Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակը սահմանափակ աջակցություն ունի CSS-ի համար: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Ի տարբերություն ողնաշարավորների, միջատները լայնորեն կարծում են, որ չունեն արուների կողմից կողմնակալ սեռական ստերոիդային հորմոններ: Anopheles gambiae-ի մոտ էկդիզոն ստերոիդ 20-հիդրօքսիէկդիզոնը (20E) էվոլյուցիայի է ենթարկվել՝ վերահսկելու ձվի զարգացումը, երբ այն սինթեզվում է էգերի կողմից2 և առաջացնելու զուգավորման ռեֆրակտորային շրջան, երբ այն սեռական ճանապարհով փոխանցվում է արուների կողմից3: Քանի որ ձվի զարգացումը և զուգավորումը վերարտադրողականության կարևոր հատկանիշներ են, հասկանալը, թե ինչպես են էգ Anopheles մոծակները ինտեգրում այս հորմոնալ ազդանշանները, կարող է նպաստել մալարիայի դեմ պայքարի նոր ծրագրերի մշակմանը: Այստեղ մենք բացահայտում ենք, որ այս վերարտադրողական գործառույթները կարգավորվում են տարբեր սեռական ստերոիդներով՝ էկդիստերոիդները ակտիվացնող/անգործունակացնող ֆերմենտների բարդ ցանցի միջոցով: Մենք հայտնաբերել ենք արուների համար հատուկ օքսիդացված էկդիզոն՝ 3-դեհիդրո-20E (3D20E), որը պաշտպանում է ծագումը՝ անջատելով էգի սեռական ընկալունակությունը սեռական փոխանցումից և ակտիվացումից հետո՝ դեֆոսֆորիլացման միջոցով: Նշենք, որ 3D20E փոխանցումը նաև առաջացրել է վերարտադրողական գեների արտահայտությունը, որոնք պահպանում են ձվի զարգացումը Plasmodium վարակի ժամանակ՝ ապահովելով վարակված էգերի առողջությունը: Էգերից ստացված 20E-ն չի առաջացնում սեռական... արձագանքը, սակայն թույլ է տալիս զուգավորման փուլում գտնվող անհատներին ձվադրել 20E-արգելակող կինազների արգելակումից հետո: Այս արու-սպեցիֆիկ միջատների ստերոիդային հորմոնի նույնականացումը և դրա դերը կանանց սեռական ընկալունակության, պտղաբերության և պլազմոդիումի հետ փոխազդեցության կարգավորման գործում ենթադրում է մալարիա փոխանցող մոծակների վերարտադրողական հաջողությունը նվազեցնելու ներուժ:
Մալարիայի դեպքերը և մահացությունները կրկին աճում են4՝ մարդու մալարիայի մակաբույծների միակ տարածող Anopheles մոծակների լայն տարածում ունեցող միջատասպանների նկատմամբ դիմադրողականության պատճառով: Այս մոծակների զուգավորման կենսաբանությունը հատկապես գրավիչ թիրախ է մալարիայի դեմ պայքարի նոր միջամտությունների համար, քանի որ էգերը զուգավորվում են միայն մեկ անգամ5. այս միակ զուգավորման դեպքը ստերիլ դարձնելը մեծ ներուժ կունենա դաշտում մոծակների պոպուլյացիաները նվազեցնելու համար:
Կանայք սեռական անգործունակ են դառնում տղամարդկանցից բարձր տիտրով ստերոիդային հորմոններ ստանալուց հետո: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ հետագա զուգավորման դժվարությունների պատճառը 20-հիդրօքսիէկդիսոնն է (20E), որը ստերոիդային հորմոն է, որն ավելի հայտնի է որպես թրթուրային փուլում մետաքսման ցիկլի կարգավորիչ: Արուների 20E-ն սինթեզելու և փոխանցելու ունակությունը զարգացել է հատկապես Anopheles տեսակների մոտ, որոնք Cellia7 ենթասեռի մասն են կազմում, որը տարածված է Աֆրիկայում և ներառում է մալարիայի ամենավտանգավոր վեկտորները, այդ թվում՝ Anopheles gambiae-ն: Սա հատկապես ուշագրավ է, քանի որ այս տեսակների էգերը նույնպես 20E են արտադրում յուրաքանչյուր արյան ընդունումից հետո, և 20E-ն մղում է ձվագենեզի ցիկլը (տե՛ս հղում 8): Այնուամենայնիվ, քիչ բան է հայտնի այն մասին, թե ինչպես են էգերը ինտեգրում էկդիսոնի երկու տարբեր աղբյուրներից (արուների փոխանցում և արյան սնուցման ինդուկցիա) ստացված ազդանշանները՝ առանց վտանգելու իրենց զուգավորման ունակությունը: Փաստորեն, եթե էգերի կողմից արտադրված 20E-ն առաջացնում է սեռական անհանդուրժողականություն, դա կույս կերակրող անհատների մոտ կհանգեցնի անպտղության, ինչը շատ տարածված վարքագիծ է այս մոծակների մոտ:
Հնարավոր բացատրությունն այն է, որ A. gambiae արուները փոխանցում են արուներին հատուկ մոդիֆիկացված էկդիսոն, որը ակտիվացնում է ազդանշանային կասկադը էգի վերարտադրողական համակարգում, ինչը հանգեցնում է զուգավորման անկայունության: Այնուամենայնիվ, չնայած ողնաշարավորներն ունեն բազմաթիվ ստերոիդային հորմոններ, ինչպիսիք են էստրոգենը և անդրոգենը (վերանայված է 9-րդ հղումով), մեր իմացության չափով, անդրոգենային կողմնակալ ստերոիդներ չեն հայտնաբերվել միջատների մոտ:
Մենք որոշեցինք որոշել սեռական հասուն A. gambiae-ի արական լրացուցիչ գեղձում (MAG) ստերոիդային հորմոնների ցանկը՝ հնարավոր փոփոխող ստերոիդներ փնտրելու համար: Օգտագործելով բարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆիա՝ զուգակցված տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (HPLC-MS/MS) հետ, նախկինում օգտագործված ավելի քիչ սպեցիֆիկ մեթոդի փոխարեն, մենք այս հյուսվածքում հայտնաբերեցինք էկդիսոն (E) և 20E՝ հաստատելով նախորդ արդյունքը: Այնուամենայնիվ, նմուշում գերակշռում էին օքսիդացված ֆոսֆորիլացված ստերոիդները, որոնք համապատասխանում էին 3-դեհիդրո-20E-22-ֆոսֆատ (3D20E22P)12 բանաձևին (Նկար 1): Այլ ձևերից են 3-դեհիդրո-20E (3D20E) և 20E-22-ֆոսֆատ (20E22P): 3D20E22P-ի HPLC-MS/MS ազդանշանի ինտենսիվությունը երկու կարգի մեծությամբ ավելի բարձր էր, քան դրա դեֆոսֆորիլացված ձևը՝ 3D20E-ն, և երեք կարգի մեծությամբ ավելի բարձր, քան E-ին և 20E-ինը (Նկար 1): Չնայած մարմնի այլ մասերում և ստորին հատվածներում... վերարտադրողական համակարգ (LRT; ընդլայնված տվյալներ՝ նկ. 1ա): Մենք նաև վերլուծել ենք էկդիստերոիդները նոր փակված (<1 օրական) արուների և էգերի մոտ և հայտնաբերել ենք 3D20E և 3D20E22P միայն MAG-ում. E, 20E և 20E22P-ն առկա էին երկու սեռերի մոտ (ընդլայնված տվյալներ՝ նկ. 1բ): Այս տվյալները ենթադրում են, որ A. gambiae չափահաս արուները իրենց MAG-ներում արտադրում են մոդիֆիկացնող հորմոնների բարձր տիտրեր, որոնք էգերի կողմից չեն սինթեզվում:
MAG-ը և էգ LRT-ն (ներառյալ նախասրտերը, սերմնաբշտիկները և պարովարիումը) դիսեկցիայի ենթարկվեցին 4 օրական (4-օրական) կույս արուներից և կույս ու զուգավորված էգերից (0.5, 3 և 12 hpm): Այս հյուսվածքներում էկդիսոնը վերլուծվել է HPLC-MS/MS մեթոդով (միջին ± sem; չզույգված t-թեստ, երկկողմանի, կեղծ հայտնաբերման մակարդակ (FDR) շտկված; NS, ոչ նշանակալի; *P < 0.05, **P < 0.01: 3D20E: 3 ժամ ընդդեմ 0.5 ժամի, P = 0.035; 12 ժամ ընդդեմ 3 ժամի, P = 0.0015; 12 ժամ ընդդեմ 0.5 ժամի, P = 0.030: 3D20E22P: 3 ժամ ընդդեմ 0.5 ժամի, P = 0.25; 12 ժամ ընդդեմ 3 ժամի, P = 0.0032; 12 ժամ ընդդեմ 0.5 ժամի, P = 0.015): Տվյալները վերցված են երեք կենսաբանական կրկնօրինակներից: Հետաքրքրության առարկա յուրաքանչյուր էկդիզոնի գագաթնակետային մակերեսը հաշվարկվել և նորմալացվել է մոծակների քանակով: Էկդիզոնը ներկայացված է հետևյալ գույնով՝ E՝ կանաչ; 20E՝ նարնջագույն; 20E22P՝ մանուշակագույն; 3D20E՝ կապույտ; 3D20E22P՝ վարդագույն: Ներդիրը մեծացնում է y-առանցքի վրա սանդղակը՝ էկդիզոնի ավելի ցածր մակարդակները ցույց տալու համար:
Հետազոտելու համար, թե արդյոք 3D20E22P-ն և 3D20E-ն փոխանցվում են զուգավորման ընթացքում, մենք դիսեկցիայի ենթարկեցինք էգ LRT-ները զուգավորումից հետո տարբեր ժամանակային կետերում: Չնայած կույսերի մոտ էկդիզոն չհայտնաբերվեց, մենք նկատեցինք 3D20E22P-ի զգալի քանակություն LRT-ում զուգավորումից անմիջապես հետո (զուգավորումից 0.5 ժամ անց, hpm), որը ժամանակի ընթացքում նվազում էր, մինչդեռ 3D20E-ի մակարդակը զգալիորեն աճում էր (Նկար 1): Քիմիապես սինթեզված 3D20E-ն որպես ստանդարտ օգտագործելով՝ մենք որոշեցինք, որ այս ստերոիդային հորմոնի մակարդակը զուգավորման LRT-ներում առնվազն 100 անգամ ավելի բարձր էր, քան 20E-ն (Ընդլայնված տվյալների աղյուսակ 1): Այսպիսով, 3D20E22P-ն հիմնական արու էկդիզոնն է, որը փոխանցվում է էգ LRT-ին զուգավորման ընթացքում, և դրա դեֆոսֆորիլացված ձևը՝ 3D20E-ն, զուգավորումից կարճ ժամանակ անց դառնում է շատ առատ: Սա ենթադրում է վերջին էկդիզոնի կարևոր դերը էգի հետզուգավորման կենսաբանության մեջ:
Նոր RNA հաջորդականության (RNA-seq) տվյալների հավաքածու ստեղծելուց (Նկար 2ա) հետո, օգտագործելով հատուկ կառուցված կենսաինֆորմատիկական խողովակաշար, մենք որոնեցինք էկդիսոն կինազը (EcK), էկդիսոն օքսիդազը (EO) և էկդիսոնը, որը կոդավորում է 20E-մոդիֆիկացված ֆոսֆատազի գենը։ EPP-ն արտահայտվում է վերարտադրողական հյուսվածքներում։ Մենք նույնականացրեցինք մեկ թեկնածու EPP գեն և երկու պոտենցիալ EcK գեներ (EcK1 և EcK2), բայց չկարողացանք գտնել լավ թեկնածու EO գեն։ Հատկանշական է, որ առանձին EPP գեները արտահայտվել են բարձր մակարդակներով (98.9-րդ պերսենտիլ) Գամբիական MAG-ներում, բայց ոչ էգերի LRT-ներում (Նկար 2բ), հակառակ մեր սպասումներին, քանի որ 3D20E22P-ի դեֆոսֆորիլացումը տեղի է ունեցել այս էգերի հյուսվածքում։ Հետևաբար, մենք կարծում ենք, որ արական EPP-ն կարող է փոխանցվել զուգավորման ընթացքում։ Իրոք, մենք օգտագործել ենք in vivo կայուն իզոտոպների պիտակավորում՝ զուգավորումից հետո էգերի սպիտակուցը քողարկելու համար, որը էգերի նախասրտում MS-ով նույնականացված ֆերմենտ է (Նկար 2գ և Լրացուցիչ աղյուսակ 1): EPP-ի առկայությունը MAG-ում և զուգավորված (բայց ոչ կույս) էգ LRT-ում նույնպես հաստատվել է հատուկ հակամարմինների միջոցով (Նկար 2դ):
ա, Պատվերով կառուցված կենսաինֆորմատիկական խողովակաշար՝ յուրաքանչյուր սեռի վերարտադրողական հյուսվածքներում EcKs, EOs և EPPs կոդավորող գեների որոնման համար: Սլաքների կողքին գտնվող թվերը ցույց են տալիս արու և իգական սեռի թեկնածուների քանակը յուրաքանչյուր քայլում: Այս վերլուծությունը նույնականացրել է մեկ EPP գեն (EPP) և մեկ EcK գեն (EcK1), որոնք արտահայտվում են արուների մոտ, և մեկ EcK գեն (EcK2), որը արտահայտվում է երկու սեռերում էլ, բայց չի տալիս թեկնածու EO գեն: բ, Ջերմային քարտեզ, որը համեմատում է թեկնածու գեների արտահայտությունը կույս (V) և զուգավորման (M) Anopheles gambiae և Anopheles albicans հյուսվածքներում: Spca, բեղմնավորում; MAGs, լրացուցիչ գեղձեր արուների մոտ: մարմնի այլ մասեր, այդ թվում՝ կրծքերը, թևերը, ոտքերը, ճարպային մարմինները և ներքին օրգանները երկու սեռերի մոտ, իսկ ձվարանները՝ էգերի մոտ: EcK2-ը բարձր արտահայտված է Գամբիայի և՛ MAG-ում, և՛ նախասրտերում, մինչդեռ EPP-ն հանդիպում է միայն MAG-ում: c, արու սերմնաժայթքման խմբի տեղափոխման պրոտեոմիկ վերլուծություն էգերի նախասրտերի մեջ 3, 12 և 24 hpm արագությամբ, որը ցույց է տալիս 67 ամենատարածված սպիտակուցները: Էգերը մեծացել են բոլոր սպիտակուցները նշագրելու (և քողարկելու) համար 15N պարունակող սննդակարգով: Չնշագրված արուները զուգավորվել են նշագրված էգերի հետ, իսկ էգերի LRT-ները դիսեկցվել են 3, 12 և 24 hpm արագությամբ՝ պրոտեոմիկ վերլուծության համար (տե՛ս լրացուցիչ աղյուսակ 1-ը՝ սերմնաժայթքման սպիտակուցների ամբողջական ցանկի համար): Ներդիրում EPP, Eck1 և EcK2 հայտնաբերվել են կույս արուների MAG-ում՝ այս հյուսվածքների պրոտեոմիկ վերլուծության միջոցով: d, EPP-ն հայտնաբերվել է Western blot-ի միջոցով զուգավորված էգերի MAG-ում և LRT-ում, բայց ոչ կույս էգերի կամ արուների կամ էգի մնացած մասի մոտ: մարմին։ Մեմբրանները միաժամանակ հետազոտվել են հակաակտինային (բեռնման վերահսկողություն) և հակա-EPP հակամարմիններով։ Բոլոր արուները կույսեր են։ Գելի աղբյուրի տվյալների համար տե՛ս լրացուցիչ նկար 1-ը։ Western blots-ը կատարվել է երկու անգամ՝ նմանատիպ արդյունքներով։
EPP-ի էկդիստերոիդ ֆոսֆոֆոսֆատազային ակտիվությունը ստուգվել է HPLC-MS/MS մեթոդով ինկուբացիայից հետո՝ MAG-ից անջատված 3D20E22P-ով (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 2ա): Ավելին, երբ մենք լռեցրինք EPP-ն ՌՆԹ-միջնորդավորված ինտերֆերենցիայի (RNAi) միջոցով, մենք հայտնաբերեցինք ֆոսֆատազային ակտիվության ուժեղ նվազում այս արուների վերարտադրողական հյուսվածքներում (Նկար 3ա), և EPP-լռեցված արուների հետ զուգավորված էգերը ցույց տվեցին դեֆոսֆորիլացված 3D20E-ի զգալիորեն ցածր համամասնություն (Նկար 3բ)՝ չնայած գեների մասնակի լռեցմանը (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 2բ,գ): Ի տարբերություն դրա, մենք նույն մոծակների մոտ չհայտնաբերեցինք 20E22P/20E հարաբերակցության նշանակալի փոփոխություններ, ինչը կարող է ենթադրել, որ ֆերմենտը յուրահատուկ է 3D20E22P-ի համար (Նկար 3բ):
ա, MAG-ում ֆոսֆատազի ակտիվության նվազում՝ պայմանավորված EPP լռեցմամբ՝ օգտագործելով երկշղթա EPP RNA (dsEPP) կամ երկշղթա GFP RNA (dsGFP) վերահսկիչներ: Յուրաքանչյուր կրկնօրինակում օգտագործվել է քսան MAG խումբ (P = 0.0046, զույգ t-փորձարկում, երկկողմանի), որոնք ներկայացված են առանձին կետերով: բ, EPP-լռեցված արուների հետ զուգավորված էգերը ունեցել են դեֆոսֆորիլացված 3D20E-ի զգալիորեն ցածր համամասնություն 3 հպմ-ում (P = 0.0043, չզույգված t-փորձարկում, երկկողմանի), մինչդեռ 20E մակարդակները չեն ազդվել (P = 0.063, չզույգված): t-թեստ, երկկողմանի): Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± սեմ՝ յուրաքանչյուրը 13, 16 և 19 էգից բաղկացած երեք խմբերից:c, EPP-լռեցված արուների հետ զուգավորված էգերը ունեցել են վերազուգավորման զգալիորեն ավելի բարձր ցուցանիշներ (P = 0.0002, Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ, երկկողմանի): Էգերին նախ ստիպել են զուգավորվել՝ իրենց զուգավորման կարգավիճակը ապահովելու համար։ 2 օր անց նրանք կապ հաստատեցին տրանսգենային սերմ կրող այլ արուների հետ՝ տրանսգենի քանակական ՊՇՌ հայտնաբերման միջոցով վերաբեղմնավորման մակարդակը գնահատելու համար: d: EPP-լռեցված արուների հետ զուգավորվող արյունով կերակրվող էգերը զգալիորեն նվազեցրել են բերրիությունը (P < 0.0001; Մանն-Ուիթնիի թեստ, երկկողմանի) և ձվերի քանակը փոքր-ինչ նվազեցրել (P = 0.088, Մանն-Ուիթնիի թեստ, երկկողմանի), մինչդեռ ձվադրման մակարդակը չի ազդվել (P = 0.94, Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ, երկկողմանի): Բոլոր վահանակներում n-ը ներկայացնում է կենսաբանորեն անկախ մոծակների նմուշների քանակը: NS, նշանակալի չէ:*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001:
