ինչպիսիք են վիտամինները, և խթանել մարսողությունը (Ռոուլանդ և այլք, 2018): Բակտերիալ մետաբոլիտները նույնպես ցույց են տվել, որ ազդում են հյուսվածքների զարգացման վրա և բարելավում նյութափոխանակության և իմունային ուղիները (Հեյջց և այլք, 2011; Յու և այլք, 2022): Մարդու աղիքային միկրոբիոմի կազմը չափազանց բազմազան է և կախված է գենետիկական և շրջակա միջավայրի գործոններից, ինչպիսիք են սննդակարգը, սեռը, դեղորայքը և առողջական վիճակը (Կումբարե և այլք, 2019):
Մոր սննդակարգը պտղի և նորածնի զարգացման կարևոր բաղադրիչ է և միացությունների ենթադրյալ աղբյուր, որոնք կարող են ազդել զարգացման վրա (Bazer et al., 2004; Innis, 2014): Այդպիսի հետաքրքրության առարկա միացություններից մեկը պրոպիոնաթթուն է (PPA), որը կարճ շղթայով ճարպաթթվային ենթամթերք է, որը ստացվում է բակտերիալ խմորումից և սննդային հավելանյութ է (den Besten et al., 2013): PPA-ն ունի հակաբակտերիալ և հակասնկային հատկություններ, ուստի օգտագործվում է որպես սննդային պահպանիչ և արդյունաբերական կիրառություններում՝ բորբոսի և բակտերիաների աճը կանխելու համար (Wemmenhove et al., 2016): PPA-ն տարբեր ազդեցություններ ունի տարբեր հյուսվածքների վրա: Լյարդում PPA-ն ունի հակաբորբոքային ազդեցություն՝ ազդելով մակրոֆագերում ցիտոկինների արտահայտման վրա (Kawasoe et al., 2022): Այս կարգավորող ազդեցությունը նկատվել է նաև այլ իմունային բջիջներում, ինչը հանգեցնում է բորբոքման նվազեցմանը (Haase et al., 2021): Այնուամենայնիվ, հակառակ ազդեցությունն է նկատվել ուղեղում: Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ PPA-ի ազդեցությունը մկների մոտ առաջացնում է աուտիզմի նման վարքագիծ (El-Ansary et al., 2012): Այլ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ PPA-ն կարող է առաջացնել գլիոզ և ակտիվացնել ուղեղի պրո-բորբոքային ուղիները (Abdelli et al., 2019): Քանի որ PPA-ն թույլ թթու է, այն կարող է դիֆուզիոն անցնել աղիքային էպիթելի միջոցով դեպի արյան շրջանառություն և այդպիսով հատել սահմանափակող արգելքները, այդ թվում՝ արյուն-ուղեղային արգելքը, ինչպես նաև ընկերքը (Stinson et al., 2019), ինչը ընդգծում է PPA-ի կարևորությունը որպես բակտերիաների կողմից արտադրվող կարգավորիչ մետաբոլիտ: Չնայած PPA-ի հնարավոր դերը որպես աուտիզմի ռիսկի գործոն ներկայումս ուսումնասիրության փուլում է, դրա ազդեցությունը աուտիզմով անհատների վրա կարող է տարածվել նյարդային դիֆերենցիացիայի առաջացումից այն կողմ:
Նյարդաբանական զարգացման խանգարումներ ունեցող հիվանդների մոտ տարածված են ստամոքս-աղիքային ախտանիշները, ինչպիսիք են լուծը և փորկապությունը (Cao et al., 2021): Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ աուտիզմի սպեկտրի խանգարումներով (ԱՍԽ) հիվանդների միկրոբիոմը տարբերվում է առողջ անհատների միկրոբիոմից, ինչը ենթադրում է աղիքային միկրոբիոտայի դիսբիոզի առկայություն (Finegold et al., 2010): Նմանապես, բորբոքային աղիքային հիվանդություններով, ճարպակալմամբ, Ալցհայմերի հիվանդությամբ և այլն հիվանդների միկրոբիոմի բնութագրերը նույնպես տարբերվում են առողջ անհատների բնութագրերից (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019): Այնուամենայնիվ, մինչ օրս աղիքային միկրոբիոմի և նյարդաբանական հիվանդությունների կամ ախտանիշների միջև պատճառահետևանքային կապ չի հաստատվել (Yap et al., 2021), չնայած ենթադրվում է, որ մի քանի մանրէային տեսակներ դեր են խաղում այս հիվանդություններից մի քանիսում: Օրինակ՝ Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio և այլ սեռեր ավելի առատ են աուտիզմով հիվանդների միկրոբիոտայում (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020): Նշենք, որ այս սեռերի որոշ անդամ տեսակներ հայտնի են նրանով, որ ունեն PPA արտադրության հետ կապված գեներ (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023): Հաշվի առնելով PPA-ի հակամանրէային հատկությունները, դրա առատության մեծացումը կարող է օգտակար լինել PPA արտադրող մանրէների աճի համար (Jacobson et al., 2018): Այսպիսով, PFA-ներով հարուստ միջավայրը կարող է հանգեցնել աղիքային միկրոբիոտայի փոփոխությունների, այդ թվում՝ ստամոքս-աղիքային պաթոգենների, որոնք կարող են լինել ստամոքս-աղիքային ախտանիշների առաջացման պոտենցիալ գործոններ:
Միկրոբիոմի հետազոտության կենտրոնական հարցն այն է, թե արդյոք մանրէային կազմի տարբերությունները հիմքում ընկած հիվանդությունների պատճառ են, թե՞ ախտանիշ: Սննդակարգի, աղիքային միկրոբիոմի և նյարդաբանական հիվանդությունների միջև բարդ փոխհարաբերությունը պարզաբանելու առաջին քայլը սննդակարգի ազդեցությունը մանրէային կազմի վրա գնահատելն է: Այդ նպատակով մենք օգտագործեցինք երկարատև մետագենոմիկ հաջորդականացում՝ համեմատելու PPA-ով հարուստ կամ PPA-ով զուրկ սննդակարգով կերակրված մկների սերունդների աղիքային միկրոբիոմները: Սերունդներին կերակրել են նույն սննդակարգով, ինչ իրենց մայրերը: Մենք ենթադրեցինք, որ PPA-ով հարուստ սննդակարգը կհանգեցնի աղիքային մանրէային կազմի և մանրէային ֆունկցիոնալ ուղիների փոփոխությունների, մասնավորապես՝ PPA նյութափոխանակության և/կամ PPA արտադրության հետ կապված փոփոխությունների:
Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործվել են FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J տրանսգենային մկներ (Jackson Laboratories), որոնք գերարտահայտում են կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուցը (GFP)՝ գլիա-սպեցիֆիկ GFAP պրոմոտորի վերահսկողության ներքո՝ հետևելով Կենտրոնական Ֆլորիդայի համալսարանի կենդանիների խնամքի և օգտագործման ինստիտուցիոնալ կոմիտեի (UCF-IACUC) ուղեցույցներին (կենդանիների օգտագործման թույլտվության համար՝ PROTO202000002): Կրծքից կտրվելուց հետո մկները առանձին-առանձին տեղավորվել են վանդակներում՝ յուրաքանչյուր վանդակում յուրաքանչյուր սեռի 1-5 մկներով: Մկներին կերակրել են ad libitum-ով՝ կամ մաքրված վերահսկիչ սննդակարգով (մոդիֆիկացված բաց ստանդարտ սննդակարգ, 16 կկալ% ճարպ), կամ նատրիումի պրոպիոնատով հավելյալ սննդակարգով (մոդիֆիկացված բաց ստանդարտ սննդակարգ, 16 կկալ% ճարպ, որը պարունակում է 5000 ppm նատրիումի պրոպիոնատ): Օգտագործված նատրիումի պրոպիոնատի քանակը համարժեք էր 5000 մգ PFA/կգ սննդի ընդհանուր քաշին: Սա PPA-ի ամենաբարձր կոնցենտրացիան է, որը հաստատվել է որպես սննդային պահպանիչ օգտագործելու համար: Այս ուսումնասիրությանը նախապատրաստվելու համար մայր մկներին զուգավորումից 4 շաբաթ առաջ և մոր հղիության ընթացքում կերակրել են երկու սննդակարգերով։ Ձագ մկները [22 մկ, 9 վերահսկիչ խումբ (6 արու, 3 էգ) և 13 PPA (4 արու, 9 էգ)] կտրվել են կաթից, ապա շարունակվել են մայրերի հետ նույն սննդակարգով 5 ամիս։ Ձագ մկները զոհաբերվել են 5 ամսականում, և նրանց աղիքային կղանքի պարունակությունը հավաքվել և սկզբում պահվել է 1.5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակների մեջ -20°C ջերմաստիճանում, ապա տեղափոխվել է -80°C սառնարան, մինչև տիրոջ ԴՆԹ-ն սպառվի և մանրէային նուկլեինաթթուները արդյունահանվեն։
