Սպիտակուցների տեսակավորումը սեկրետոր ուղում կարևոր է բջիջների կոմպարտմենտալացման և հոմեոստազի պահպանման համար: Բացի թաղանթային միջնորդված տեսակավորումից, լիպիդների դերը կինեզինային տեսակավորման մեջ սեկրետոր տեղափոխման գործընթացում վաղուց առկա հիմնարար հարց է, որին դեռևս պատասխան չի տրվել: Այստեղ մենք կատարում ենք եռաչափ միաժամանակյա բազմագույն բարձր թույլտվությամբ իրական ժամանակի պատկերացում՝ in ​​vivo ապացուցելու համար, որ նոր սինթեզված գլիկոզիլֆոսֆատիդիլինոզիտոլ-ամրացված սպիտակուցները շատ երկար կերամիդային լիպիդային մասնիկներով կլաստերացվում և դասակարգվում են մասնագիտացված էնդոպլազմների զուտ ելքի տեղամասում, որը տարբերվում է թաղանթային սպիտակուցների կողմից օգտագործվող տեղամասից: Բացի այդ, մենք ցույց ենք տալիս, որ էնդոպլազմային ցանցի թաղանթում կերամիդի շղթայի երկարությունը կարևոր է այս տեսակավորման ընտրողականության համար: Մեր ուսումնասիրությունը տրամադրում է առաջին ուղղակի in vivo ապացույցը՝ լիպիդային շղթայի երկարության հիման վրա սպիտակուցային բեռները դասակարգելու սեկրետոր ուղու ընտրողական արտահանման տեղամասերի:
Էուկարիոտ բջիջներում էնդոպլազմային ցանցում (ԷՑ) սինթեզված սպիտակուցները այնուհետև տեսակավորվում են տեղափոխման ընթացքում՝ սեկրետոր ուղով, որպեսզի հասնեն իրենց համապատասխան բջջային նշանակման վայր (1): Բացի ծածկույթով միջնորդված տեսակավորումից, երկար ժամանակ ենթադրվում էր, որ որոշակի լիպիդներ կարող են նաև ծառայել որպես ընտրողական ելքի կետեր՝ դրանք խմբավորելով որոշակի թաղանթային տիրույթներում, որոնք որոշակի սպիտակուցներ են (2-5): Այնուամենայնիվ, դեռևս բացակայում են in vivo ուղղակի ապացույցներ, որոնք կհաստատեն այս հնարավոր լիպիդային մեխանիզմը: Այս հիմնական խնդիրը լուծելու համար մենք ուսումնասիրեցինք խմորիչի վրա, թե ինչպես են գլիկոզիլֆոսֆատիդիլինոզիտոլ (GPI) խարսխված սպիտակուցները (GPI-AP-ներ) տարբերակված կերպով արտահանվում ԷՑ-ից: GPI-AP-ները լիպիդներին կապված բջջային մակերեսի սպիտակուցների բազմազանություն են (6, 7): GPI-AP-ն սեկրետային սպիտակուց է, որը միացված է պլազմային թաղանթի արտաքին թևերին գլիկոլիպիդային մասի (GPI խարիսխ) միջոցով: Նրանք ընդունում են GPI խարիսխները որպես ԷՑ լուսանցքի պահպանողական հետթրանսլյացիոն փոփոխություններ (8): Կպչելուց հետո GPI-AP-ն անցնում է Գոլջիի ապարատով (5, 9) ԷԲ-ից դեպի պլազմային թաղանթ: GPI խարիսխների առկայությունը հանգեցնում է նրան, որ GPI-AP-ն տեղափոխվում է թաղանթային արտազատվող սպիտակուցներից (ներառյալ պլազմային թաղանթի այլ սպիտակուցներ) առանձին՝ սեկրետոր ուղով (5, 9, 10): Խմորիչի բջիջներում GPI-AP-ները առանձնացվում են այլ արտազատվող սպիտակուցներից էնդոպլազմային ցանցում, ապա փաթեթավորվում են եզակի վեզիկուլների մեջ, որոնք փաթաթված են II պատյանային սպիտակուցային համալիրով (COPII) (6, 7): ԷԲ արտահանման գործընթացում այս դասակարգման գործընթացի որոշիչները պարզ չեն, բայց ենթադրվում է, որ այս մեխանիզմը կարող է պահանջել լիպիդներ, մասնավորապես GPI խարիսխի լիպիդային մասի կառուցվածքային վերակառուցումը (5, 8): Խմորիչի մոտ GPI լիպիդային վերակառուցումը սկսվում է GPI-ի կպչելուց անմիջապես հետո, և շատ դեպքերում դա