Հաջորդը, մենք գնահատեցինք, թե արդյոք էկդիզոնի դեֆոսֆորիլացումը կարևոր է էգերի մոտ զուգավորման դիմադրության առաջացման համար: Հատկանշական է, որ EPP-ից զուրկ արուների հետ զուգավորվող էգերը վերազուգավորվել են շատ ավելի բարձր հաճախականությամբ (44.9%), քան վերահսկիչ էգերը (10.4%), երբ ենթարկվել են լրացուցիչ (տրանսգենային) արուների (Նկար 3գ): Մենք նաև նկատել ենք բերրիության զգալի նվազում (Նկար 3դ, ձախ կողմում) և այդ էգերի կողմից դրված ձվերի քանակի աննշան նվազում (Նկար 3դ, մեջտեղում), մինչդեռ էգերի կողմից դրված ձվերի տոկոսը (էգերի մոտ զուգավորման միջոցով առաջացած մեկ այլ արձագանք) չի ազդվել (Նկար 3դ, աջ կողմում): Հաշվի առնելով EPP-ի դիտարկված յուրահատկությունը 3D20E22P-ի համար, այս արդյունքները ենթադրում են, որ զուգավորման ընթացքում փոխանցվող EPP-ի կողմից 3D20E-ի ակտիվացումը կարող է կարևոր դեր ունենալ էգերի հետագա զուգավորման նկատմամբ ընկալունակությունը անջատելու գործում, մի վարքագիծ, որը նախկինում վերագրվում էր 20E-ի սեռական փոխանցմանը: Հետևաբար, այս արու-սպեցիֆիկ հորմոնը նույնպես ուժեղ ազդեցություն է ունենում էգերի բերրիության վրա:
Հաջորդը, մենք համեմատեցինք 20E-ի և 3D20E-ի ակտիվությունները սեռական հասուն կույսերի ներարկման փորձերի ժամանակ՝ օգտագործելով քիմիապես սինթեզված 3D20E (Նկար 4a-c) և առևտրային առումով մատչելի 20E: Մենք նկատեցինք, որ 3D20E-ն զգալիորեն ավելի արդյունավետ էր, քան 20E-ն՝ էգերի զուգավորման նկատմամբ զգայունությունը անջատելու հարցում երկու կոնցենտրացիաներում էլ (Նկար 4d): Հատկանշական է, որ LRT-ում 3D20E-ի ֆիզիոլոգիական մակարդակի կեսը (1,066 պգ ներարկումից հետո ընդդեմ 2,022 պգ զուգավորումից հետո) առաջացրել է ռեֆլեքսանտ էգերի այնպիսի համամասնություն, որը 20 անգամ ավելի բարձր էր, քան 20E-ի ֆիզիոլոգիական մակարդակը (361 պգ ներարկումից հետո)՝ ներարկումից 24 ժամ անց՝ ամենաբարձր՝ 18 պգ կոնցենտրացիայով զուգավորումից հետո: Ընդլայնված տվյալների աղյուսակ 1): Այս արդյունքը համապատասխանում է այն մտքին, որ 20E-ի սեռական փոխանցումը չի առաջացնում զուգավորման ռեֆրակտային շրջաններ, և հետագայում մատնանշում է 3D20E-ն որպես ծնող-երեխա հարաբերություններն ապահովելու հիմնական գործոն: 3D20E-ն նաև զգալիորեն ավելի ակտիվ էր, քան 20E-ն կույս էգերի ձվադրման փորձարկումներում (Նկար 4ե), ինչը ենթադրում է, որ EPP-ի մասնակի լռեցումից հետո մեր կողմից դիտարկված ձվադրման նորմալ մակարդակը պայմանավորված էր զուգավորման հետևանքով առաջացած էգ գործոնների կողմից դեռևս առաջացող 3D20E մնացորդային ակտիվության առկայությամբ:
(ա,բ) 3D20E-ն քիմիապես սինթեզվել է 20E-ից (ա)՝ շատ բարձր փոխակերպման/արդյունավետությամբ (տվյալները ներկայացված են որպես երեք անկախ սինթեզի ռեակցիաներից ստացված միջին ± սեմ) (բ).գ, զանգվածային սպեկտրը (ներքևի կեսը) ճշգրտորեն համապատասխանում է զուգավորված էգ LRT-ում հայտնաբերված էկդիսոնին (վերին կես):դ, համեմատած 20E-ի (0.63 մկգ, P = 0.02; 0.21 մկգ, P < 0.0001; Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ, երկկողմանի) և 10% էթանոլի (0.63 մկգ, P < 0.0001; 0.21 մկգ, P < 0.0001; Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ, երկկողմանի) հետ, մինչդեռ 20E-ն զգալիորեն ավելի բարձր էր, քան վերահսկիչ խումբը միայն ավելի բարձր դեղաչափերով (0.63 մկգ, P = 0.0002; 0.21 մկգ, P = 0.54; Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ, երկկողմանի):ե, 3D20E ներարկմամբ ինդուկցված Կույս էգերի մոտ ձվադրման զգալիորեն ավելի բարձր տեմպեր են արձանագրվել, քան 10% էթանոլ պարունակող վերահսկիչ խմբում (0.21 մկգ, P < 0.0001; 0.13 մկգ, P = 0.0003; Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ, երկկողմանի), մինչդեռ 20E-ն համեմատվել է վերահսկիչ խմբում միայն ավելի բարձր դեղաչափերով (0.21 մկգ, P = 0.022; 0.13 մկգ, P = 0.0823; Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ, երկկողմանի): 3D20E-ն առաջացրել է ձվադրման զգալիորեն ավելի բարձր տեմպեր, քան 20E-ն ավելի բարձր դեղաչափերով (0.21 մկգ, P = 0.0019; 0.13 մկգ, P = 0.075; Ֆիշերի ճշգրիտ թեստ, երկկողմանի): Բոլոր վահանակներում n-ը ներկայացնում է կենսաբանորեն անկախ մոծակների նմուշների քանակը: NS, նշանակալի չէ:*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001: Տվյալները վերցված են երեքից: կրկնօրինակում է։
Նախորդ ուսումնասիրություններում մենք պարզեցինք, որ ստերոիդային հորմոնների սեռական փոխանցումը առաջացնում է MISO-ի (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) արտահայտությունը, որը կանացի վերարտադրողական գեն է, որը պաշտպանում է A. gambiae էգերին P. falciparum վարակից։ 13-ը՝ մարդու մալարիայի ամենամահացու մակաբույծը, առողջության հետ կապված ծախսերի պատճառով է։ Հաշվի առնելով MISO-ի կարևորությունը մալարիայի էնդեմիկ տարածքներում Anopheles-ի վերարտադրողական պիտանիության համար, մենք որոշեցինք որոշել, թե որ հորմոնը՝ 3D20E-ն կամ 20E-ն է ակտիվացնում այս գենի արտահայտությունը։ Մենք պարզեցինք, որ մինչդեռ 20E ներարկումը հատուկ կամ ավելի հզոր կերպով ինդուկցրել է որոշ միջուկային հորմոնային ընկալիչներ (HR), ինչպիսիք են HR3-ը և HR4-ը, և տիպիկ ստերոիդային թիրախներ, ինչպիսիք են դեղնուց առաջացնող գեները Vg14, 15, 16, MISO-ն ավելի ուժեղ է ինդուկցվել 3D20E-ի կողմից (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 3)։ Այսպիսով, այս անդրոգենային ստերոիդային հորմոնի սեռական փոխանցումը, կարծես, առաջացնում է մեխանիզմներ, որոնք պաշտպանում են էգերին մակաբուծային վարակի պատճառած ծախսերից։ Ավելին, 3D20E-ն տարբերակված կերպով ազդում է երկու իզոֆորմերի վրա։ E EcR ընկալիչի ազդեցությունը, որն ինդուկցնում է EcR-A-ն և ճնշում EcR-B-ն, և ավելի ուժեղ ակտիվացնում է այլ զուգավորում առաջացնող գեները, այդ թվում՝ HPX15-ը, որը ազդում է էգերի բերրիության վրա: Սա կարող է բացատրել EPP-լռեցված արուների հետ զուգավորվող էգերի մոտ դիտվող նշանակալի անպտղությունը (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 3): Այս տվյալները ենթադրում են երկու էկդիսոն հորմոններով նախընտրելիորեն ակտիվացող հոսանքն ի վար գտնվող ուղիների գոյություն, որոնք կարող են հիմք հանդիսանալ սեռին բնորոշ ֆունկցիայի համար:
Հաջորդը, մենք ստուգեցինք մեր կենսաինֆորմատիկական խողովակաշարում հայտնաբերված երկու EcK գեների ֆունկցիան: EcK1-ի կամ EcK2-ի լռեցումը հանգեցրեց զգալի մահացության տղամարդկանց մոտ (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 4ա), ինչը ենթադրում է, որ էկդիզոնի ֆոսֆորիլացումը, և հետևաբար՝ ինակտիվացումը, կարևոր է գոյատևման համար: Քանի որ EcK2-ը արտահայտվում էր ավելի բարձր մակարդակներով, քան EcK1-ը, և հայտնաբերվում էր MAG-ներում պրոտեոմիկայի միջոցով (Նկար 2բ,գ և լրացուցիչ աղյուսակ 2), մենք հաստատեցինք դրա էկդիստերոիդ կինազային ակտիվությունը՝ այն ինկուբացելով 20E-ի հետ, ինչը հանգեցրեց 20E22P ֆոսֆորիլացմանը (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 2):4բ): 3D20E-ն որպես սուբստրատ օգտագործելիս մենք չկարողացանք հայտնաբերել ֆոսֆորիլացված 3D20E22P արգասիք (Ընդլայնված տվյալներ՝ Նկար 4գ), ինչը ենթադրում է, որ EcK2-ի նախընտրելի թիրախը կարող է լինել 20E-ն, այլ ոչ թե 3D20E-ն:
Մեր RNA-seq վերլուծության համաձայն, EcK2-ը բարձր արտահայտված էր նաև կույս էգերի LRT-ում, որտեղ այն անջատվում էր զուգավորումից հետո (Նկար 2բ): Մենք հաստատեցինք այս տվյալները և որոշեցինք, որ EcK2-ի արտահայտման վրա արյան մատակարարումը չի ազդել (Ընդլայնված տվյալներ, Նկար 5ա): Ընդլայնելով մեր նախնական MS փորձերը, մենք որոշեցինք, որ 20E22P-ի գագաթնակետը սերտորեն կապված էր 20E-ի գագաթնակետի հետ (արյան ընդունումից 22-26 ժամ անց. Ընդլայնված տվյալներ, Նկար 5բ): Կույս էգերի մոտ EcK2-ի լռեցումը հանգեցրեց 20E-ի և 20E22P-ի հարաբերական հարաբերակցության 3 անգամ աճի արյան ընդունումից 26 ժամ անց (Ընդլայնված տվյալներ, Նկար 2գ և 5գ), հաստատելով, որ EcK2-ը նաև ֆոսֆորիլացնում է 20E-ն էգերի մոտ: Հատկանշական է, որ EcK2-ից զուրկ կույսերը պահպանել են լիարժեք սեռական ընկալունակություն (Ընդլայնված տվյալներ, Նկար 5դ,ե), ինչը լրացուցիչ ենթադրում է, որ էգերի մոտ 20E-ի արտադրությունը չի առաջացնում զուգավորման ռեֆրակտորային շրջաններ: Այնուամենայնիվ, այս էգերը վերահսկիչ խմբի համեմատ զգալիորեն բարձր ձվադրման մակարդակ ունեին, որտեղ կույսերի ավելի քան 30%-ը ձու էր դնում (Ընդլայնված տվյալներ, նկ. 5f): Եթե արյունով կերակրվելուց հետո կատարվել են կրկնակի շղթայական Eck2 RNA (dsEcK2) ներարկումներ, ձվադրում տեղի չի ունեցել, որից հետո արյան ընդունման պատճառով 20E գագաթնակետը նվազել է: Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները հաստատում են այն մոդելը, որ արյունը ծծելուց հետո արտադրված 20E-ն կարող է ձվադրում առաջացնել, բայց միայն այն դեպքում, երբ ձվադրման բլոկը (EcK2 և հնարավոր է նաև այլ գործոններ) անջատվում է զուգավորման միջոցով: Ո՛չ 20E-ն, ո՛չ էլ 3D20E ներարկումները չեն արգելակել EcK2 արտահայտությունը կույսերի մոտ (Ընդլայնված տվյալներ, նկ. 5g), ինչը ենթադրում է, որ այլ գործոններ միջնորդում են այս կինազի արգելակումը: Այնուամենայնիվ, արյունով կերակրվելուց հետո 20E մակարդակները բավարար չէին զուգավորման անհարմարություն առաջացնելու համար, այլ արդյունավետորեն առաջացել են սեռական ճանապարհով փոխանցվող 3D20E-ի բարձր տիտրերով:
Մեր արդյունքները կարևոր պատկերացում են տալիս A. gambiae-ի վերարտադրողական հաջողությունը կարգավորող մեխանիզմների մասին: Ստեղծվել է մի մոդել, որտեղ արուները զարգացել են՝ սինթեզելով 3D20E-ի բարձր տիտրեր, որը արու-սպեցիֆիկ մոդիֆիկացված էկդիզոն է, որը ապահովում է ծագումնաբանությունը՝ էգերին անզգայացնելով հետագա զուգավորման համար: Միևնույն ժամանակ, այս մալարիայի վեկտորները նաև զարգացրել են արդյունավետ համակարգ՝ էգերի մոտ 3D20E-ն ակտիվացնելու համար՝ ի պատասխան արու-սպեցիֆիկ EPP-ի սեռական փոխանցման: Մեր իմացության չափով, սա արուների և էգերի կողմից գերիշխող ստերոիդային հորմոնային համակարգի առաջին օրինակն է, որը կատարում է եզակի և կարևորագույն գործառույթ միջատների մոտ: Արու-սպեցիֆիկ էկդիզոնի ֆունկցիան ենթադրվել է, բայց վերջնականապես ապացուցված չէ: Օրինակ, մեծ մասամբ հերքված վարկածը 18 այն է, որ այս գործառույթները կարող են կատարվել 20E նախորդ E1-ի կողմից: Հայտնի է, որ Դրոզոֆիլայի մոտ մոնանդրիան առաջանում է փոքր սեռական պեպտիդների սեռական փոխանցմամբ 19,20, որոնք փոխազդում են էգի վերարտադրողական համակարգը ներծծող նեյրոնների հետ՝ սեռական պեպտիդների հատուկ ընկալիչների միջոցով 21,22: Հետագա աշխատանք է պահանջվում՝ հոսանքն ավարտելու համար: A. gambiae էգերի մոտ 3D20E-ի կողմից կառավարվող ազդանշանային կասկադները և որոշել, թե արդյոք այդ կասկադները կարող են պահպանվել մոծակների և Դրոզոֆիլայի միջև։
Հաշվի առնելով 3D20E-ի կարևոր դերը էգերի բերրիության և վարքագծի վրա մեր ուսումնասիրության մեջ նշված, 3D20E-ի սինթեզին և ակտիվացմանը տանող ուղիները նոր հնարավորություններ են ընձեռում մոծակների դեմ պայքարի ապագա ռազմավարությունների համար, ինչպիսիք են՝ մրցունակ ստերիլ արուների առաջացումը ստերիլ միջատների տեխնոլոգիական ռազմավարություններում՝ վայրի բնության մեջ ազատման կամ 3D20E-ն կուսական խաղի ժամանակ ընդօրինակելու համար: 3D20E-ի արուների համար նախատեսված գործառույթը կարող է զարգացել, երբ A. gambiae-ն և Cellia-ի այլ տեսակներ ձեռք բերեցին իրենց սերմը զուգավորման խցանների մեջ մակարդելու ունակություն, քանի որ դա թույլ է տալիս մեծ քանակությամբ հորմոնների և հորմոն-ակտիվացնող ֆերմենտների արդյունավետ փոխանցում: Իր հերթին, մոնանդրիա իրականացնող 3D20E էվոլյուցիան էգերի համար մեխանիզմ է ապահովում (MISO-ի բարձր արտահայտման միջոցով)՝ նպաստելու իրենց վերարտադրողական պիտանիությանը մալարիայի բարձր տարածվածության տարածքներում, ինչը անուղղակիորեն նպաստում է Plasmodium-ի փոխանցմանը: Հաշվի առնելով, որ էգ 20E-ն, ինչպես ցույց է տրվել, խոր ազդեցություն ունի P. falciparum-ի գոյատևման և աճի վրա էգ Anopheles մոծակների մոտ,24 ինչպես արական, այնպես էլ էգ ստերոիդային հորմոնների ուղիները այժմ մոծակ-մակաբույծ փոխազդեցությունների հիմնական ասպեկտներն են:
A. gambiae G3 շտամները բուծվել են միջատների համար նախատեսված ստանդարտ պայմաններում (26-28 °C, 65-80% հարաբերական խոնավություն, 12:12 ժամ լույս/մութ լուսապաշար): Թրթուրներին կերակրել են ձկան փոշի կերով (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets և Tetra Pond Sticks՝ 7:7:2 հարաբերակցությամբ): Մեծահասակ մոծակներին կերակրել են ad libitum 10% դեքստրոզայի լուծույթով և շաբաթական մարդու արյունով (ուսումնասիրել արյան բաղադրիչները): Կույս մոծակները ստացվել են սեռերը բաժանելով բմբուլի փուլում՝ ծայրերը մանրադիտակով ուսումնասիրելուց հետո: DsRed տրանսգենը կրող արուները նկարագրվել են նախկինում:
Հարկադիր զուգավորման փորձերը կատարվել են նախկինում նկարագրված արձանագրությունների համաձայն։ Բնական զուգավորման համար 4 օրական կույս էգերը երկու գիշեր պահվել են 1:3 հարաբերակցությամբ սեռական հասուն կույս արուների հետ։ Արուներին dsEPP ներարկելու փորձերի համար համատեղ վանդակում պահելը համընկել է ներարկումից 3-4 օր հետո, երբ ֆոսֆատազի ակտիվությունը առավելագույնս լռել է (Ընդլայնված տվյալներ՝ նկ. 2բ):
Մոծակների հյուսվածքները, մնացած դիակները (մարմնի մնացած մասը) կամ ամբողջ մարմինը դիսեկցիայի ենթարկվեցին 100% մեթանոլի մեջ և հոմոգենացվեցին գնդիկներով (2 մմ ապակե գնդիկներ, 2400 պտ/րոպե, 90 վայրկյան): Հյուսվածքների քանակը և մեթանոլի ծավալները հետևյալն էին՝ մարմնի մնացած մասը՝ 50 մկլ 1000 մկլ-ում, MAG՝ 50–100 մկլ 80 մկլ, էգ LRT՝ 25–50 մկլ 80 մկլ: Նստվածքը ենթարկվեց երկրորդ մեթանոլային արդյունահանման՝ մեթանոլի նույն ծավալով: Բջջային մնացորդները հեռացվեցին ցենտրիֆուգացման միջոցով: Երկու արդյունահանումներից ստացված մեթանոլը խառնվեց և չորացվեց ազոտի հոսքի տակ, ապա վերստին լուծվեց ջրի մեջ 80% մեթանոլի հետևյալ ծավալներով՝ մարմնի մնացած մասը՝ 50 մկլ, MAG-ները և էգ LRT՝ 30 մկլ:
Նմուշները վերլուծվել են զանգվածային սպեկտրոմետրի (ID-X, Thermo Fisher) վրա, որը միացված է LC սարքին (Vanquish, Thermo Fisher): 5 մկլ նմուշը ներարկվել է 3 մկմ, 100 × 4.6 մմ սյան (Inspire C8, Dikma) մեջ, որը պահպանվում է 25°C ջերմաստիճանում: LC-ի շարժական փուլերն էին A (ջուր, 0.1% մրջնաթթու) և B (ացետոնիտրիլ, 0.1% մրջնաթթու): LC գրադիենտը հետևյալն էր. 5% B 1 րոպեի ընթացքում, ապա 11 րոպեի ընթացքում ավելացվել է մինչև 100% B: 8 րոպե անց 100% ջերմաստիճանում, սյունը կրկին հավասարակշռել 5% B-ում 4 րոպեի ընթացքում: Հոսքի արագությունը կազմել է 0.3 մլ/րոպե: MS աղբյուրում իոնացումը իրականացվում է տաքացված էլեկտրոցողիչ իոնացման միջոցով՝ դրական և բացասական ռեժիմներով:
Մասս-սպեկտրոմետրը չափում է տվյալները 350-ից մինչև 680 m/z միջակայքում՝ 60,000 լուծաչափով՝ լրիվ MS ռեժիմով: MS/MS տվյալները ստացվել են [M + H]+ (բոլոր թիրախները), [M - H2O + H]+ (բոլոր թիրախները) և [M - H]- (ֆոսֆորիլացված թիրախները) վրա: MS/MS տվյալները օգտագործվել են այն թիրախների էկդիսոնային հատկությունները հաստատելու համար, որոնց համար ստանդարտ հասանելիություն չկար: Ոչ թիրախային էկդիստերոիդները նույնականացնելու համար վերլուծվել են բոլոր HPLC գագաթների MS/MS տվյալները՝ >15% հարաբերական առատությամբ: Քանակականացրեք մաքուր ստանդարտներից (20E, 3D20E) ստեղծված ստանդարտ կորերի միջոցով՝ մեկ որոշակի նմուշի (բոլոր մյուս թիրախները) բացարձակ քանակները կամ նոսրացումները հաշվարկելու համար՝ մեկ արուի մոտ հայտնաբերված քանակներին դրանց համարժեքությունը հաշվարկելու համար: 3D20E-ի համար քանակականացումը կատարվել է հետևյալ ադուկտների գումարի միջոցով՝ [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-։ Տվյալները արդյունահանվել և քանակականացվել են Tracefinder-ի միջոցով (տարբերակ 4.1): MS/MS տվյալները վերլուծվել են Xcalibur-ի միջոցով (տարբերակ 4.4): E, 20E և 3D20E-ի MS սպեկտրները համեմատվել են համապատասխան ստանդարտների հետ: 3D20E22P-ն վերլուծվել է դերիվատացման միջոցով՝ օգտագործելով Ժիրարի ռեակտիվը: 20E22P-ն վերլուծվել է m/z հարաբերակցությամբ:
3D20E22P-ն մաքրվել է MAG-ից: Մաքրումը կատարվել է վերլուծական մասշտաբով՝ օգտագործելով գերարդյունավետ հեղուկ քրոմատոգրաֆ (Acquity, Waters)՝ քառաբևեռ զանգվածային դետեկտորով (QDa, Acquity, Waters)՝ HPLC-MS/MS վերլուծության նույն LC պայմաններում: Ֆրակցիաների հավաքումը սկսվել է, երբ 3D20E22P-ին համապատասխանող m/z-ը հայտնաբերվել է նախկինում որոշված ​​նույն պահպանման ժամանակում: Այնուհետև արդյունահանված միացությունների մաքրությունը ստուգվել է HPLC-MS/MS-ով՝ վերևում նկարագրվածի պես:
Ընդհանուր ՌՆԹ-ն արդյունահանվել է 10-12 վերարտադրողական հյուսվածքներից կամ մարմնի այլ մասերից (գլուխ չհանած)՝ օգտագործելով TRI ռեակտիվ (Thermo Fisher)՝ հետևելով արտադրողի հրահանգներին։ ՌՆԹ-ն մշակվել է TURBO DNase-ով (Thermo Fisher)։ cDNA-ն սինթեզվել է՝ օգտագործելով Moloney մկնային լեյկեմիայի վիրուսի հակադարձ տրանսկրիպտազ (M-MLV RT; Thermo Fisher)՝ հետևելով արտադրողի հրահանգներին։ Հակադարձ տրանսկրիպցիայի քանակական ՊՇՌ-ի (RT-qPCR; Extended Data Table 2) պրայմերները նախկինում հրապարակվել են24 կամ նախագծվել են Primer-BLAST26-ի միջոցով՝ նախապատվությունը տալով 70-150 զույգ հիմք ունեցող և էկզոն-էկզոն միացումները տարածող արգասիքներին կամ պրայմերային զույգ պրայմերներին, որոնք առանձնացնում են էկզոնները։ Երեքից չորս կենսաբանական կրկնօրինակներից cDNA նմուշները նոսրացվել են չորս անգամ ջրում՝ RT-qPCR-ի համար։ Քանակական որոշումը կատարվել է 15 մկլ կրկնօրինակ ռեակցիաներում, որոնք պարունակում են 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), պրայմերներ և 5 մկլ նոսրացված cDNA։ Ռեակցիաները անցկացվել են QuantStudio-ի վրա։ 6 Pro իրական ժամանակի ՊՇՌ համակարգ (Thermo Fisher) և տվյալները հավաքագրվել և վերլուծվել են Design and Analysis (տարբերակ 2.4.3) մեթոդի միջոցով: Ինչպես ցույց է տրվել այս ուսումնասիրության մեջ, հարաբերական քանակությունները նորմալացվել են ռիբոսոմային RpL19 գենի (AGAP004422) նկատմամբ, որի արտահայտությունը էականորեն չի փոխվել արյան մատակարարման27 կամ զուգավորման3 ընթացքում:
ՌՆԹ-ի որակը ստուգվել է Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) սարքի միջոցով: Illumina զույգ ծայրերով գրադարանները պատրաստվել և գործարկվել են MIT-ի և Հարվարդի Broad ինստիտուտում: Հաջորդականության ընթերցումները համապատասխանեցվել են A. gambiae գենոմին (PEST շտամ, տարբերակ 4.12)՝ օգտագործելով HISAT2 (տարբերակ 2.0.5)՝ լռելյայն պարամետրերով: <30 քարտեզագրման որակի (MAPQ) միավորներով ընթերցումները հեռացվել են Samtools-ի միջոցով (տարբերակ 1.3.1): Գեներին քարտեզագրված ընթերցումների քանակը հաշվարկվել է htseq-count-ի միջոցով (տարբերակ 0.9.1)՝ լռելյայն պարամետրերով: Նորմավորված ընթերցումների քանակը հաշվարկվել է, և գեների դիֆերենցիալ արտահայտությունը վերլուծվել է DESeq2 փաթեթի միջոցով (տարբերակ 1.28.1)՝ R-ում (տարբերակ 4.0.3):