Հյուրընկալողի ԴՆԹ-ն հեռացվել է փոփոխված արձանագրության համաձայն (Charalampous et al., 2019): Կարճ ասած, կղանքի պարունակությունը տեղափոխվել է 500 մկլ InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) լուծույթի մեջ և պահվել սառեցված վիճակում: Յուրաքանչյուր արդյունահանման համար մշակվել է առավելագույնը 1-2 կղանքի գնդիկ: Այնուհետև կղանքի պարունակությունը մեխանիկորեն համասեռացվել է՝ օգտագործելով խողովակի ներսում գտնվող պլաստիկե մանգաղ՝ խառնուրդ ստանալու համար: Նմուշները ցենտրիֆուգացվել են 10,000 RCF-ի պայմաններում 5 րոպե կամ մինչև նմուշների գնդիկավորումը, այնուհետև վերին շերտը ներծծվել է և գնդիկը վերստին սուսպենզացվել է 250 մկլ 1× PBS լուծույթի մեջ: Նմուշին ավելացվել է 250 մկլ 4.4% սապոնինի լուծույթ (TCI, ապրանքի համար S0019) որպես լվացող միջոց՝ էուկարիոտ բջջային թաղանթները թուլացնելու համար: Նմուշները մեղմորեն խառնվել են մինչև հարթ դառնալը և ինկուբացվել են սենյակային ջերմաստիճանում 10 րոպե: Հաջորդը, էուկարիոտ բջիջները քայքայելու համար, նմուշին ավելացվել է 350 մկլ նուկլեազներից զերծ ջուր, ինկուբացվել է 30 վայրկյան, ապա ավելացվել է 12 մկլ 5 M NaCl: Այնուհետև նմուշները ցենտրիֆուգացվել են 6000 RCF-ում 5 րոպե: Ասպիրացվել է վերին շերտը և գնդիկը վերասուսպենդացվել է 100 մկլ 1X PBS-ում: Հյուրընկալող ԴՆԹ-ն հեռացնելու համար ավելացվել է 100 մկլ HL-SAN բուֆեր (12.8568 գ NaCl, 4 մլ 1M MgCl2, 36 մլ նուկլեազներից զերծ ջուր) և 10 մկլ HL-SAN ֆերմենտ (ArticZymes P/N 70910-202): Նմուշները մանրակրկիտ խառնվել են պիպետավորման միջոցով և ինկուբացվել են 37°C ջերմաստիճանում 30 րոպե՝ 800 պտ/րոպե արագությամբ, Eppendorf™ ThermoMixer C սարքի վրա: Ինկուբացիայից հետո ցենտրիֆուգացվել են 6000 RCF ջերմաստիճանում 3 րոպե և երկու անգամ լվացվել 800 մկլ և 1000 մկլ 1X PBS լուծույթով: Վերջապես, գնդիկը կրկին սուսպենզացվել է 100 մկլ 1X PBS լուծույթի մեջ:
Բակտերիալ ԴՆԹ-ի ընդհանուր քանակը մեկուսացվել է New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit-ի միջոցով (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L): Հավաքածուի հետ տրամադրված ստանդարտ գործողության ընթացակարգը փոքր-ինչ փոփոխված է: Վերջնական էլյուցիայի համար գործողությունից առաջ ինկուբացեք և պահպանեք նուկլեազներից զերծ ջուրը 60°C ջերմաստիճանում: Յուրաքանչյուր նմուշին ավելացրեք 10 մկլ պրոտեինազ K և 3 մկլ RNase A: Այնուհետև ավելացրեք 100 մկլ բջջային լիզի բուֆեր և զգուշորեն խառնեք: Այնուհետև նմուշները ինկուբացվեցին Eppendorf™ ThermoMixer C-ում 56°C ջերմաստիճանում և 1400 պտ/րոպե արագությամբ առնվազն 1 ժամ և մինչև 3 ժամ: Ինկուբացված նմուշները ցենտրիֆուգացվեցին 12,000 RCF-ով 3 րոպե, և յուրաքանչյուր նմուշի վերին շերտը տեղափոխվեց առանձին 1.5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, որը պարունակում էր 400 մկլ կապող լուծույթ: Այնուհետև խողովակները իմպուլսային պտտեցման միջոցով 1 վայրկյան ընդմիջումներով 5-10 վայրկյան շարունակ պտտվեցին: Յուրաքանչյուր նմուշի ամբողջ հեղուկ պարունակությունը (մոտավորապես 600–700 մկլ) տեղափոխեք հոսքային հավաքման խողովակի մեջ տեղադրված ֆիլտրի փամփուշտի մեջ։ Փականները ցենտրիֆուգացվել են 1000 RCF-ով 3 րոպե՝ ԴՆԹ-ի սկզբնական կապը ապահովելու համար, ապա ցենտրիֆուգացվել են 12,000 RCF-ով 1 րոպե՝ մնացորդային հեղուկը հեռացնելու համար։ Նմուշի սյունը տեղափոխվել է նոր հավաքման խողովակի մեջ, ապա լվացվել է երկու անգամ։ Առաջին լվացման համար յուրաքանչյուր փականին ավելացրեք 500 մկլ լվացման բուֆեր։ Շրջեք փականն 3-5 անգամ, ապա ցենտրիֆուգացրեք 12,000 RCF-ով 1 րոպե։ Հեռացրեք հեղուկը հավաքման փականից և ֆիլտրի փամփուշտը տեղադրեք նույն հավաքման փականում։ Երկրորդ լվացման համար ֆիլտրին ավելացրեք 500 մկլ լվացման բուֆեր՝ առանց շրջելու։ Նմուշները ցենտրիֆուգացվել են 12,000 RCF-ով 1 րոպե։ Ֆիլտրը տեղափոխեք 1.5 մլ LoBind® խողովակի մեջ և ավելացրեք 100 մկլ նախապես տաքացված նուկլեազներից զերծ ջուր: Ֆիլտրերը ինկուբացվեցին սենյակային ջերմաստիճանում 1 րոպե, ապա ցենտրիֆուգացվեցին 12,000 RCF-ում 1 րոպե: Էլյուացված ԴՆԹ-ն պահվեց -80°C ջերմաստիճանում:
ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան քանակապես որոշվել է Qubit™ 4.0 ֆլուորոմետրի միջոցով: ԴՆԹ-ն պատրաստվել է Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit-ի (կատ. համար Q33231) միջոցով՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների: ԴՆԹ բեկորների երկարության բաշխումը չափվել է Aglient™ 4150 կամ 4200 TapeStation-ի միջոցով: ԴՆԹ-ն պատրաստվել է Agilent™ Genomic DNA Reagents-ի (կատ. համար 5067-5366) և Genomic DNA ScreenTape-ի (կատ. համար 5067-5365) միջոցով: Գրադարանի պատրաստումը կատարվել է Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit-ի (SQK-RPB004) միջոցով՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների: ԴՆԹ-ն հաջորդականացվել է ONT GridION™ Mk1 հաջորդականացնողի միջոցով՝ Min106D հոսքային բջիջով (R 9.4.1): Հաջորդականացման կարգավորումներն էին՝ բարձր ճշգրտության բազայի կանչ, նվազագույն q արժեքը՝ 9, շտրիխ կոդի կարգավորում և շտրիխ կոդի կտրում: Նմուշները հաջորդականացվել են 72 ժամվա ընթացքում, որից հետո բազային կանչի տվյալները ներկայացվել են հետագա մշակման և վերլուծության:
Կենսաինֆորմատիկական մշակումը կատարվել է նախկինում նկարագրված մեթոդներով (Greenman et al., 2024): Հաջորդականացումից ստացված FASTQ ֆայլերը բաժանվել են յուրաքանչյուր նմուշի համար նախատեսված տեղեկատուների: Կենսաինֆորմատիկական վերլուծությունից առաջ տվյալները մշակվել են հետևյալ խողովակաշարով. նախ, նմուշների FASTQ ֆայլերը միավորվել են մեկ FASTQ ֆայլի մեջ: Այնուհետև, 1000 bp-ից կարճ ընթերցումները զտվել են Filtlong v. 0.2.1-ի միջոցով, որի միակ փոփոխված պարամետրը եղել է –min_length 1000 (Wick, 2024): Հետագա զտումից առաջ ընթերցման որակը կարգավորվել է NanoPlot v. 1.41.3-ի միջոցով՝ հետևյալ պարամետրերով՝ –fastq –plots dot –N50 -o(Դե Քոստեր և Ռադեմեյքերս, 2023): Ընթերցումները համապատասխանեցվել են մկան հղման գենոմի GRCm39-ին (GCF_000001635.27)՝ օգտագործելով minimap2 v. 2.24-r1122՝ հետևյալ պարամետրերով տիրոջ կողմից աղտոտված ընթերցումները հեռացնելու համար. -L -ax map-ont(Լի, 2018): Ստեղծված համընկնման ֆայլերը փոխակերպվել են BAM ձևաչափի՝ օգտագործելով samtools view -b (Danecek et al., 2021) samtools v. 1.16.1-ում: Չհամընկնման ընթերցումները այնուհետև նույնականացվել են samtools view -b -f 4-ի միջոցով, ինչը ցույց է տալիս, որ այդ ընթերցումները չեն պատկանում տիրոջ գենոմին: Չհամընկնման ընթերցումները կրկին փոխակերպվել են FASTQ ձևաչափի՝ օգտագործելով samtools bam2fq՝ լռելյայն պարամետրերով: NanoPlot-ը վերագործարկվել է հետագա ֆիլտրացված ընթերցումների վրա՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված կարգավորումները: Ֆիլտրելուց հետո մետագենոմիկ տվյալները հավաքվել են metaflye v. 2.8.2-b1689-ի միջոցով՝ հետևյալ պարամետրերով՝ –nano-raw:–meta (Kolmogorov et al., 2020): Մնացած պարամետրերը թողեք իրենց լռելյայն արժեքներով: Հավաքագրումից հետո, ֆիլտրացված ընթերցումները քարտեզագրվեցին հավաքածուի վրա՝ օգտագործելով minimap2, և -ax map-ont պարամետրը օգտագործվեց SAM ձևաչափով հավասարեցման ֆայլ ստեղծելու համար: Հավաքագրումը նախ կատարելագործվեց՝ օգտագործելով racon v. 1.4.20՝ հետևյալ պարամետրերով՝ -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017): Racon-ի ավարտից հետո այն հետագայում կատարելագործվեց medaka v. 1.7.2-ով՝ օգտագործելով medaka_consesus, որտեղ բոլոր պարամետրերը, բացառությամբ -m պարամետրի, թողնվեցին իրենց լռելյայն արժեքներով: -m պարամետրը սահմանվում է r941_min_hac_g507՝ մեր տվյալների համար օգտագործված հոսքային բջիջների քիմիան և բարձր ճշգրտության բազային կանչը նշելու համար (nanoporetech/medaka, 2024): Ֆիլտրված տվյալները (այսուհետ՝ մանրէային տվյալներ) և վերջնական մաքրված հավաքածուն օգտագործվեցին հետագա վերլուծության համար:
Տաքսոնոմիկ դասակարգման համար, ընթերցումները և հավաքված կոնտիգները դասակարգվել են Kraken2 v. 2.1.2-ի միջոցով (Wood et al., 2019): Համապատասխանաբար ընթերցումների և հավաքումների համար ստեղծեք հաշվետվություններ և ելքային ֆայլեր: Օգտագործեք –use-names տարբերակը՝ ընթերցումները և հավաքումները վերլուծելու համար: –gzip-compressed և –paired տարբերակները նշված են ընթերցված հատվածների համար: Մետագենոմներում տաքսոնների հարաբերական առատությունը գնահատվել է Bracken v. 2.8-ի միջոցով (Lu et al., 2017): Մենք սկզբում ստեղծեցինք kmer տվյալների բազա, որը պարունակում էր 1000 հիմք՝ օգտագործելով bracken-build-ը՝ հետևյալ պարամետրերով՝ -d:-k 35 -l 1000 Կառուցվելուց հետո, bracken-ը գործարկվում է kraken2-ի կողմից ստեղծված հաշվետվության հիման վրա և զտում է տվյալները հետևյալ տարբերակներով՝ -d -I -O-պ 1000 -լ

Դրանցից ընտրվում են P, G կամ S՝ կախված վերլուծվող դասակարգման մակարդակից: Կեղծ դրական դասակարգումների ազդեցությունը նվազագույնի հասցնելու համար ընդունվել է 1e-4 (1/10,000 ընթերցում) նվազագույն հարաբերական առատության շեմը: Վիճակագրական վերլուծությունից առաջ Բրեքենի կողմից հաղորդված հարաբերական առատությունները (fraction_total_reads) վերափոխվել են կենտրոնացված լոգարիթմական հարաբերակցության (CLR) վերափոխման միջոցով (Aitchison, 1982): Տվյալների վերափոխման համար ընտրվել է CLR մեթոդը, քանի որ այն մասշտաբի առումով անփոփոխ է և բավարար է ոչ նոսր տվյալների հավաքածուների համար (Gloor et al., 2017): CLR վերափոխումն օգտագործում է բնական լոգարիթմը: Բրեքենի կողմից հաղորդված հաշվարկի տվյալները նորմալացվել են հարաբերական լոգարիթմական արտահայտության (RLE) միջոցով (Anders and Huber, 2010): Նկարները ստեղծվել են matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 և հաջորդական լոգարիթմների համադրությամբ (Gloor et al., 2017): 0.12.2 և ստանտանոտաներ v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022): Bacillus/Bacteroidetes հարաբերակցությունը հաշվարկվել է յուրաքանչյուր նմուշի համար՝ օգտագործելով նորմալացված մանրէների հաշվարկներ: Աղյուսակներում ներկայացված արժեքները կլորացված են մինչև 4 տասնորդական նիշ: Սիմփսոնի բազմազանության ինդեքսը հաշվարկվել է KrakenTools v. 1.2 փաթեթում տրամադրված alpha_diversity.py սկրիպտի միջոցով (Lu et al., 2022): Բրեքենի հաշվետվությունը տրամադրվում է սկրիպտում, իսկ Սիմփսոնի «Si» ինդեքսը տրամադրվում է -an պարամետրի համար: Առատության զգալի տարբերությունները սահմանվել են որպես միջին CLR տարբերություններ ≥ 1 կամ ≤ -1: ±1 միջին CLR տարբերությունը ցույց է տալիս նմուշի տեսակի առատության 2.7 անգամ աճ: Նշանը (+/-) ցույց է տալիս, թե արդյոք տաքսոնն ավելի առատ է համապատասխանաբար PPA նմուշում և վերահսկիչ նմուշում: Նշանակալիցությունը որոշվել է Մանն-Ուիթնիի U թեստի միջոցով (Virtanen et al., 2020): Օգտագործվել է Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), իսկ բազմակի թեստավորման համար կիրառվել է Բենջամինի-Հոչբերգի ընթացակարգը: Վիճակագրական նշանակալիությունը որոշելու համար որպես շեմ օգտագործվել է ճշգրտված p-արժեք ≤ 0.05:
Գեների անոտացիան և հարաբերական առատության գնահատումը կատարվել են Մարանգայի և այլոց կողմից նկարագրված արձանագրության փոփոխված տարբերակի միջոցով (Maranga et al., 2023): Նախ, 500 զույգ հիմքից կարճ կոնտիգները հեռացվել են բոլոր ասամբլեաներից՝ օգտագործելով SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016): Այնուհետև ընտրված ասամբլեաները միավորվել են պան-մետագենոմի մեջ: Բաց ընթերցման շրջանակները (ORF) նույնականացվել են Prodigal v. 1.0.1-ի միջոցով (Prodigal v. 2.6.3-ի զուգահեռ տարբերակ)՝ հետևյալ պարամետրերով՝ -d:-ֆ gff-ի -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024): Արդյունքում ստացված նուկլեոտիդային ֆայլերը այնուհետև զտվել են Python-ի միջոցով՝ բոլոր անավարտ գեները հեռացնելու համար: Այնուհետև CD-HIT v. 4.8.1-ը օգտագործվել է գեները հետևյալ պարամետրերով խմբավորելու համար՝ cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012): Ստեղծված ոչ ավելորդ գեների կատալոգն օգտագործվել է գեների առատությունը և անոտացիան գնահատելու համար: Գեների հարաբերական առատությունը գնահատվել է KMA v. 1.4.9-ի միջոցով (Clausen et al., 2018): Նախ, ստեղծեք ինդեքսի ֆայլ՝ օգտագործելով KMA ինդեքսը՝ հետևյալ պարամետրերով. -i -OԱյնուհետև, օգտագործելով յուրաքանչյուր նմուշի համար մանրէային ընթերցումների հետ միասին ստեղծված ինդեքսը, ինչպես նկարագրված է «Կենսաինֆորմատիկայի խողովակաշար» բաժնում, KMA-ն գործարկվեց հետևյալ պարամետրերով՝ -i։ -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Այնուհետև, գեների քանակը նորմալացվել է CLR-ի միջոցով, և օգտագործվել է Sci-kit learn-ի գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (PCA) դասը (Pedregosa et al., 2011): Կանխատեսված գեների անոտացիան կատարվել է ոչ ավելորդ գեների կատալոգի վրա՝ օգտագործելով eggNOG v. 2.1.12-ի emapper.py սկրիպտը և eggNOG տվյալների բազայի 5.0.2 տարբերակը՝ հետևյալ պարամետրերով՝ –itype CDS –cpu 24 -i– Տվյալների կատալոգ–go_evidence Ոչ էլեկտրոնային – ելք– Արդյունքների գրացուցակ–target_ortholologs բոլորը –seed_orthololog_evalue 0.001 –seed_orthololog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021): KMA արդյունքները սկրինինգ արվեցին՝ ընտրելու համար բավարար ձևանմուշի ծածկույթ և ձևանմուշի նույնականություն (≥ 90%) և առատություն (խորություն ≥ 3) ունեցող գեները: KMA խորության արդյունքները վերափոխվեցին CLR-ի միջոցով, ինչպես նկարագրված է վերևում: Այնուհետև KMA արդյունքները համեմատվեցին ֆունկցիոնալ ծանոթագրության և դասակարգման արդյունքներից ստացված կոնտիգների ID-ների հետ՝ օգտագործելով յուրաքանչյուր գենի կոնտիգ աղբյուրը: Ինչպես տաքսոնների դեպքում, գեների առատության զգալի տարբերությունները սահմանվեցին որպես միջին CLR տարբերություն ≥ 1 կամ ≤ -1 ունեցող գեներ, որոնց նշանը (+/-) ցույց է տալիս, որ գենն ավելի առատ էր համապատասխանաբար PPA կամ վերահսկիչ նմուշներում:
Գեները սկզբում խմբավորվել են eggNOG-ի կողմից տրված Գեների և գենոմների Կիոտոյի հանրագիտարանի (KEGG) օրթոլոգիայի (KO) նույնականացուցիչների համաձայն՝ գեների ուղիների առատությունը համեմատելու համար: Վերլուծությունից առաջ հեռացվել են նոկաուտ չունեցող կամ բազմակի նոկաուտներով գեները: Այնուհետև հաշվարկվել է յուրաքանչյուր KO-ի միջին առատությունը մեկ նմուշում, և կատարվել է վիճակագրական վերլուծություն: PPA նյութափոխանակության գեները սահմանվել են որպես ցանկացած գեն, որին KEGG_Pathway սյունակում նշանակվել է ko00640 տող, որը ցույց է տալիս պրոպիոնատի նյութափոխանակության մեջ նրա դերը՝ համաձայն KEGG-ի: PPA արտադրության հետ կապված նույնականացված գեները ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ 1-ում (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017): Կատարվել են տեղափոխման թեստեր՝ յուրաքանչյուր նմուշի տեսակում զգալիորեն ավելի առատ PPA նյութափոխանակության և արտադրության գեները հայտնաբերելու համար: Վերլուծված յուրաքանչյուր գենի համար կատարվել է հազար տեղափոխում: Վիճակագրական նշանակությունը որոշելու համար որպես սահմանային արժեք օգտագործվել է 0.05 p արժեքը: Ֆունկցիոնալ նշումները նշանակվել են կլաստերի ներսում գտնվող առանձին գեներին՝ կլաստերի ներսում գտնվող ներկայացուցչական գեների նշումների հիման վրա: PPA-ի նյութափոխանակության և/կամ PPA-ի արտադրության հետ կապված տաքսոնները կարող են նույնականացվել՝ Kraken2 ելքային ֆայլերում կոնտիգ ID-ները համապատասխանեցնելով eggNOG-ի միջոցով ֆունկցիոնալ ծանոթագրության ընթացքում պահպանված նույն կոնտիգ ID-ներին: Նշանակալիության թեստը կատարվել է նախկինում նկարագրված Մանն-Ուիթնի U թեստի միջոցով: Բազմակի թեստավորման ուղղումը կատարվել է Բենջամինի-Հոխբերգի ընթացակարգի միջոցով: Վիճակագրական նշանակալիությունը որոշելու համար որպես սահմանային արժեք օգտագործվել է ≤ 0.05 p-արժեք:
Մկների աղիքային միկրոբիոմի բազմազանությունը գնահատվել է Սիմփսոնի բազմազանության ինդեքսի միջոցով: Վերահսկիչ և PPA նմուշների միջև էական տարբերություններ չեն նկատվել սեռի և տեսակի բազմազանության առումով (սեռի p-արժեքը՝ 0.18, տեսակի p-արժեքը՝ 0.16) (Նկար 1): Այնուհետև մանրէային կազմը համեմատվել է գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (PCA) միջոցով: Նկար 2-ը ցույց է տալիս նմուշների կլաստերացումը ըստ նրանց տեսակների, ինչը ցույց է տալիս, որ PPA-ի և վերահսկիչ նմուշների միջև միկրոբիոմների տեսակային կազմի տարբերություններ կան: Այս կլաստերացումը սեռի մակարդակում ավելի քիչ արտահայտված էր, ինչը ենթադրում է, որ PPA-ն ազդում է որոշակի մանրէների վրա (Լրացուցիչ նկար 1):
Նկար 1. Մկան աղիքային միկրոբիոմի սեռերի ալֆա բազմազանությունը և տեսակային կազմը: PPA և վերահսկիչ նմուշներում սեռերի (A) և տեսակների (B) Սիմփսոնի բազմազանության ինդեքսները ցույց տվող քառակուսի գրաֆիկներ: Նշանակալիցությունը որոշվել է Մանն-Ուիթնի U թեստի միջոցով, և բազմակի ուղղում է կատարվել Բենջամինի-Հոխբերգի ընթացակարգի միջոցով: ns, p-արժեքը նշանակալի չէր (p>0.05):
Նկար 2. Մկան աղիքային միկրոբիոմի կազմի հիմնական բաղադրիչների վերլուծության արդյունքները տեսակի մակարդակով: Հիմնական բաղադրիչների վերլուծության գրաֆիկը ցույց է տալիս նմուշների բաշխումը դրանց առաջին երկու հիմնական բաղադրիչների միջև: Գույները ցույց են տալիս նմուշի տեսակը. PPA-ի ազդեցության ենթարկված մկները մանուշակագույն են, իսկ վերահսկիչ մկները՝ դեղին: Հիմնական բաղադրիչներ 1-ը և 2-ը համապատասխանաբար գծագրված են x և y առանցքների վրա և արտահայտվում են որպես դրանց բացատրված դիսպերսիայի հարաբերակցություն:
RLE ձևափոխված հաշվարկի տվյալների օգտագործմամբ, վերահսկիչ և PPA մկների մոտ դիտվել է Bacteroidetes/Bacillus միջնարժեքի զգալի նվազում (վերահսկիչ խումբ՝ 9.66, PPA՝ 3.02; p-արժեք = 0.0011): Այս տարբերությունը պայմանավորված էր PPA մկների մոտ Bacteroidetes-ի ավելի մեծ առատությամբ՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ, չնայած տարբերությունը նշանակալի չէր (վերահսկիչ խմբի միջին CLR՝ 5.51, PPA միջին CLR՝ 6.62; p-արժեք = 0.054), մինչդեռ Bacteroidetes առատությունը նման էր (վերահսկիչ խմբի միջին CLR՝ 7.76, PPA միջին CLR՝ 7.60; p-արժեք = 0.18):
Աղիքային միկրոբիոմի տաքսոնոմիկ անդամների առատության վերլուծությունը ցույց տվեց, որ 1 տիպի և 77 տեսակի պարունակությունը զգալիորեն տարբերվում էր PPA և վերահսկիչ նմուշների միջև (Լրացուցիչ աղյուսակ 2): PPA նմուշներում 59 տեսակի առատությունը զգալիորեն ավելի բարձր էր, քան վերահսկիչ նմուշներում, մինչդեռ վերահսկիչ նմուշներում միայն 16 տեսակի առատությունն ավելի բարձր էր, քան PPA նմուշներում (Նկար 3):
Նկար 3. Տաքսոնների տարբերակված առատությունը PPA և վերահսկիչ մկների աղիքային միկրոբիոմում: Հրաբխային գրաֆիկները ցույց են տալիս PPA և վերահսկիչ նմուշների միջև սեռերի (A) կամ տեսակների (B) առատության տարբերությունները: Մոխրագույն կետերը ցույց են տալիս տաքսոնների առատության էական տարբերությունների բացակայությունը: Գունավոր կետերը ցույց են տալիս առատության էական տարբերությունները (p-արժեք ≤ 0.05): Նմուշների տեսակների միջև առատության ամենամեծ տարբերություններով առաջին 20 տաքսոնները համապատասխանաբար ներկայացված են կարմիր և բաց կապույտ գույներով (վերահսկիչ և PPA նմուշներ): Դեղին և մանուշակագույն կետերը վերահսկիչ կամ PPA նմուշներում առնվազն 2.7 անգամ ավելի առատ էին, քան վերահսկիչ նմուշներում: Սև կետերը ներկայացնում են զգալիորեն տարբեր առատություններ ունեցող տաքսոններ՝ -1-ի և 1-ի միջև միջին CLR տարբերություններով: P արժեքները հաշվարկվել են Մանն-Ուիթնի U թեստի միջոցով և ուղղվել են բազմակի փորձարկումների համար՝ օգտագործելով Բենջամինի-Հոխբերգի ընթացակարգը: Թավատառ միջին CLR տարբերությունները ցույց են տալիս առատության էական տարբերությունները:
Աղիքային միկրոբային կազմը վերլուծելուց հետո մենք կատարեցինք միկրոբիոմի ֆունկցիոնալ անոտացիա։ Ցածր որակի գեները զտելուց հետո բոլոր նմուշներում նույնականացվեցին ընդհանուր առմամբ 378,355 եզակի գեներ։ Այս գեների ձևափոխված առատությունն օգտագործվել է գլխավոր բաղադրիչների վերլուծության (ԳԿՎ) համար, և արդյունքները ցույց տվեցին նմուշների տեսակների բարձր աստիճանի կլաստերացում՝ հիմնվելով դրանց ֆունկցիոնալ պրոֆիլների վրա (Նկար 4):