հանգեցնում է կերամիդի կապմանը 26-ածխածնային երկար շղթայով հագեցած ճարպաթթվի (C26:0) հետ (11, 12): C26 կերամիդը մինչ օրս խմորիչի բջիջների կողմից արտադրվող հիմնական կերամիդն է: Այն սինթեզվում է ԷՌ-ում և դրա մեծ մասը արտահանվում է Գոլջիի ապարատ COPII բշտիկների միջոցով (13): GPI-AP-ի ԷՌ արտահանումը հատկապես պահանջում է կերամիդի շարունակական սինթեզ (14, 15), և, իր հերթին, կերամիդի ինոզիտոլ ֆոսֆատ կերամիդի (IPC) փոխակերպումը Գոլջիի ապարատում կախված է GPI խարիսխի սինթեզից (16): Արհեստական ​​թաղանթներով կենսաֆիզիկական ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ շատ երկար ացիլ շղթայի կերամիդները կարող են միաձուլվել՝ ձևավորելով կարգավորված տիրույթներ՝ եզակի ֆիզիկական հատկություններով (17, 18): Այս տվյալները հանգեցնում են այն վարկածին, որ C26 կերամիդը և GPI-AP-ը C26 կերամիդի հետ օգտագործում են իրենց ֆիզիկական հատկությունները՝ միաձուլվելու կարգավորված շրջանների կամ շրջանների մեջ համեմատաբար անկարգ ԷՌ թաղանթի լիպիդային միջավայրում: Այն հիմնականում կազմված է կարճ և չհագեցած գլիցերիոլիպիդներից (C16:1 և C18:1) (19, 20): Այս շրջանները ընտրողաբար կկենտրոնանան ER-ի որոշակի ելքի կետերի (ERES) վրա, որտեղ կերամիդը և կերամիդային հիմքով GPI-AP-ը կարող են համատեղ տեղափոխվել Գոլջիի խոռոչ՝ նույն նվիրված COPII վեզիկուլով (5):
Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ուղղակիորեն փորձարկել ենք այս լիպիդային մեխանիզմը՝ օգտագործելով գերլուծաչափ կոնֆոկալ իրական ժամանակի պատկերման մանրադիտակ (SCLIM), որը առաջադեմ մանրադիտակի տեխնիկա է, որը կարող է միաժամանակ դիտարկել ֆլուորեսցենտային նշագրված սպիտակուցները: Եռագույն և եռաչափ (3D) պատկերները կենդանի բջիջներում ունեն չափազանց բարձր լուծաչափ և արագություն (21, 22):
Մենք սկզբում կիրառեցինք SCLIM տեխնոլոգիան՝ ավելի մանրամասն սահմանելու համար, թե ինչպես է S. cerevisiae-ի ER-ից դուրս գալուց հետո թաղանթային արտազատվող սպիտակուցներից սկրինինգ արվել C26 կերամիդային խմբով նորմալ GPI-AP-ն: ER-ի դասակարգումը ստուգելու համար մենք օգտագործեցինք գենետիկական համակարգ, որը կարող է անմիջապես պատկերացնել ERES մտնող նոր սինթեզված բեռը in vivo (7, 23): Որպես բեռ մենք ընտրեցինք կանաչ ֆլուորեսցենտ սպիտակուցով (GFP) նշագրված C26 կերամիդային GPI-AP Gas1-ը և մոտ ինֆրակարմիր ֆլուորեսցենտ սպիտակուցով (iRFP) նշագրված թաղանթային արտազատվող Mid2 սպիտակուցը, որոնք երկուսն էլ թիրախավորում են պլազմային թաղանթը (24–26): sec31-1 ջերմաստիճանի նկատմամբ զգայուն մուտանտի մոտ այս երկու բեռը արտահայտվում են գալակտոզայի ինդուկցվող պրոմոտորի և ERES մարկերի տակ: Ծայրահեղ ջերմաստիճանում (37°C), քանի որ sec31-1 մուտացիան ազդում է COPII պատյանի բաղադրիչ Sec31-ի ֆունկցիայի վրա՝ կանխելով COPII-ի բողբոջումը և ER-ի արտահանումը, նոր սինթեզված բեռը կուտակվում է ER-ում (23): Ցածր ջերմաստիճանի (24°C) սառեցնելուց հետո, sec31-1 մուտանտ բջիջները վերականգնվեցին սեկրետորային տարածքից, և կուտակված նոր սինթետիկ բեռը սկսեց արտահանվել ԷԲ-ից: CLIM վիզուալիզացիան ցույց տվեց, որ նոր սինթեզված Gas1-GFP-ի և Mid2-iRFP-ի մեծ մասը դեռևս կուտակվում էր sec31-1 մուտանտ բջիջների ԷԲ-ում 