Էկդիսոն-մոդիֆիկացնող գեների թեկնածուները նույնականացվել են՝ նախ A. gambiae գենոմը PSI-BLAST ալգորիթմի միջոցով որոնելով (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), օգտագործելով լռելյայն արժեքներ։ Պարամետրերը հետևյալ հարցման սպիտակուցային հաջորդականություններով. Bombyx mori-ից (մուտքի համար՝ NP_001038956.1), Musca domestica-ից (մուտքի համար՝ XP_005182020.1, XP_005175332.1 և XP_011294434.1) և Microplitis demolitor-ից (մուտքի համար՝ XP_008552646.1 և XP_008552645.1), EcK-ից B. mori-ից (մուտքի համար՝ NP_001036900), Drosophila melanogaster-ից (մուտքի համար՝ NP_651202), Apis-ից։ mellifera (մուտքի համար՝ XP_394838) և Acyrthosiphon pisum (մուտքի համար՝ XP_001947166); և B. mori-ից (մուտքի համար՝ XP_001947166) NP_001177919.1 և NP_001243996.1) EPP և D. melanogaster-ի EO (մուտքի համար՝ NP_572986.1) (քայլ 1): Հաջորդը, ֆիլտրում են արդյունքները՝ հիմնվելով mRNA-ի բարձր արտահայտման վրա (>100 բեկոր/կիլոբազ էկզոն մեկ միլիոն քարտեզագրված կարդացման համար (FPKM) կամ >85%) Գամբիայում վերարտադրողական հյուսվածքում (կանանց LRT կամ MAG) (քայլ 2): Հատկանիշը բարելավելու համար մենք ընտրել ենք թեկնածու ֆերմենտներ, որոնք նաև արտահայտվում են A. albimanus-ի վերարտադրողական հյուսվածքում, որը anopheles տեսակի է և չի սինթեզում կամ չի փոխանցում էկդիսոն զուգավորման ընթացքում: Թեկնածու գեները զտվել են A. albimanus-ի վերարտադրողական հյուսվածքում ցածր արտահայտման հիման վրա (<100 FPKM կամ <85-րդ պերսենտիլ) (քայլ 3): Որպես վերջնական ֆիլտր (քայլ 4), թեկնածու գեները պետք է բավարարեն հետևյալներից առնվազն մեկը. (1) զգալիորեն բարձրացված լինեն զուգավորումից հետո (P < 0.05)՝ ըստ տարբերակված արտահայտված գեների վերլուծության և (2) ոչ վերարտադրողական հյուսվածքներում (< 85% կամ <100 FPKM):
Մենք փոփոխեցինք նախկինում նկարագրված մեթոդները 28,29,30՝ ամբողջ օրգանիզմի իզոտոպային պիտակավորում իրականացնելու համար: Հակիրճ, վայրի տեսակի Saccharomyces cerevisiae տիպ II (YSC2, Sigma) հետազոտվել է խմորիչի ազոտային հիմքում (BD Difco, DF0335), որը պարունակում էր (քաշ/ծավալ) 2% գլյուկոզ (G7528, Sigma), 1.7% ամինաթթուներից զերծ և ամոնիումի սուլֆատ (մշակութային միջավայր) և 5% 15N ամոնիումի սուլֆատ (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories)՝ որպես ազոտի միակ աղբյուր: Խմորիչը վերականգնվել է ցենտրիֆուգացման միջոցով, և մոծակների թրթուրները կերակրվել են ad libitum մինչև բոոպացիան: Չորրորդ փուլի մահացությունը կանխելու համար ավելացվել է ձկան ալյուր (0.5 մգ 300 թրթուրի համար): Այնուհետև միայն էգերն են օգտագործվել զուգավորման փորձերում՝ չնշագրված արուների հետ՝ զուգավորման ընթացքում փոխանցված արու պրոտեոմը վերլուծելու համար:
4-6 օրական 15N-ով նշագրված կույս էգերը ստիպված են եղել զուգավորվել իրենց տարիքին համապատասխանող չնշագրված կույս արուների հետ։ Հաջող զուգավորումը հաստատվել է էպիֆլուորեսցենտային մանրադիտակով զուգավորման խցանների հայտնաբերմամբ։ 3, 12 և 24 hpm-ում 45-55 զուգավորված էգերի նախասրտերը բաժանվել են 50 մկլ ամոնիումի բիկարբոնատի բուֆերի (pH 7.8) մեջ և համասեռացվել են մուրճով։ Հոմոգենատը ցենտրիֆուգացվել է, և վերին շերտը խառնվել է 50 մկլ 0.1% RapiGest (186001860, Waters) լուծույթի հետ 50 մկլ ամոնիումի բիկարբոնատի մեջ։ Յուրաքանչյուր նմուշից վերին շերտը և գնդիկը արագ սառեցվել են չոր սառույցի վրա և գիշերը ուղարկվել Վաշինգտոնի համալսարանի ՄաքՔոսի լաբորատորիա, որտեղ ավարտվել է նմուշի նախապատրաստումը LC-MS/MS-ի համար։ Գնդիկը կրկին լուծարել 50 մկլ 0.1% RapiGest լուծույթի մեջ 50 մկլ ամոնիումի բիկարբոնատի մեջ և ուլտրաձայնային եղանակով մշակվել ջրային լոգարանում։ Գնդիկի և վերին շերտի սպիտակուցի կոնցենտրացիան չափվել է BCA անալիզով, նմուշները վերականգնվել են 5 մՄ դիթիոթրեիտոլով (DTT; Sigma), ալկիլացվել են 15 մՄ յոդոացետամիդով (Sigma) և ինկուբացվել են 37°C ջերմաստիճանում (1:0 50) 1 ժամ՝ տրիպսինիզացիայով. տրիպսին:սուբստրատ հարաբերակցությամբ): RapiGest-ը լիզացվել է 200 մՄ HCl-ի ավելացմամբ, որին հաջորդել է ինկուբացիա 37°C ջերմաստիճանում 45 րոպե և ցենտրիֆուգացում 14,000 պտ/րոպե արագությամբ 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում՝ մնացորդները հեռացնելու համար: Նմուշները լվացվել են երկռեժիմային պինդ ֆազային արդյունահանմամբ (Oasis MCX փամփուշտներ, Waters) և վերասուսպենդացվել 0.1% մրջնաթթվի մեջ՝ 0.33 մկգ մկլ-1 վերջնական սպիտակուցի կոնցենտրացիայի համար: Չնշագրված MAG պրոտեոմները նմանապես վերլուծվել են կույս արուներից: Յուրաքանչյուր նմուշի համար վերլուծվել են երկու վերլուծական կրկնօրինակներ: Հաջորդը, յուրաքանչյուրից վերլուծվել է 1 մկգ: օգտագործելով 25 սմ տրամագծով հալեցված սիլիկայի 75 ​​մկմ սյուն՝ 4 սմ տրամագծով հալեցված սիլիկայի Kasil1 (PQ) ֆրիտային թակարդով, որը լցված էր Jupiter C12 հակադարձ փուլային խեժով (Phenomenex) և 180-րոպեանոց հեղուկ քրոմատոգրաֆիա։ Նմուշների մարսեցումներ – MS/MS-ը գործարկվել է Q-Exactive HF զանգվածային սպեկտրոմետրի (Thermo Fisher) վրա՝ nanoACQUITY UPLC համակարգով (Waters): Յուրաքանչյուր գործարկման համար ստեղծված տվյալների ձեռքբերման տվյալները փոխակերպվել են mzML ձևաչափի՝ օգտագործելով Proteowizard (տարբերակ 3.0.20287) և Comet31 (տարբերակ 3.2)՝ համեմատած FASTA տվյալների բազայի հետ, որը պարունակում է Anopheles gambiae (VectorBase տարբերակ 54), Anopheles coluzzi սպիտակուցային հաջորդականություններ: Որոնում է իրականացվել Mali-NIH (VectorBase տարբերակ 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, մարտ 2021), A. gambiae RNA-seq և հայտնի մարդկային աղտոտիչների եռանկյունաձև թարգմանությունների վրա: Պեպտիդային քարտեզի համապատասխան FDR-ները որոշվել են Percolator32 (տարբերակ 3.05) միջոցով՝ 0.01 շեմով, և պեպտիդները հավաքվել են սպիտակուցային նույնականացումների մեջ՝ օգտագործելով Limelight33-ում սպիտակուցային խնայողության մեթոդը (տարբերակ): 2.2.0)։ Սպիտակուցի հարաբերական առատությունը գնահատվել է յուրաքանչյուր փորձարկման ժամանակ յուրաքանչյուր սպիտակուցի համար հաշվարկված նորմալացված սպեկտրալ առատության գործակցի (NSAF) միջոցով, ինչպես նկարագրվել է նախկինում։ Յուրաքանչյուր սպիտակուցի նկատմամբ NSAF-ը միջինացվել է երկու տարբեր կենսաբանական կրկնօրինակներից ստացված նմուշների միջև։ 15N պիտակավորումը հաջողությամբ քողարկել է էգ պրոտեոմը, չնայած պիտակավորված կույսերից կարելի էր հայտնաբերել չպիտակավորված սպիտակուցի փոքր քանակություն։ Մենք գրանցել ենք արու սպիտակուցի նվազեցման (1-5 սպեկտր) հայտնաբերում էգ հում նմուշներում միայն տեխնիկական փորձարկումների ժամանակ, որտեղ հում նմուշները փորձարկվել են արու/զուգավորման նմուշներից հետո՝ HPLC «փոխանցման» արդյունքում։ Պիտակավորված կույսերից որպես «աղտոտիչներ» հայտնաբերված երբեմն-երբեմն սպիտակուցները ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ 1-ում։
Genscript-ում առկա են երկու հակածին պեպտիդներ՝ QTTDRVAPAPDQQQ (PA իզոտիպի սահմաններում) և MESDGTTPSGDSEQ (PA և PB իզոտիպի սահմաններում): Երկու պեպտիդները միացվել են, ապա կոնյուգացվել են KLH կրող սպիտակուցի հետ և ներարկվել Նոր Զելանդիայի նապաստակների մեջ: Չորրորդ ներարկումից հետո նապաստակները զոհաբերվել են, և ընդհանուր IgG-ն մեկուսացվել է աֆինային մաքրման միջոցով: EPP-ի ամենասպեցիֆիկ նապաստակից ստացված IgG-ն օգտագործվել է հետագա արևմտյան բլոտինգի համար:
Վեսթերն բլոտների համար, 4-օրյա կույս արուներից և կույս կամ բռնի զուգավորմամբ զուգավորված էգերից (զուգավորումից <10) MAG (n = 10, որտեղ n-ը ներկայացնում է կենսաբանորեն անկախ մոծակների նմուշների քանակը) և էգ LRT (n = 30) էգ LRT (n = 30) էգ էգերից, առանձին ավելացվել է սպիտակուցային արդյունահանման բուֆեր (50 մՄ Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% նատրիումի դեօքսիխոլատ; 150 մՄ NaCl; 1 մՄ EDTA; 1× պրոտեազայի ինհիբիտորային կոկտեյլ (Roche)): Նմուշները հոմոգենացվել են դիսեկցիայից անմիջապես հետո՝ օգտագործելով բյուրեղներ (2 մմ ապակե գնդիկներ, 2,400 պտ/րոպե, 90 վայրկյան): Անլուծելի մնացորդները հեռացվել են ցենտրիֆուգացման միջոցով 20,000 գ-ով 4°C ջերմաստիճանում: Սպիտակուցները քանակապես որոշվել են Bradford assay-ով (Bio-Rad): Այնուհետև, 20 մկգ MAG սպիտակուց, 40 մկգ LRT սպիտակուց և 20 մկգ մնացորդային զանգվածային սպիտակուց են վերլուծվել: դենատուրացվել և առանձնացվել է 10% Bis-Tris NuPAGE-ով՝ օգտագործելով MOPS բուֆերը։ Սպիտակուցները տեղափոխվել են պոլիվինիլիդենի ֆտորիդային թաղանթների մեջ՝ օգտագործելով iBlot2 փոխանցման համակարգը (Thermo Fisher): Թաղանթները երկու անգամ լվացվել են 1× PBS-T-ով (0.1% Tween-20 PBS-ում) և այնուհետև 1 ժամով բլոկավորվել են Odyssey բլոկավորող բուֆերում (Li-Cor) 22°C ջերմաստիճանում։ Թաղանթները գիշերը թափահարվել են 4°C ջերմաստիճանում հատուկ նապաստակի հակա-EPP պոլիկլոնալ առաջնային հակամարմնով (1:700 բլոկավորող բուֆերում) և առնետի հակաակտինային մոնոկլոնալ առաջնային հակամարմինով՝ MAC237 (Abeam; 1:4,000): Թաղանթները լվացվել են PBS-T-ով և այնուհետև ինկուբացվել են երկրորդային հակամարմիններով (էշի հակա-նապաստակ 800CW և այծի հակա-առնետ 680LT (Li-Cor), երկուսն էլ 1:20,000)՝ 0.01% SDS և 0.2% Tween-20 պարունակող բլոկավորող բուֆերում՝ 1 ժամ 22°C ջերմաստիճանում: Մեմբրանները լվացվել են PBS-T-ով և պատկերվել Odyssey CLx սկաներով: Պատկերները հավաքագրվել և մշակվել են Image Studio-ում (տարբերակ 5.2): EPP-RA իզոֆորմին (82 կԴա) համապատասխանող հատուկ գոտի չի հայտնաբերվել:
EPP-ի (որպես AGAP002463-RB իզոֆորմ, որը պարունակում է հիստիդին ֆոսֆատազի դոմեն, NCBI պահպանված դոմենի որոնում 34) և EcK2-ի (AGAP002181) կոդավորող շրջանները կլոնավորվել են pET-21a(+) պլազմիդի (Novagen Millipore Sigma) մեջ։ Պրայմերները ներկայացված են ընդլայնված տվյալների աղյուսակ 2-ում: Ութ GS4 լինկերներ (զուգահեռ) տեղադրվել են pET-21a(+)-EcK2 կոնստրուկտի C-ծայրային 6xHis պիտակից առաջ: Ռեկոմբինանտ սպիտակուցները ստացվել են NEBExpress բջջայինից զերծ E. coli սպիտակուցի սինթեզի ռեակցիայի միջոցով (New England BioLabs): Ռեկոմբինանտ սպիտակուցները մաքրվել են NEBExpress Ni սպին սյուների միջոցով (New England BioLabs): Դիհիդրոֆոլատ ռեդուկտազի (DHFR) վերահսկիչ սպիտակուցը ստացվել է NEBExpress բջջայինից զերծ E. coli սպիտակուցի սինթեզի հավաքածուի ԴՆԹ ձևանմուշի միջոցով: Սպիտակուցները պահվել են 50% գլիցերինի մեջ PBS-ում -20°C ջերմաստիճանում մինչև 3 ամիս:
EPP-ի և հյուսվածքային քաղվածքների ֆոսֆատազային ակտիվությունը չափվել է 4-նիտրոֆենիլ ֆոսֆատի (pNPP; Sigma-Aldrich) միջոցով: Ռեակցիայի բուֆերը պարունակում էր 25 մՄ Tris, 50 մՄ քացախաթթու, 25 մՄ Bis-Tris, 150 մՄ NaCl, 0.1 մՄ EDTA և 1 մՄ DTT: Հյուսվածքը հոմոգենացվել է ռեակցիոն բուֆերում, և բջջային մնացորդները հեռացվել են ցենտրիֆուգացման միջոցով: Ռեակցիան սկսելու համար ֆերմենտ կամ հյուսվածքային քաղվածք ավելացրեք 2.5 մգ մլ-1 pNPP պարունակող ռեակցիոն բուֆերին: Ռեակցիոն խառնուրդը ինկուբացվել է սենյակային ջերմաստիճանում մթության մեջ, և pNPP-ից փոխակերպված pNP-ի քանակը քանակականացվել է՝ տարբեր ժամանակներում 405 նմ-ում կլանումը չափելով:
In vitro EcK ակտիվության համար սպիտակուցը ինկուբացվել է 0.2 մգ 20E-ի կամ 3D20E-ի հետ 200 մկլ բուֆերում (pH 7.5), որը պարունակում է 10 մՄ HEPES-NaOH, 0.1% BSA, 2 մՄ ATP և 10 մՄ MgCl2, 2 ժամ 27°C ջերմաստիճանում։ Ռեակցիան դադարեցվել է 800 մկլ մեթանոլ ավելացնելով, այնուհետև սառեցվել է -20°C ջերմաստիճանում 1 ժամ, այնուհետև ցենտրիֆուգացվել է 20,000 գ-ի վրա 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում։ Այնուհետև վերին շերտը վերլուծվել է HPLC-MS/MS մեթոդով։ Վերահսկիչ խմբում օգտագործված սպիտակուցները ջերմային ինակտիվացնելու համար սպիտակուցները ինկուբացվել են 50% գլիցերինի մեջ PBS-ում 20 րոպե 95°C ջերմաստիճանում։
EPP-ի in vitro ակտիվության համար սպիտակուցը ինկուբացվել է 3D20E22P-ի հետ (համարժեք է HPLC-MS/MS միջոցով մաքրված MAG-ի 18 զույգերում հայտնաբերված քանակին) 100 մկլ բուֆերի մեջ (pH 7.5), որը պարունակում է 25 մՄ Tris, 50 մՄ քացախաթթու, 25 մՄ Bis-Tris, 150 մՄ NaCl, 0.1 մՄ EDTA և 1 մՄ DTT, 3 ժամ 27°C ջերմաստիճանում: Ռեակցիան դադարեցվել է 400 մկլ մեթանոլ ավելացնելով և սառեցվել է -20°C ջերմաստիճանում 1 ժամ, այնուհետև ցենտրիֆուգացվել է 20,000 գ-ի վրա 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում: Վերին շերտը վերլուծվել է HPLC-MS/MS մեթոդով:
EPP-ի (362 զույգ հիմք), EcK1-ի (AGAP004574, 365 զույգ հիմք) և EcK2-ի (556 զույգ հիմք) ՊՇՌ բեկորները ամպլիֆիկացվել են խառը սեռի անգլուխ մոծակների դիակներից պատրաստված կԴՆԹ-ից: eGFP վերահսկողության ՊՇՌ բեկորը (495 զույգ հիմք) ամպլիֆիկացվել է նախկինում նկարագրված pCR2.1-eGFP-ից: ՊՇՌ պրայմերները ներկայացված են ընդլայնված տվյալների աղյուսակ 2-ում: ՊՇՌ բեկորը տեղադրվել է pL4440 պլազմիդի վրա շրջված T7 պրոմոտորների միջև: Պլազմիդային կոնստրուկտները վերականգնվել են NEB 5-α կոմպետենտ E. coli-ից (New England Biolabs) և օգտագործվելուց առաջ ստուգվել են ԴՆԹ-ի հաջորդականացման միջոցով (տե՛ս լրացուցիչ տվյալներ 1-ը՝ ներդիրի հաջորդականության համար): T7 պրոմոտորին համապատասխանող պրայմերները (ընդլայնված տվյալների աղյուսակ 2) օգտագործվել են pL4440-ի վրա հիմնված պլազմիդից ներդիրը ուժեղացնելու համար: ՊՇՌ արտադրանքի չափը հաստատվել է ագարոզային գելի էլեկտրոֆորեզով: dsRNA-ն տրանսկրիպցվել է ՊՇՌ ձևանմուշներից՝ օգտագործելով Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) և մաքրվել արտադրողի հրահանգների համաձայն՝ նախկինում նկարագրված փոփոխություններով:
dsRNA ներարկման համար չափահաս արուների կամ էգերի (Nanoject III, Drummond) կրծքավանդակի մեջ էկլոզից հետո 1 օրվա ընթացքում ներարկվել է 1380 նգ dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) 10 նգ nl-1 կոնցենտրացիայով։ Գեների նոկդաունի մակարդակները որոշվել են առնվազն երեք կենսաբանական կրկնօրինակներում՝ ՌՆԹ-ի արդյունահանման, կԴՆԹ-ի սինթեզի և RT-qPCR-ի միջոցով։ Էկդիզոնի ներարկման համար 4-օրյա կույս կամ 6-օրյա կույս արյունով կերակրված էգերին ներարկվել է 0.13, 0.21 կամ 0.63 մկգ 20E կամ 3D20E (Nanoject III, Drummond) համապատասխանաբար 1.3, 2.1 կոնցենտրացիաներով, կախված փորձարարական նախագծից, կամ 6.3 նգ nl-1։ Ներարկվել է 100 նլ 10% (ծավալ/ծավալ) էթանոլ ջրի մեջ։ 100 նլ 3D20E22P 10% էթանոլի մեջ (համարժեք է MAG-ների զույգում հայտնաբերված քանակի 75%-ին): Մոծակները պատահականորեն բաժանվել են ներարկման խմբին:
Ձվադրման փորձարկումների համար 3 ​​օրական էգերին կերակրել են ըստ ցանկության՝ մարդու արյունով։ Հեռացնել մասամբ կերակրված կամ չկերակրված մոծակները։ Կախված մշակումից՝ էգերը տեղադրվել են առանձին ձվադրման բաժակների մեջ չորս գիշեր՝ արյան կերակրումից առնվազն 48 ժամ հետո։ Ձվերը հաշվվել են ստերեոսկոպով (Stemi 508, Zeiss). զուգավորված էգերի դեպքում ձվերը, որոնցից դուրս են եկել թրթուրներ, համարվում էին բեղմնավոր։
Զուգավորման փորձարկումների համար էգերին թույլատրվել է առնվազն 2 օր՝ կախված բուժումից, որպեսզի զուգավորման նկատմամբ դիմադրություն զարգանա, և վայրի տիպի տարիքային համապատասխան արուները հետագայում ներմուծվել են նույն վանդակը։ Երկու գիշեր անց էգերի բեղմնավորված բշտիկները դիսեկցիայի են ենթարկվել, և գենոմային ԴՆԹ-ն ազատվել է սառեցման-հալեցման և ուլտրաձայնային մշակման միջոցով՝ 10 մՄ Tris-HCl, 1 մՄ EDTA և 25 մՄ NaCl (pH 8.2) պարունակող բուֆերում։ Նմուշները ինկուբացվել են Proteinase K-ով (0.86 մկգ մկլ-1) 15 րոպե 55°C ջերմաստիճանում, որին հաջորդել է 10 րոպե 95°C ջերմաստիճանում։ Գենոմային ԴՆԹ-ի հում պատրաստուկները նոսրացվել են 10 անգամ և ենթարկվել են Y քրոմոսոմի հաջորդականությունների qPCR հայտնաբերման. պրայմերները ներկայացված են ընդլայնված տվյալների աղյուսակ 2-ում։ Y քրոմոսոմի հաջորդականության բացակայությունը ցույց է տալիս զուգավորման բացակայություն։
Վերամիավորման փորձարկումների համար հարկադիր զուգավորված էգերը հետազոտվել են զուգավորման խցանների առկայության համար՝ զուգավորման կարգավիճակը հաստատելու համար, և թողնվել է 2 օր՝ արուների բացակայության դեպքում զուգավորման նկատմամբ դիմադրողականություն զարգացնելու համար, ինչպես նախկինում նկարագրվել է36: Այնուհետև DsRed տրանսգենային սերմ կրող արուները ներմուծվել են էգերի վանդակներ: Երկու գիշեր անց բեղմնավորող բշտիկները դիսեկցվել են էգերից, և գենոմային ԴՆԹ-ն պատրաստվել է վերը նկարագրվածի պես և ենթարկվել DsRed տրանսգենի qPCR հայտնաբերման. պրայմերները ներկայացված են ընդլայնված տվյալների աղյուսակ 2-ում: DsRed տրանսգենի բացակայությունը ցույց է տվել, որ վերամիավորում տեղի չի ունեցել:
3D20E-ն սինթեզվել է նախկինում նկարագրված եղանակով 37: Հակիրճ ասած, 10 մգ 20E (Sigma-Aldrich) լուծվել է 10 մլ ջրի մեջ, որին հաջորդել է 30 մգ պլատինե սևի (փոշու տեսքով, Sigma-Aldrich): O2-ի թույլ հոսքը անընդհատ փուչիկներով լցվել է ռեակցիայի խառնուրդի մեջ, որը խառնվել է սենյակային ջերմաստիճանում: 6 ժամ անց ռեակցիան դադարեցնելու համար ավելացվել է 30 մլ մեթանոլ: Խառնուրդը ցենտրիֆուգացվել է՝ կատալիզատորի մասնիկները հեռացնելու համար: Վերին շերտը գոլորշիացվել է մինչև չորանալը վակուումային պայմաններում սենյակային ջերմաստիճանում: Չորացրած ռեակցիայի արգասիք լուծվել է 10% էթանոլի և մեթանոլի մեջ՝ HPLC-MS/MS վերլուծության համար ներարկման համար: Փոխակերպման արագությունը (20E-ից մինչև 3D20E) կազմել է մոտավորապես 97% (Նկար 4բ), և սինթեզված 3D20E-ի MS սպեկտրը համընկել է զուգավորված էգերի մոտ հայտնաբերված սպեկտրի հետ (Նկար 4գ):
Լեգենդը պարունակում է կատարված վիճակագրական թեստերի կոնկրետ մանրամասներ: GraphPad-ը (տարբերակ 9.0) օգտագործվել է Ֆիշերի ճշգրիտ թեստը, Մանթել-Քոքսի թեստը և Ստյուդենտի t-թեստը կատարելու համար: Քոքրան-Մանթել-Հենզելի թեստերը կատարվել են հատուկ R սկրիպտի միջոցով (հասանելի է https://github.com/duopeng/mantelhaen.test կայքում): Տվյալների բաշխումը ստուգվել է նորմալության համար՝ օգտագործելով Շապիրո-Վիլկի թեստը՝ 0.05 նշանակալիության շեմով: Երբ տվյալները չեն անցել նորմալության թեստը, կատարվել է Մանն-Ուիթնիի թեստը: Կենդանի մնալու տվյալները վերլուծվել են Մանթել-Քոքսի թեստի միջոցով: DESeq2 փաթեթը (տարբերակ 1.28.1) օգտագործվել է RNA-seq գենի մակարդակի դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծություն կատարելու համար: Գրաֆիկի հորիզոնական գիծը ներկայացնում է միջնարժեքը: P = 0.05 նշանակալիության արժեքը օգտագործվել է որպես շեմ բոլոր թեստերի համար:
Ուսումնասիրության դիզայնի վերաբերյալ լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս այս հոդվածին կից Nature Research Report-ի ամփոփագիրը։
MS պրոտեոմիկ տվյալները PRIDE գործընկերների պահոցի (https://www.ebi.ac.uk/pride/) միջոցով պահվել են ProteomeXchange կոնսորցիումում (http://proteomecentral.proteomexchange.org)՝ PXD032157 տվյալների հավաքածուի նույնականացուցիչով։
RNA-seq տվյալների հավաքածուն պահվում է Գենային Էքսպրեսիայի Համապարփակ Գրադարանում (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) GSE198665 սերիական գրառման ներքո։
Ընթացիկ ուսումնասիրության ընթացքում ստեղծված և/կամ վերլուծված լրացուցիչ տվյալների հավաքածուները կարող են ստացվել համապատասխան հեղինակներից՝ ողջամիտ պահանջի դեպքում: Այս հոդվածը ներկայացնում է սկզբնաղբյուր տվյալները:
Դե Լուֆ, Ա. Էկդիստերոիդներ. Անտեսված միջատների սեռական ստերոիդներ: Արական. Սև արկղ. Միջատների գիտություն. 13, 325–338 (2006):
Ռեդֆերն, CPF 20-հիդրօքսիէկդիսոն և ձվարանների զարգացումը Anopheles stephens-ի մոտ։ J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982)։