Նկար 4. PCA արդյունքներ՝ օգտագործելով մկան աղիքային միկրոբիոմի ֆունկցիոնալ պրոֆիլը: PCA գրաֆիկը ցույց է տալիս նմուշների բաշխումը դրանց առաջին երկու հիմնական բաղադրիչների միջև: Գույները ցույց են տալիս նմուշի տեսակը. PPA-ի ազդեցության ենթարկված մկները մանուշակագույն են, իսկ վերահսկիչ մկները՝ դեղին: Հիմնական բաղադրիչներ 1-ը և 2-ը համապատասխանաբար գծագրված են x և y առանցքների վրա և արտահայտվում են որպես դրանց բացատրված դիսպերսիայի հարաբերակցություն:
Հաջորդը մենք ուսումնասիրեցինք KEGG նոկաուտների առատությունը տարբեր տեսակի նմուշներում: Ընդհանուր առմամբ հայտնաբերվել է 3648 եզակի նոկաուտ, որոնցից 196-ը զգալիորեն ավելի առատ էին վերահսկիչ նմուշներում, իսկ 106-ը՝ ավելի առատ՝ PPA նմուշներում (Նկար 5): Վերահսկիչ նմուշներում հայտնաբերվել է ընդհանուր առմամբ 145 գեն, իսկ PPA նմուշներում՝ 61 գեն, որոնց առատությունը զգալիորեն տարբեր է: Լիպիդների և ամինոշաքարերի նյութափոխանակության հետ կապված ուղիները զգալիորեն ավելի հարուստ էին PPA նմուշներում (Լրացուցիչ աղյուսակ 3): Ազոտի նյութափոխանակության և ծծմբի ռելեային համակարգերի հետ կապված ուղիները զգալիորեն ավելի հարուստ էին վերահսկիչ նմուշներում (Լրացուցիչ աղյուսակ 3): Ամինոշաքարերի/նուկլեոտիդների նյութափոխանակության (ko:K21279) և ինոզիտոլ ֆոսֆատի նյութափոխանակության (ko:K07291) հետ կապված գեների առատությունը զգալիորեն ավելի բարձր էր PPA նմուշներում (Նկար 5): Վերահսկիչ նմուշներում զգալիորեն ավելի շատ գեներ կային, որոնք կապված էին բենզոատի նյութափոխանակության (ko:K22270), ազոտի նյութափոխանակության (ko:K00368) և գլիկոլիզի/գլյուկոնեոգենեզի (ko:K00131) հետ (Նկար 5):
Նկ. 5. KO-ների դիֆերենցիալ առատությունը PPA և վերահսկիչ մկների աղիքային միկրոբիոմում: Հրաբխի գրաֆիկը պատկերում է ֆունկցիոնալ խմբերի (KO) առատության տարբերությունները: Մոխրագույն կետերը ցույց են տալիս KO-ները, որոնց առատությունը նշանակալիորեն տարբեր չէր նմուշների տեսակների միջև (p-արժեք > 0.05): Գունավոր կետերը ցույց են տալիս առատության նշանակալի տարբերությունները (p-արժեք ≤ 0.05): Նմուշների տեսակների միջև առատության ամենամեծ տարբերություններով 20 KO-ները ցույց են տրված կարմիր և բաց կապույտ գույներով, որոնք համապատասխանում են համապատասխանաբար վերահսկիչ և PPA նմուշներին: Դեղին և մանուշակագույն կետերը ցույց են տալիս KO-ներ, որոնք համապատասխանաբար առնվազն 2.7 անգամ ավելի առատ էին վերահսկիչ և PPA նմուշներում: Սև կետերը ցույց են տալիս զգալիորեն տարբեր առատություններ ունեցող KO-ներ, միջին CLR տարբերություններով -1-ի և 1-ի միջև: P արժեքները հաշվարկվել են Մանն-Ուիթնի U թեստի միջոցով և ճշգրտվել են բազմակի համեմատությունների համար՝ օգտագործելով Բենջամինի-Հոխբերգի ընթացակարգը: NaN-ը ցույց է տալիս, որ KO-ն չի պատկանում KEGG-ի որևէ ուղու: Թավատառ միջին CLR տարբերության արժեքները ցույց են տալիս առատության նշանակալի տարբերությունները: Թվարկված KO-ների պատկանող ուղիների վերաբերյալ մանրամասն տեղեկությունների համար տե՛ս լրացուցիչ աղյուսակ 3-ը։
Անոտացված գեների շարքում 1601 գեներ զգալիորեն տարբեր առատություն ունեին նմուշների տեսակների միջև (p ≤ 0.05), որտեղ յուրաքանչյուր գեն առնվազն 2.7 անգամ ավելի առատ էր։ Այս գեներից 4 գեն ավելի առատ էին վերահսկիչ նմուշներում, իսկ 1597 գեն՝ ավելի առատ՝ PPA նմուշներում։ Քանի որ PPA-ն ունի հակամանրէային հատկություններ, մենք ուսումնասիրեցինք PPA նյութափոխանակության և արտադրության գեների առատությունը նմուշների տեսակների միջև։ PPA նյութափոխանակության հետ կապված 1332 գեներից 27 գեն զգալիորեն ավելի առատ էին վերահսկիչ նմուշներում, իսկ 12 գեն՝ ավելի առատ՝ PPA նմուշներում։ PPA արտադրության հետ կապված 223 գեներից 1 գեն զգալիորեն ավելի առատ էր PPA նմուշներում։ Նկար 6A-ն ավելի մանրամասն ցույց է տալիս PPA նյութափոխանակության մեջ ներգրավված գեների ավելի բարձր առատությունը՝ վերահսկիչ նմուշներում զգալիորեն ավելի բարձր առատությամբ և մեծ ազդեցության չափերով, մինչդեռ Նկար 6B-ն ընդգծում է PPA նմուշներում դիտարկվող զգալիորեն ավելի բարձր առատությամբ առանձին գեները։
Նկ. 6. PPA-ի հետ կապված գեների դիֆերենցիալ առատությունը մկան աղիքային միկրոբիոմում: Հրաբխային գրաֆիկները պատկերում են PPA նյութափոխանակության (A) և PPA արտադրության (B) հետ կապված գեների առատության տարբերությունները: Մոխրագույն կետերը ցույց են տալիս այն գեները, որոնց առատությունը էականորեն չի տարբերվել նմուշների տեսակների միջև (p-արժեք > 0.05): Գունավոր կետերը ցույց են տալիս առատության էական տարբերությունները (p-արժեք ≤ 0.05): Առատության ամենամեծ տարբերություններով 20 գեները համապատասխանաբար ներկայացված են կարմիր և բաց կապույտ գույներով (վերահսկիչ և PPA նմուշներ): Դեղին և մանուշակագույն կետերի առատությունը առնվազն 2.7 անգամ ավելի մեծ էր վերահսկիչ և PPA նմուշներում, քան վերահսկիչ նմուշներում: Սև կետերը ներկայացնում են էականորեն տարբեր առատություններ ունեցող գեներ՝ -1-ի և 1-ի միջև միջին CLR տարբերություններով: P արժեքները հաշվարկվել են Մանն-Ուիթնի U թեստի միջոցով և ուղղվել են բազմակի համեմատությունների համար՝ օգտագործելով Բենջամինի-Հոխբերգի ընթացակարգը: Գեները համապատասխանում են ոչ ավելորդ գեների կատալոգի ներկայացուցչական գեներին: Գեների անունները բաղկացած են KEGG նշանից, որը նշանակում է KO գեն: Թավատառ միջին CLR տարբերությունները ցույց են տալիս էականորեն տարբեր առատություններ: Գծիկը (-) նշանակում է, որ KEGG տվյալների բազայում գենի համար որևէ նշան չկա։
PPA նյութափոխանակության և/կամ արտադրության հետ կապված գեներով տաքսոնները նույնականացվել են կոնտիգների տաքսոնոմիկ նույնականությունը գենի կոնտիգի ID-ի հետ համեմատելու միջոցով: Սեռի մակարդակով հայտնաբերվել են PPA նյութափոխանակության հետ կապված գեներ 130 սեռերի և PPA արտադրության հետ կապված գեներ 61 սեռերի մոտ (Լրացուցիչ աղյուսակ 4): Այնուամենայնիվ, ոչ մի սեռ չի ցուցաբերել առատության զգալի տարբերություններ (p > 0.05):
Տեսակների մակարդակով, 144 մանրէային տեսակների մոտ հայտնաբերվել են PPA-ի նյութափոխանակության հետ կապված գեներ, իսկ 68 մանրէային տեսակների մոտ՝ PPA-ի արտադրության հետ կապված գեներ (Լրացուցիչ աղյուսակ 5): PPA-ի մետաբոլիզատորների շրջանում ութ մանրէների մոտ նկատվել է առատության զգալի աճ նմուշների տեսակների միջև, և բոլորը ցույց են տվել ազդեցության զգալի փոփոխություններ (Լրացուցիչ աղյուսակ 6): Առատության զգալի տարբերություններ ունեցող բոլոր նույնականացված PPA-ի մետաբոլիզատորները ավելի առատ էին PPA նմուշներում: Տեսակների մակարդակի դասակարգումը բացահայտել է այնպիսի սեռերի ներկայացուցիչներ, որոնք էականորեն չէին տարբերվում նմուշների տեսակների միջև, այդ թվում՝ Bacteroides և Ruminococcus մի քանի տեսակներ, ինչպես նաև Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus և Alcaligenes polymorpha: PPA արտադրող մանրէների շրջանում չորս մանրէների մոտ նկատվել է առատության զգալի տարբերություններ նմուշների տեսակների միջև: Առատության զգալի տարբերություններ ունեցող տեսակների թվում էին Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis և Ruminococcus bovis:
Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ուսումնասիրել ենք PPA-ի ազդեցության ազդեցությունը մկների աղիքային միկրոբիոտայի վրա: PPA-ն կարող է տարբեր ռեակցիաներ առաջացնել մանրէների մոտ, քանի որ այն արտադրվում է որոշակի տեսակների կողմից, օգտագործվում է որպես սննդի աղբյուր այլ տեսակների կողմից կամ ունի հակամանրէային ազդեցություն: Հետևաբար, դրա աղիքային միջավայրում ավելացումը սննդային հավելումների միջոցով կարող է տարբեր ազդեցություն ունենալ՝ կախված հանդուրժողականությունից, զգայունությունից և այն որպես սննդանյութի աղբյուր օգտագործելու ունակությունից: Զգայուն մանրէային տեսակները կարող են վերացվել և փոխարինվել PPA-ի նկատմամբ ավելի դիմացկուն կամ այն ​​որպես սննդի աղբյուր օգտագործելու կարողությամբ, ինչը հանգեցնում է աղիքային միկրոբիոտայի կազմի փոփոխությունների: Մեր արդյունքները ցույց տվեցին մանրէային կազմի զգալի տարբերություններ, բայց ոչ մի ազդեցություն ընդհանուր մանրէային բազմազանության վրա: Ամենամեծ ազդեցությունները դիտվել են տեսակների մակարդակում՝ PPA-ի և վերահսկիչ նմուշների միջև առատությամբ զգալիորեն տարբերվելով ավելի քան 70 տաքսոնով (Լրացուցիչ աղյուսակ 2): PPA-ի ազդեցության տակ գտնվող նմուշների կազմի հետագա գնահատումը ցույց տվեց մանրէային տեսակների ավելի մեծ տարասեռություն՝ համեմատած չազդված նմուշների հետ, ինչը ենթադրում է, որ PPA-ն կարող է բարելավել մանրէների աճի բնութագրերը և սահմանափակել PPA-ով հարուստ միջավայրերում գոյատևող մանրէային պոպուլյացիաները: Այսպիսով, PPA-ն կարող է ընտրողաբար առաջացնել փոփոխություններ, այլ ոչ թե լայնածավալ խաթարում առաջացնել աղիքային միկրոբիոտայի բազմազանության մեջ։
Սննդային պահպանիչները, ինչպիսին է PPA-ն, նախկինում ցույց են տվել, որ փոխում են աղիքային միկրոբիոմի բաղադրիչների առատությունը՝ առանց ընդհանուր բազմազանության վրա ազդելու (Nagpal et al., 2021): Այստեղ մենք դիտարկել ենք Bacteroidetes տեսակների միջև ամենաակնառու տարբերությունները Bacteroidetes (նախկինում հայտնի որպես Bacteroidetes) տեսակի մեջ, որոնք զգալիորեն հարստացված էին PPA-ի ազդեցության տակ գտնվող մկների մոտ: Bacteroides տեսակների առատության աճը կապված է լորձի քայքայման աճի հետ, ինչը կարող է մեծացնել վարակի ռիսկը և նպաստել բորբոքմանը (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019): Մեկ ուսումնասիրություն ցույց է տվել, որ Bacteroides fragilis-ով բուժված նորածին արու մկները ցուցաբերել են աուտիզմի սպեկտրի խանգարման (ASD) հիշեցնող սոցիալական վարքագիծ (Carmel et al., 2023), իսկ այլ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ Bacteroides տեսակները կարող են փոխել իմունային ակտիվությունը և հանգեցնել աուտոիմուն բորբոքային կարդիոմիոպաթիայի (Gil-Cruz et al., 2019): Ruminococcus, Prevotella և Parabacteroides ցեղերին պատկանող տեսակների քանակը նույնպես զգալիորեն աճել է PPA-ին ենթարկված մկների մոտ (Coretti et al., 2018): Ruminococcus-ի որոշակի տեսակներ կապված են այնպիսի հիվանդությունների հետ, ինչպիսին է Կրոնի հիվանդությունը՝ բորբոքային ցիտոկինների արտադրության միջոցով (Henke et al., 2019), մինչդեռ Prevotella տեսակները, ինչպիսին է Prevotella humani-ն, կապված են նյութափոխանակության հիվանդությունների հետ, ինչպիսիք են հիպերտոնիան և ինսուլինի նկատմամբ զգայունությունը (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017): Վերջապես, մենք պարզեցինք, որ Bacteroidetes-ի (նախկինում հայտնի որպես Firmicutes) և Bacteroidetes-ի հարաբերակցությունը PPA-ին ենթարկված մկների մոտ զգալիորեն ցածր էր, քան վերահսկիչ խմբի մկների մոտ՝ Bacteroidetes տեսակների ավելի բարձր ընդհանուր առատության պատճառով: Այս հարաբերակցությունը նախկինում ապացուցվել է որպես աղիքային հոմեոստազի կարևոր ցուցանիշ, և այս հարաբերակցության խանգարումները կապված են եղել տարբեր հիվանդությունների հետ (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), այդ թվում՝ բորբոքային աղիքային հիվանդությունների (Stojanov et al., 2020): Ընդհանուր առմամբ, Bacteroidetes տիպի տեսակները, կարծես թե, ամենաուժեղ կերպով են տուժում սննդային PPA-ի բարձր մակարդակից: Սա կարող է պայմանավորված լինել PPA-ի նկատմամբ ավելի բարձր հանդուրժողականությամբ կամ PPA-ն որպես էներգիայի աղբյուր օգտագործելու ունակությամբ, ինչը, ինչպես ապացուցվել է, ճիշտ է առնվազն մեկ տեսակի՝ Hoylesella enocea-ի համար (Hitch et al., 2022): Այլընտրանքորեն, մոր կողմից PPA-ի ազդեցությունը կարող է խթանել պտղի զարգացումը՝ մկան սերնդի աղիքները ավելի զգայուն դարձնելով Bacteroidetes գաղութացման նկատմամբ. սակայն մեր ուսումնասիրության դիզայնը թույլ չի տվել նման գնահատական:
Մետագենոմիկ պարունակության գնահատումը բացահայտեց PPA-ի նյութափոխանակության և արտադրության հետ կապված գեների առատության զգալի տարբերություններ, որտեղ PPA-ի ազդեցության տակ գտնվող մկները ցուցաբերում էին PPA-ի արտադրության համար պատասխանատու գեների ավելի մեծ առատություն, մինչդեռ PPA-ի ազդեցության տակ չգտնվող մկները ցուցաբերում էին PAA-ի նյութափոխանակության համար պատասխանատու գեների ավելի մեծ առատություն (Նկար 6): Այս արդյունքները ենթադրում են, որ PPA-ի ազդեցությունը մանրէային կազմի վրա կարող է պայմանավորված չլինել միայն դրա օգտագործմամբ, հակառակ դեպքում PPA-ի նյութափոխանակության հետ կապված գեների առատությունը պետք է ավելի մեծ առատություն ցուցաբերեր PPA-ի ազդեցության տակ գտնվող մկների աղիքային միկրոբիոմում: Մեկ բացատրությունն այն է, որ PPA-ն միջնորդում է մանրէների առատությունը հիմնականում իր հակամանրէային ազդեցության միջոցով, այլ ոչ թե մանրէների կողմից որպես սննդանյութ օգտագործման միջոցով: Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ PPA-ն դեղաչափից կախված եղանակով կանխում է Salmonella Typhimurium-ի աճը (Jacobson et al., 2018): PPA-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաների ազդեցությունը կարող է ընտրել այն մանրէները, որոնք դիմացկուն են դրա հակամանրէային հատկություններին և կարող են պարտադիր չէ, որ կարողանան այն նյութափոխանակել կամ արտադրել: Օրինակ՝ Parabacteroides-ի մի քանի տեսակներ PPA նմուշներում ցուցաբերել են զգալիորեն ավելի բարձր առատություն, սակայն PPA-ի նյութափոխանակության կամ արտադրության հետ կապված գեներ չեն հայտնաբերվել (Լրացուցիչ աղյուսակներ 2, 4 և 