37°C ջերմաստիճանում ինկուբացիայից հետո, ապա 5 րոպե 24°C ջերմաստիճանում արտազատվելուց հետո (Նկար 1): Քանի որ Mid2-iRFP-ն բաշխված է ԷԲ-ի ամբողջ թաղանթի վրա, իսկ Gas1-GFP-ն կենտրոնացված և կուտակված է ԷԲ-ի անընդհատ թաղանթային տարածքում, դրանց բաշխումը բոլորովին տարբեր է (Նկար 1, A-ից C և Ֆիլմ S1): Բացի այդ, ինչպես ցույց է տրված Նկար 1D-ում, Gas1-GFP կլաստերը չունի Mid2-iRFP: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ GPI-AP-ն և թաղանթային սպիտակուցները վաղ շրջանում բաժանվել են ԷԲ-ի տարբեր թաղանթային շրջանների: Gas1-GFP կլաստերը հարակից է mCherry-ի COPII պատյանային սպիտակուց Sec13-ով նշագրված որոշակի ERES-ի (Նկար 1, E և F, և S1 ֆիլմ) (23):
sec31-1 բջիջները արտահայտում են գալակտոզայով առաջացած սեկրեցիաներ, երկար ացիլային շղթայի (C26) ցերամիդ GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, կանաչ) և Mid2-iRFP թաղանթային սպիտակուցը (TMP, կապույտ), և այս կառուցողական ERES պիտակավորումը Sec13-mCherry (ERES, մանուշակագույն) ինկուբացվել է 37°C ջերմաստիճանում 30 րոպե, տեղափոխվել է 24°C և պատկերվել SCLIM-ով 5 րոպե անց: (A-ից C)-ն ցույց է տալիս հարթության ներկայացուցչական միաձուլված կամ մեկ 2D պատկեր (A), 10 z-հատվածների 2D պրոյեկցիոն պատկեր (B) կամ բեռի և ERES մարկերների 3D բջջային կիսագնդի պատկեր (C): Մասշտաբի սյունակը՝ 1μm (A և B): Մասշտաբի միավորը 0.551μm է (C): Gas1-GFP-ն հայտնաբերվել է ER առանձին շրջաններում կամ կլաստերներում, մինչդեռ Mid2-iRFP-ն հայտնաբերվել և բաշխվել է ER թաղանթում (C): (D) Գրաֆիկը ցույց է տալիս Gas1-GFP և Mid2-iRFP-ի հարաբերական ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը Gas1-GFP կլաստերում սպիտակ նետաձողի գծի երկայնքով (ձախից): AU, կամայական միավոր: (E և F) ներկայացնում են եռաչափ պատկերը, որը համատեղում է ապրանքի և ERES նշանը: Gas1-GFP կլաստերները հայտնաբերվել են որոշակի ERES-ի մոտ: Մասշտաբի միավորը 0.551 մկմ է: (F) Սպիտակ պինդ նետը նշում է ERES-ի հետ կապված Gas1-GFP կլաստերը: Միջին և աջ վահանակները ցույց են տալիս միավորված մեծացված եռաչափ պատկերը և ընտրված Gas1-GFP կլաստերի պտտված տեսքը:
Gas1-GFP կլաստերի և որոշակի ERES-ի միջև սերտ տարածական կապը ցույց է տալիս, որ Gas1-GFP-ն կարող է մտնել ընտրողական ERES, ինչը տարբերվում է Mid2-iRFP-ի կողմից ER-ից դուրս գալու համար օգտագործվող ընտրողականությունից: Այս հնարավորությունը հաշվի առնելու համար մենք քանակականացրել ենք ERES հարաբերակցությունը միայն մեկ կամ երկու ապրանքների համար (Նկար 2, A-ից C): Մենք պարզել ենք, որ ERES-ի մեծ մասը (70%) պարունակում է միայն մեկ տեսակի բեռ: Նկար 2C-ի ներքևի պատկերը ցույց է տալիս ERES-ի երկու բնորոշ օրինակներ՝ միայն Gas1-GFP-ով (Նկար 1) կամ միայն Mid2-iRFP-ով (Նկար 2): Ի տարբերություն դրա, ERES-ի մոտավորապես 20%-ը պարունակում է երկու բեռ, որոնք համընկնում են նույն տարածքում: Պարզվել է, որ որոշ ERES (10%) պարունակում է երկու տեսակի բեռ, բայց դրանք մեկուսացված են եղել հստակ տարբեր տարածքներում: Հետևաբար, այս վիճակագրական վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ ER-ի արտահանումից հետո GPI-AP Gas1-GFP-ն և Mid2-iRFP