5): Ավելին, PPA-ի արտադրությունը որպես խմորման ենթամթերք լայնորեն տարածված է տարբեր մանրէների շրջանում (Gonzalez-Garcia et al., 2017): Ավելի բարձր մանրէային բազմազանությունը կարող է լինել PPA-ի նյութափոխանակության հետ կապված գեների ավելի բարձր առատության պատճառը վերահսկիչ նմուշներում (Averina et al., 2020): Ավելին, 1332 գեներից միայն 27-ը (2.14%) են կանխատեսվել որպես PPA-ի նյութափոխանակության հետ կապված գեներ: PPA-ի նյութափոխանակության հետ կապված շատ գեներ ներգրավված են նաև այլ նյութափոխանակության ուղիներում: Սա ևս մեկ անգամ ցույց է տալիս, որ PPA-ի նյութափոխանակությանը մասնակցող գեների առատությունն ավելի բարձր էր վերահսկիչ նմուշներում. այս գեները կարող են գործել այնպիսի ուղիներում, որոնք չեն հանգեցնում PPA-ի օգտագործման կամ ձևավորման որպես ենթամթերք: Այս դեպքում PPA-ի առաջացման հետ կապված միայն մեկ գեն ցույց է տվել առատության զգալի տարբերություններ նմուշների տեսակների միջև: Ի տարբերություն PPA-ի նյութափոխանակության հետ կապված գեների, PPA-ի արտադրության մարկերային գեները ընտրվել են, քանի որ դրանք անմիջականորեն ներգրավված են PPA-ի արտադրության բակտերիալ ուղու մեջ: PPA-ի ազդեցության տակ գտնվող մկների մոտ բոլոր տեսակների մոտ հայտնաբերվել է PPA-ի արտադրության առատության և կարողության զգալի աճ: Սա հաստատում է այն կանխատեսումը, որ PPA-ները կընտրեն PPA արտադրողներին և, հետևաբար, կանխատեսում են, որ PPA-ի արտադրության կարողությունը կաճի: Այնուամենայնիվ, գեների առատությունը պարտադիր չէ, որ կապված լինի գեների արտահայտման հետ. այսպիսով, չնայած PPA-ի նյութափոխանակության հետ կապված գեների առատությունն ավելի բարձր է վերահսկիչ նմուշներում, արտահայտման արագությունը կարող է տարբեր լինել (Shi et al., 2014): PPA արտադրող գեների տարածվածության և PPA-ի արտադրության միջև կապը հաստատելու համար անհրաժեշտ են PPA-ի արտադրությանը մասնակցող գեների արտահայտման ուսումնասիրություններ:
PPA-ի և վերահսկիչ մետագենոմների ֆունկցիոնալ անոտացիան բացահայտեց որոշ տարբերություններ: Գեների պարունակության PCA վերլուծությունը բացահայտեց PPA-ի և վերահսկիչ նմուշների միջև առանձին կլաստերներ (Նկար 5): Նմուշի ներսում կլաստերացումը ցույց տվեց, որ վերահսկիչ գեների պարունակությունն ավելի բազմազան էր, մինչդեռ PPA նմուշները կլաստերացված էին միասին: Գեների պարունակությամբ կլաստերացումը համեմատելի էր տեսակների կազմով կլաստերացման հետ: Այսպիսով, ուղիների առատության տարբերությունները համապատասխանում են դրանց մեջ որոշակի տեսակների և շտամների առատության փոփոխություններին: PPA նմուշներում զգալիորեն ավելի բարձր առատությամբ երկու ուղիները կապված էին ամինաշաքարի/նուկլեոտիդային շաքարի նյութափոխանակության (ko:K21279) և լիպիդային նյութափոխանակության բազմակի ուղիների հետ (ko:K00647, ko:K03801; Լրացուցիչ աղյուսակ 3): Հայտնի է, որ ko:K21279-ի հետ կապված գեները կապված են Bacteroides ցեղի հետ, որը PPA նմուշներում զգալիորեն ավելի շատ տեսակներ ունեցող ցեղերից մեկն է: Այս ֆերմենտը կարող է խուսափել իմունային պատասխանից՝ արտահայտելով պարկուճային պոլիսախարիդներ (Wang et al., 2008): Սա կարող է բացատրել PPA-ի ազդեցության տակ գտնվող մկների մոտ դիտարկվող Bacteroidetes-ի աճը: Սա լրացնում է PPA միկրոբիոմում դիտարկվող ճարպաթթուների սինթեզի աճը: Բակտերիաները օգտագործում են FASIIko:K00647 (fabB) ուղին՝ ճարպաթթուներ արտադրելու համար, որոնք կարող են ազդել տիրոջ նյութափոխանակության ուղիների վրա (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), և լիպիդային նյութափոխանակության փոփոխությունները կարող են դեր ունենալ նյարդային զարգացման մեջ (Yu et al., 2020): PPA նմուշներում առատության աճ ցույց տվող մեկ այլ ուղի ստերոիդային հորմոնների կենսասինթեզն է (ko:K12343): Աճող ապացույցներ կան, որ աղիքային միկրոբիոտայի հորմոնների մակարդակին ազդելու և հորմոններից ազդվելու ունակության միջև կա հակադարձ կապ, այնպես որ ստերոիդների բարձր մակարդակը կարող է հետևանքներ ունենալ առողջության վրա (Tetel et al., 2018):
Այս ուսումնասիրությունը սահմանափակումներից և նկատառումներից զերծ չէ։ Կարևոր տարբերությունն այն է, որ մենք կենդանիների ֆիզիոլոգիական գնահատումներ չենք կատարել։ Հետևաբար, հնարավոր չէ ուղղակիորեն եզրակացնել, թե արդյոք միկրոբիոմի փոփոխությունները կապված են որևէ հիվանդության հետ։ Մեկ այլ նկատառում այն ​​է, որ այս ուսումնասիրության մեջ մկները կերակրվել են նույն սննդակարգով, ինչ իրենց մայրերը։ Ապագա ուսումնասիրությունները կարող են որոշել, թե արդյոք PPA-ով հարուստ սննդակարգից PPA-ից զերծ սննդակարգի անցումը բարելավում է դրա ազդեցությունը միկրոբիոմի վրա։ Մեր ուսումնասիրության, ինչպես շատ այլ ուսումնասիրությունների, սահմանափակումներից մեկը նմուշի սահմանափակ չափն է։ Չնայած կարելի է հիմնավոր եզրակացություններ անել, ավելի մեծ նմուշի չափը ավելի մեծ վիճակագրական հզորություն կապահովի արդյունքները վերլուծելիս։ Մենք նաև զգուշավոր ենք աղիքային միկրոբիոմի փոփոխությունների և որևէ հիվանդության միջև կապի վերաբերյալ եզրակացություններ անելու հարցում (Yap et al., 2021): Տարիքը, սեռը և սննդակարգը ներառող շփոթեցնող գործոնները կարող են զգալիորեն ազդել միկրոօրգանիզմների կազմի վրա։ Այս գործոնները կարող են բացատրել գրականության մեջ դիտարկվող անհամապատասխանությունները՝ աղիքային միկրոբիոմի և բարդ հիվանդությունների կապի վերաբերյալ (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023): Օրինակ, Bacteroidetes ցեղի ներկայացուցիչների քանակը աուտիզմի սպեկտրի խանգարում (ԱՍԽ) ունեցող կենդանիների և մարդկանց մոտ կամ աճել է, կամ նվազել (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017): Նմանապես, աղիքային բորբոքային հիվանդություններով հիվանդների մոտ աղիքային կազմի ուսումնասիրությունները նույն տաքսոններում հայտնաբերել են ինչպես աճ, այնպես էլ նվազում (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023): Սեռական կողմնակալության ազդեցությունը սահմանափակելու համար մենք փորձել ենք ապահովել սեռերի հավասար ներկայացվածություն, որպեսզի տարբերությունները, ամենայն հավանականությամբ, պայմանավորված լինեն սննդակարգով: Ֆունկցիոնալ ծանոթագրության մարտահրավերներից մեկը ավելորդ գեների հաջորդականությունների հեռացումն է: Մեր գեների կլաստերացման մեթոդը պահանջում է 95% հաջորդականության նույնականություն և 85% երկարության նմանություն, ինչպես նաև 90% համընկնում կեղծ կլաստերացումը վերացնելու համար: Այնուամենայնիվ, որոշ դեպքերում մենք դիտարկել ենք նույն ծանոթագրություններով COG-ներ (օրինակ՝ MUT) (Նկար 6): Անհրաժեշտ են հետագա ուսումնասիրություններ՝ որոշելու համար, թե արդյոք այս օրթոլոգները տարբեր են, կապված են որոշակի սեռերի հետ, թե՞ սա գեների կլաստերացման մոտեցման սահմանափակում է: Ֆունկցիոնալ ծանոթագրության մեկ այլ սահմանափակում է հնարավոր սխալ դասակարգումը. mmdA բակտերիալ գենը հայտնի ֆերմենտ է, որը մասնակցում է պրոպիոնատի սինթեզին, բայց KEGG-ն այն չի կապում պրոպիոնատի նյութափոխանակության ուղու հետ: Ի տարբերություն դրա, scpB և mmcD օրթոլոգները կապված են: Նշանակված նոկաուտներ չունեցող գեների մեծ քանակը կարող է հանգեցնել PPA-ի հետ կապված գեների նույնականացման անկարողությանը՝ գեների առատությունը գնահատելիս: Ապագա ուսումնասիրությունները կօգտվեն մետատրանսկրիպտոմային վերլուծությունից, որը կարող է ավելի խորը հասկանալ աղիքային միկրոբիոտայի ֆունկցիոնալ բնութագրերը և կապել գեների արտահայտությունը հնարավոր հետագա ազդեցությունների հետ: Հատուկ նյարդա-զարգացման խանգարումներ կամ բորբոքային աղիքային հիվանդություններ ներառող ուսումնասիրությունների համար անհրաժեշտ են կենդանիների ֆիզիոլոգիական և վարքային գնահատականներ՝ միկրոբիոմի կազմի փոփոխությունները այս խանգարումների հետ կապելու համար: Աղիքային միկրոբիոմի մանրէազերծ մկների մեջ փոխպատվաստման վերաբերյալ լրացուցիչ ուսումնասիրություններ նույնպես օգտակար կլինեն՝ որոշելու համար, թե արդյոք միկրոբիոմը հիվանդության շարժիչ ուժ է կամ բնութագիր:
Ամփոփելով՝ մենք ցույց տվեցինք, որ սննդային PPA-ն գործում է որպես աղիքային միկրոբիոտայի կազմի փոփոխության գործոն: PPA-ն FDA-ի կողմից հաստատված պահպանիչ է, որը լայնորեն հանդիպում է տարբեր սննդամթերքներում և երկարատև ազդեցության դեպքում կարող է հանգեցնել նորմալ աղիքային միկրոֆլորայի խանգարման: Մենք հայտնաբերեցինք մի քանի մանրէների առատության փոփոխություններ, ինչը ենթադրում է, որ PPA-ն կարող է ազդել աղիքային միկրոբիոտայի կազմի վրա: Միկրոբիոտայի փոփոխությունները կարող են հանգեցնել որոշակի նյութափոխանակության ուղիների մակարդակների փոփոխությունների, որոնք կարող են հանգեցնել ֆիզիոլոգիական փոփոխությունների, որոնք կարևոր են տիրոջ առողջության համար: Անհրաժեշտ են հետագա ուսումնասիրություններ՝ որոշելու համար, թե արդյոք սննդային PPA-ի ազդեցությունը մանրէային կազմի վրա կարող է հանգեցնել դիսբիոզի կամ այլ հիվանդությունների: Այս ուսումնասիրությունը հիմք է դնում ապագա ուսումնասիրությունների համար այն մասին, թե ինչպես կարող է PPA-ի ազդեցությունը աղիքային կազմի վրա ազդել մարդու առողջության վրա:
Այս ուսումնասիրության մեջ ներկայացված տվյալների հավաքածուները հասանելի են առցանց պահոցներում: Պահոցի անվանումը և մուտքի համարն են՝ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431:
Այս կենդանիների վրա կատարված ուսումնասիրությունը հաստատվել է Կենտրոնական Ֆլորիդայի համալսարանի կենդանիների խնամքի և օգտագործման ինստիտուցիոնալ կոմիտեի (UCF-IACUC) կողմից (կենդանիների օգտագործման թույլտվության համար՝ PROTO202000002): Այս ուսումնասիրությունը համապատասխանում է տեղական օրենքներին, կանոնակարգերին և ինստիտուցիոնալ պահանջներին:
ՀԳ՝ Հայեցակարգավորում, Տվյալների հավաքագրում, Ֆորմալ վերլուծություն, Հետազոտություն, Մեթոդաբանություն, Ծրագրային ապահովում, Վիզուալիզացիա, Գրել (սկզբնական նախագիծ), Գրել (վերանայում և խմբագրում): ԼԱ՝ Հայեցակարգավորում, Տվյալների հավաքագրում, Մեթոդաբանություն, Ռեսուրսներ, Գրել (վերանայում և խմբագրում): ՇՀ՝ Ֆորմալ վերլուծություն, Ծրագրային ապահովում, Գրել (վերանայում և խմբագրում): ՀԱ՝ Հետաքննություն, Գրել (վերանայում և խմբագրում): Գլխավոր դատավոր՝ Հետաքննություն, Գրել (վերանայում և խմբագրում): ՀԱ՝ Հայեցակարգավորում, Նախագծի կառավարում, Ռեսուրսներ, Վերահսկողություն, Գրել (վերանայում և խմբագրում): ՏԱ՝ Հայեցակարգավորում, Նախագծի կառավարում, Վերահսկողություն, Գրել (վերանայում և խմբագրում):
Հեղինակները հայտարարել են, որ իրենք որևէ ֆինանսական աջակցություն չեն ստացել այս հոդվածի հետազոտության, հեղինակության և/կամ հրապարակման համար։
Հեղինակները հայտարարում են, որ հետազոտությունը անցկացվել է որևէ առևտրային կամ ֆինանսական հարաբերությունների բացակայության պայմաններում, որոնք կարող են մեկնաբանվել որպես շահերի հնարավոր բախում: Կիրառելի չէ:
Այս հոդվածում արտահայտված բոլոր կարծիքները պատկանում են միայն հեղինակներին և պարտադիր չէ, որ արտացոլեն իրենց հաստատությունների, հրատարակիչների, խմբագիրների կամ գրախոսների տեսակետները: Այս հոդվածում գնահատված որևէ ապրանք կամ դրանց արտադրողների կողմից ներկայացված որևէ պնդում չի երաշխավորվում կամ հաստատվում հրատարակչի կողմից:
Այս հոդվածի լրացուցիչ նյութերը կարող եք գտնել առցանց՝ https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Աբդելլի ԼՍ, Սամսամ Ա, Նասեր ՍԱ (2019): Պրոպիոնաթթուն առաջացնում է գլիոզ և նեյրոբորբոքում՝ կարգավորելով PTEN/AKT ուղին աուտիզմի սպեկտրի խանգարումների դեպքում: Գիտական ​​զեկույցներ 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Աիչիսոն, Ջ. (1982): Կոմպոզիցիոն տվյալների վիճակագրական վերլուծություն: JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ահն Ջ., Կվոն Հ., Կիմ Յ.Ջ. (2023): Firmicutes/Bacteroidetes հարաբերակցությունը որպես կրծքագեղձի քաղցկեղի ռիսկի գործոն: Կլինիկական բժշկության հանդես, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Անդերս Ս., Հուբեր Վ. (2010): Հաջորդականության հաշվարկի տվյալների դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծություն: Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Անջելիս, Մ.Դ., Պիկկոլո, Մ., Վաննինի, Լ., Սիրագուսա, Ս., Ջակոմո, Ա.Դ., Սերազանետի, Դ.Ի. և այլք (2013): Աուտիզմով և այլ կերպ չնշված տարածված զարգացման խանգարում ունեցող երեխաների կղանքի միկրոբիոտան և մետաբոլոմը: PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Ավերինա Օ.Վ., Կովտուն Ա.Ս., Պոլյակովա Ս.Ի., Սավիլովա Ա.Մ., Ռեբրիկով Դ.Վ., Դանիլենկո Վ.Ն. (2020): Աուտիզմի սպեկտրի խանգարումներ ունեցող փոքր երեխաների աղիքային միկրոբիոտայի բակտերիալ նեյրոմետաբոլիկ բնութագրերը: Բժշկական մանրէաբանության հանդես 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Բակերո Ֆ., Նոմբելա Կ. (2012): Միկրոբիոմը որպես մարդու օրգան: Կլինիկական մանրէաբանություն և վարակ 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Բաուր Տ., Դյուրե Պ. (2023): Պրոպիոնաթթու արտադրող մանրէների ֆիզիոլոգիայի վերաբերյալ նոր պատկերացումներ. Anaerotignum propionicum և Anaerotignum neopropionicum (նախկինում՝ Clostridium propionicum և Clostridium neopropionicum): Միկրոօրգանիզմներ 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004): Մայրական սնուցում և պտղի զարգացում. J Nutr. 134, 2169–2172 թթ. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Բենջամինի, Յ., և Հոչբերգ, Ջ. (1995): Կեղծ դրական արդյունքների մակարդակի վերահսկում. բազմակի թեստավորման գործնական և արդյունավետ մոտեցում: JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x