թաղանթային բեռը բաժանվում են տարբեր ERES-ների (Նկար 2D): Այս տեսակավորման արդյունավետությունը շատ համապատասխանում է նախորդ կենսաքիմիական վերլուծությանը (6) և ձևաբանական որոշմանը (7): Մենք կարող ենք նաև դիտարկել ERES մտնող կարանտինային բեռի վարքագիծը (Նկար 2E և Ֆիլմ S2): Նկար 2E-ն ցույց է տալիս, որ Gas1-GFP-ի (վահանակ 3) կամ Mid2-iRFP-ի (վահանակ 4) միայն մի փոքր մասն է մտնում ERES մեկ կողմից և սահմանափակվում է առանձին տարածքում: Նկար 2E-ի 5-րդ վահանը ցույց է տալիս, որ Gas1-GFP-ն և Mid2-iRFP-ն երբեմն հանդիպում են նույն ERES-ում, բայց դրանք մտնում են տարբեր կողմերից և կենտրոնացած են առանձին շրջաններում, որոնք կարող են ներկայացնել տարբեր COPII վեզիկուլներ: Մենք նաև հաստատեցինք, որ C26 կերամիդային հիմքով GPI-AP Gas1-ի դիտարկված բաժանումը և դասակարգումը որպես ընտրողական ERES յուրահատուկ է, քանի որ մեկ այլ թաղանթային սեկրեցիայի բեռ՝ GFP-նշված պլազմային թաղանթի սպիտակուց Axl2-ը (27), ցուցաբերում է Mid2-iRFP-ին նման վարքագիծ: (Նկար S1 և Ֆիլմ S3): Նոր սինթեզված Axl2-GFP-ն բաշխվում է ER թաղանթով ինչպես Mid2-iRFP-ն (Նկար S1, A և B), և համատեղ տեղայնացված է Mid2-iRFP-ի հետ ERES-ների մեծ մասում (Նկար S1, B-ից D): Նկար 1-ի S1C վահանակների 1-ին և 2-րդ մասերը ցույց են տալիս ERES-ի երկու տիպիկ օրինակներ, որտեղ երկու թաղանթային բեռները համընկնում են: Այս դեպքերում երկու ապրանքներն էլ միասին են մտնում ERES (Նկար S1E, վահանակ 3 և ֆիլմ S3):
Գալակտոզով ինդուկցվող սեկրեցիաներ արտահայտող sec31-1 բջիջները, Gas1-GFP (GPI-AP, կանաչ) և Mid2-iRFP (TMP, կապույտ) և ERES-ի կազմող Sec13-mCherry (ERES, մանուշակագույն) պիտակավորումը տեղադրվել են 37°C ջերմաստիճանում: 30 րոպե ինկուբացիայից հետո °C ջերմաստիճանում տեղափոխել մինչև 24°C՝ սեկրեցիայի բլոկն ազատելու համար, և 20 րոպե անց պատկերել SCLIM-ով: (A-ից C) Բեռի և ERES-ով նշված 10 z-հատվածների ներկայացուցչական 2D պրոյեկցիոն պատկերներ (A; մասշտաբի գիծ, ​​1μm) կամ 3D բջջային կիսագնդերի պատկերներ (B և C; մասշտաբի միավոր, 0.456μm): (B)-ի ստորին վահանակը և (C)-ի վահանակը ցուցադրում են մշակված պատկերներ՝ ցուցադրելու միայն ERES-ում առկա ապրանքները (մանուշակագույն) [Gas1-GFP (մոխրագույն) և Mid2-iRFP (բաց կապույտ)]: (C) Բաց սլաք. ERES-ը կրում է միայն մեկ բեռ (1-ից 4): Մոխրագույն սլաք. ERES-ը պարունակում է առանձնացված բեռ (5): Սպիտակ միագույն սլաք. ERES-ը պարունակում է համատեղ տեղակայված բեռ: Ներքևում. Ընտրված միակ ERES-ը պարունակում է միայն Gas1-GFP (1) կամ Mid2-iRFP (2): Մասշտաբի գիծ, ​​100 նմ: (D) (C)-ում նկարագրված լուսանկարչական միկրոգրաֆիայի քանակականացումը: ERES-ի միջին տոկոսը, որը պարունակում է միայն մեկ բեռ (Gas1-GFP կամ Mid2-iRFP), առանձնացված բեռ և համընկնող բեռ: Երեք անկախ փորձերում, n=432 54 բջիջներում: Սխալի գիծ = SD: Երկկողմանի չզույգված t թեստ: *** P = 0.0002: (E) Կարանտինացված բեռի ընտրված ERES-ի եռաչափ պատկերը, որը նշված է (C)-ով: Gas1-GFP (կանաչ) (3) կամ Mid2-iRFP (կապույտ) (4) մտնում է ERES (մանուշակագույն) մի կողմից և սահմանափակվում է ERES-ի ներսում գտնվող փոքր տարածքով: Երբեմն երկու տեսակի բեռը մտնում են նույն ERES (5) նույն կողմից և սահմանափակվում են ERES-ի ներսում մեկուսացված տարածքով։ Սանդղակի գիծ, ​​100 նմ։
Հաջորդը, մենք ստուգեցինք մի վարկած, որ ER թաղանթում առկա երկար ացիլ շղթայի ցերամիդը (C26) խթանում է Gas1-ի յուրահատուկ կլաստերացումը և տեսակավորումը ընտրողական ERES-ի մեջ: Այս նպատակով մենք օգտագործեցինք GhLag1 ձևափոխված խմորիչի շտամ, որտեղ երկու էնդոգեն ցերամիդ սինթազները՝ Lag1-ը և Lac1-ը, փոխարինվել են GhLag1-ով (բամբակի Lag1 հոմոլոգը), ինչի արդյունքում ստացվել է խմորիչի շտամ, որի բջջային թաղանթի ցերամիդի շտամը ավելի կարճ է, քան վայրի տեսակը (Նկար 3A) (28): Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) վերլուծությունը ցույց տվեց, որ վայրի տիպի շտամներում ցերամիդի ընդհանուր քանակի 95%-ը շատ երկար (C26) շղթայի ցերամիդ է, մինչդեռ GhLag1-ում ցերամիդի 85%-ը շատ երկար (C18 և C16) շղթայի ցերամիդ է, ցերամիդի միայն 2%-ն է շատ երկար (C26) շղթայի ցերամիդ: Չնայած GhLag1 թաղանթում մինչ այժմ հայտնաբերված հիմնական կերամիդներն են C18 և C16 կերամիդները, MS վերլուծությունը նաև հաստատեց, որ GhLag1 շտամում արտահայտված Gas1-GFP-ի GPI խարիսխը պարունակում է C26 կերամիդ, որը համեմատելի է վայրի տիպի լիպիդների հետ: Որակը նույնն է (Նկար 3Ա) (26): Հետևաբար, սա նշանակում է, որ կերամիդի վերակառուցման ֆերմենտ Cwh43-ը բարձր ընտրողականություն ունի C26 կերամիդի նկատմամբ, ինչպես ցույց է տրված նկար 26-ում, այն նախընտրելիորեն ներառում է GPI խարիսխը GhLag1 շտամում C26 կերամիդի փոքր քանակությունից: S2 (29): Այնուամենայնիվ, GhLag1-ի բջջային թաղանթը հիմնականում պարունակում է միայն C18-C16 կերամիդ, մինչդեռ Gas1-GFP-ն դեռևս ունի C26 կերամիդ: Այս փաստը այս շտամը դարձնում է իդեալական գործիք՝ ԷՌ-ում թաղանթային կերամիդի ացիլային շղթայի երկարության խնդիրը հատուկ լուծելու համար: Դասի և տեսակավորման հիպոթետիկ դերը: Այնուհետև, մենք նախ ուսումնասիրեցինք C26 Gas1-GFP-ի կլաստերներում կուտակվելու ունակությունը GhLag1-ում՝ sec31-1 ջերմաստիճանի նկատմամբ զգայուն մուտանտ ալելով՝ ավանդական ֆլուորեսցենտային մանրադիտակի միջոցով, որտեղ ER թաղանթում՝ կերամիդում, գոյություն ունի միայն երկար (C18-C16) շղթան (Նկար 3): Մենք նկատեցինք, որ sec31-1-ում Gas1-GFP-ի մեծ մասը կենտրոնացած էր կլաստերներում, մինչդեռ sec31-1 GhLag1-ում՝ երկար (C18-C16) երկար կերամիդային ER թաղանթով, Gas1-GFP-ն հիմնականում չէր կլաստերացվում և բաշխված էր ամբողջ ER թաղանթում: Ավելի ճշգրիտ լինելու համար, քանի որ C26 կերամիդային կլաստերացումը սերտորեն կապված է որոշակի ERES-ի հետ (Նկար 1), մենք հետագայում ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք այս գործընթացը կարող է ներառել նաև ER արտահանման սպիտակուցի մեխանիզմի գործառույթը: GPI-AP-ն օգտագործում է COPII հատուկ համակարգ ER արտահանման համար, որը ակտիվորեն կարգավորվում է Ted1-ի կողմից GPI խարիսխի գլիկանային մասի կառուցվածքային վերակառուցմամբ (30, 31): Այնուհետև ռեկոմբինանտ GPI-գլիկանը ճանաչվում է թաղանթային բեռնափոխադրող p24 համալիրի կողմից, որն իր հերթին ընտրողաբար հավաքագրում է Lst1-ը, որը COPII հիմնական բեռնափոխադրող Sec24 ենթամիավորի յուրահատուկ իզոֆորմն է՝ ձևավորելով GPI-AP-հարուստ COPII վեզիկուլներ (31-33): Հետևաբար, մենք կառուցեցինք կրկնակի մուտանտ, որը համատեղեց այս միակ սպիտակուցների (p24 համալիրի բաղադրիչ Emp24, GPI-գլիկան վերակառուցող ֆերմենտ Ted1 և COPII Lst1 ենթամիավորի յուրահատուկ դելեցիան) sec31-1 մուտանտային շտամի հետ և ուսումնասիրեցինք դրանք՝ հնարավո՞ր է արդյոք ձևավորել Gas1-կլաստերային GFP (Նկար 3): Մենք նկատեցինք, որ sec31-1emp24Δ և sec31-1ted1Δ-ում Gas1-GFP-ն հիմնականում կլաստերացված չէ և տարածված է ամբողջ ER թաղանթում, ինչպես նախկինում նկատվել է sec31-1 GhLag1-ում, մինչդեռ sec31-1lst1Δ-ում Gas1-GFP-ն նման է sec31-1-ին: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ ER թաղանթում C26 ցերամիդի առկայությունից բացի, Gas1-GFP-ի կլաստերացումը պետք է նաև կապվի p24 համալիրի հետ և չի պահանջում Lst1-ի հատուկ հավաքագրում: Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք այն հնարավորությունը, որ ER թաղանթում ցերամիդի շղթայի երկարությունը կարող է կարգավորել Gas1-GFP-ի կապումը p24-ի հետ: Այնուամենայնիվ, մենք պարզեցինք, որ C18-C16 ցերամիդի առկայությունը թաղանթում չի ազդում p24 համալիրի կողմից վերակառուցված GPI-գլիկանների (Նկարներ S3 և S4, A և B) կամ GPI-AP-ի հետ կապվելու և GPI-AP արտահանելու ունակության վրա: Հավաքագրեք COPII Lst1 ենթատիպը (Նկար S4C): Հետևաբար, C26 ցերամիդ-կախյալ կլաստերացումը չի պահանջում սպիտակուցային փոխազդեցություններ ER-ի տարբեր արտահանման սպիտակուցային մեխանիզմների հետ, բայց աջակցում է լիպիդների երկարությամբ պայմանավորված այլընտրանքային տեսակավորման մեխանիզմին: Այնուհետև մենք վերլուծեցինք, թե արդյոք ER թաղանթում ցերամիդային ացիլ շղթայի երկարությունը կարևոր է Gas1-GFP-ի որպես ընտրողական ERES արդյունավետ դասակարգման համար: Քանի որ GhLag1 շտամի կարճ շղթայով կերամիդով Gas1-ը դուրս է գալիս ER-ից և մտնում պլազմային թաղանթ (Նկար S5), մենք կարծում ենք, որ եթե տեսակավորումը պայմանավորված է կերամիդային ացիլ շղթայի երկարությամբ, GhLag1 շտամի Gas1-ը կարող է վերահղվել և հատվել: ERES ապրանքներ նույն թաղանթով:
(Ա) GhLag1-ի բջջային թաղանթը հիմնականում պարունակում է ավելի կարճ C18-C16 կերամիդներ, մինչդեռ Gas1-GFP-ի GPI խարիսխը դեռևս ունի նույն C26 IPC-ն, ինչ վայրի տիպի բջիջները: Վերևում՝ վայրի տիպի (Wt) և GhLag1p շտամների բջջային թաղանթում ցերամիդի ացիլ շղթայի երկարության վերլուծությունը զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) միջոցով: Տվյալները ներկայացնում են ցերամիդի ընդհանուր պարունակության տոկոսը: Երեք անկախ փորձերի միջինը: Սխալի գիծ = SD: Երկկողմանի չզույգված t թեստ: **** P <0.0001: Ներքևի վահանակ՝ Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI խարիսխում առկա IPC-ի ացիլ շղթայի երկարության MS վերլուծություն, որը արտահայտված է վայրի տիպի և GhLag1p շտամներում: Տվյալները ներկայացնում են IPC-ի ընդհանուր ազդանշանի տոկոսային արժեքը: Հինգ անկախ փորձերի միջինը: Սխալի գիծ = SD: Երկկողմանի չզույգված t թեստ: ns, կարևոր չէ: P = 0.9134: (Բ) Գալակտոզայով ինդուկցված Gas1-GFP արտահայտող sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ և sec31-1lst1Δ բջիջների ֆլուորեսցենտային միկրոսկոպիաները ինկուբացվել են 37°C ջերմաստիճանում 30 րոպե և փոխանցվել են 24°C-ից հետո ֆլուորեսցենտային մանրադիտակի։ Սպիտակ սլաք՝ ER Gas1-GFP կլաստեր։ Բաց սլաք՝ չկլաստերացված Gas1-GFP-ն տարածված է ամբողջ ER թաղանթի վրա, ցույց տալով ER-ին բնորոշ միջուկային օղակի ներկումը։ Սանդղակի գիծ՝ 5 մկմ։ (Գ) (Բ)-ում նկարագրված ֆոտոմիկրոգրաֆիայի քանակական որոշումը։ Կետային Gas1-GFP կառուցվածք ունեցող բջիջների միջին տոկոսը։ Երեք անկախ փորձերում՝ n≥300 բջիջ։ Սխալի գիծ = SD։ Երկկողմանի չզույգված t թեստ։ **** P <0.0001։
Այս խնդիրը ուղղակիորեն լուծելու համար մենք կատարեցինք Gas1-GFP-ի և Mid2-iRFP-ի SCLIM վիզուալիզացիա GhLag1-ում՝ sec31-1 ջերմաստիճանի նկատմամբ զգայուն մուտանտ ալելով (Նկար 4 և Ֆիլմ S4): ER-ը 37°C ջերմաստիճանում պահպանելուց և հետագայում 24°C-ում արտազատելուց հետո, նոր սինթեզված Gas1-GFP-ի մեծ մասը չէր կլաստերացվում և բաշխվում ER թաղանթում, ինչպես դիտվում էր սովորական մանրադիտակներով (Նկար 4, A և B): Բացի այդ, ERES-ի մեծ տոկոսը (67%) ներառում է երկու տեսակի բեռ, որոնք համատեղ տեղակայված են դրանում (Նկար 4D): Նկար 4C-ի 1-ին և 2-րդ վահանակները ցույց են տալիս ERES-ի երկու տիպիկ օրինակներ՝ Gas1-GFP-ի և Mid2-GFP-ի համընկնող մասերով: Բացի այդ, երկու ապրանքներն էլ հավաքագրվել են նույն ERES-ի մեջ (Նկար 4E, վահանակ 3 և Ֆիլմ S4): Հետևաբար, մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ER թաղանթում կերամիդ ացիլ շղթայի երկարությունը ER սպիտակուցի ագրեգացիայի և դասակարգման կարևոր որոշիչ գործոն է:
Sec31-1 GhLag1 բջիջներ, որոնք արտահայտում են գալակտոզայով ինդուկցված սեկրեցիաներ, Gas1-GFP (GPI-AP, կանաչ) և Mid2-iRFP (TMP, կապույտ) և ERES-ով նշագրված Sec13-mCherry (ERES, մանուշակագույն): Ինկուբացեք 37°C ջերմաստիճանում: Շարունակեք 30 րոպե, իջեցրեք մինչև 24°C՝ սեկրեցիաները արտազատելու համար, և պատկերեք SCLIM-ով 20 րոպե անց: (A-ից C) Բեռով և ERES-ով նշված 10 z-հատվածների ներկայացուցչական 2D պրոյեկցիոն պատկերներ (A; մասշտաբի գիծ, ​​1μm) կամ 3D բջջային կիսագնդերի պատկերներ (B և C; մասշտաբի միավոր, 0.45μm): (B)-ի ստորին վահանակը և (C)-ի վահանակը ցուցադրում են մշակված պատկերներ՝ ցուցադրելու միայն ERES-ում առկա ապրանքները (մանուշակագույն) [Gas1-GFP (մոխրագույն) և Mid2-iRFP (բաց կապույտ)]: (C) Սպիտակով լցված սլաք. ERES, ապրանքները համընկնում են: Բաց սլաք. ERES-ը պարունակում է միայն մեկ տարր: Ստորին վահանակ. Ընտրված ERES-ը պարունակում է (C)-ում նշված համընկնող ապրանքներ (1 և 2): Մասշտաբի սյունակ, 100 նմ: (D) (C)-ում նկարագրված լուսանկարչական միկրոգրաֆիայի քանակականացումը: sec31-1 և sec31-1 GhLag1 միավորներում ներառված է միայն մեկ բեռ (Gas1-GFP կամ Mid2-iRFP), ինչպես նաև ERES-ի միջին տոկոսը մեկուսացված բեռի և համընկնող բեռի համար: Երեք անկախ փորձերում n = 432 54 բջիջներում (sec31-1) և n = 430 47 բջիջներում (sec31-1 GhLag1): Սխալի սյունակ = SD: Երկկողմանի չզույգված t թեստ: *** P = 0.0002 (sec31-1) և ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1): (E) Ընտրված ERES-ի եռաչափ պատկերը համընկնող բեռով (3) նշված (C)-ում: Gas1-GFP-ն (կանաչ) և Mid2-iRFP-ն (կապույտ) մոտենում են ERES-ին (մանուշակագույն) նույն կողմից և մնում նույն ERES սահմանափակ տարածքում: Սանդղակի գիծ, ​​100 նմ:
Այս ուսումնասիրությունը in vivo ուղղակի ապացույցներ է տրամադրում այն ​​մասին, որ լիպիդային սպիտակուցային բեռները դասակարգվում են սեկրետոր ուղու ընտրողական արտահանման վայրերում, և բացահայտում է ացիլ շղթայի երկարության կարևորությունը դասակարգման ընտրողականության համար: Օգտագործելով SCLIM կոչվող հզոր և առաջատար մանրադիտակային տեխնիկա, մենք ցուցադրեցինք նոր սինթեզված Gas1-GFP-ն (խմորիչի մեջ պլազմային թաղանթի հիմնական GPI-AP՝ շատ երկար ացիլ շղթայով (C26) կերամիդային լիպիդային մասով): Դիսկրետ ER-ներում կլաստերացված շրջանները կապված են հատուկ ERES-ի հետ, մինչդեռ թաղանթային արտազատվող սպիտակուցները բաշխված են ER թաղանթով մեկ (Նկար 1): Բացի այդ, այս երկու տեսակի ապրանքները ընտրողականորեն մտնում են տարբեր ERES (Նկար 2): Թաղանթում բջջային կերամիդի ացիլ շղթայի երկարությունը կրճատվում է C26-ից մինչև C18-C16, Gas1-GFP կլաստերը խզվում է դիսկրետ ER շրջանի, և Gas1-GFP-ն վերուղղորդվում է՝ ER-ից հեռանալու համար թաղանթային սպիտակուցի հետ նույն ERES-ի միջոցով (Նկար 3 և Նկար 3): 4):
Չնայած GPI-AP-ն օգտագործում է մասնագիտացված սպիտակուցային մեխանիզմ՝ ER-ից դուրս գալու համար, մենք պարզեցինք, որ C26 կերամիդ-կախյալ բաժանումը չի հիմնվում դիֆերենցիալ սպիտակուցային փոխազդեցությունների վրա, որոնք կարող են հանգեցնել ERES մասնագիտացման (Նկարներ S4 և S5): Փոխարենը, մեր արդյունքները հաստատում են այլընտրանքային դասակարգման մեխանիզմ, որը պայմանավորված է լիպիդների վրա հիմնված սպիտակուցային կլաստերացմամբ և հետագա այլ բեռների բացառմամբ: Մեր դիտարկումները ցույց են տալիս, որ որոշակի ERES-ի հետ կապված Gas1-GFP շրջանը կամ կլաստերը չունի Mid2-iRFP թաղանթային արտազատվող սպիտակուց, ինչը ցույց է տալիս, որ C26 կերամիդ-կախյալ GPI-AP կլաստերը կնպաստի դրանց մուտքին համապատասխան ERES և միևնույն ժամանակ կբացառի թաղանթային արտազատուկները, որոնք մտնում են այս կոնկրետ ERES (Նկարներ 1 և 2): Ի տարբերություն դրա, C18-C16 կերամիդների առկայությունը ER թաղանթում չի հանգեցնում GPI-AP-ի կողմից շրջանների կամ կլաստերների ձևավորմանը, ուստի դրանք չեն բացառում կամ չեն փոխարինում թաղանթային արտազատվող սպիտակուցները նույն ERES-ի մեջ (Նկարներ 3 և 4): Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ C26 կերամիդը խթանում է տարանջատումը և դասակարգումը՝ նպաստելով որոշակի ERES-ի հետ կապված սպիտակուցների կլաստերացմանը։
Ինչպե՞ս հասնել այս C26 կերամիդ-կախյալ կլաստերացմանը որոշակի ER տարածքում: Մեմբրանային կերամիդի կողմնային բաժանման հակումը կարող է հանգեցնել նրան, որ GPI-AP-ը և C26 կերամիդը առաջացնեն փոքր և ակնթարթորեն կարգավորված լիպիդներ ER թաղանթի ավելի անկանոն լիպիդային միջավայրում, որը պարունակում է ավելի կարճ և չհագեցած գլիցերիոլիպիդներ: Որակյալ կլաստերներ (17, 18): Այս փոքր ժամանակավոր կլաստերները կարող են հետագայում միաձուլվել ավելի մեծ, ավելի կայուն կլաստերների մեջ՝ p24 համալիրին կապվելուց հետո (34): Դրան համապատասխան, մենք ցույց տվեցինք, որ C26 Gas1-GFP-ն պետք է փոխազդի p24 համալիրի հետ՝ ավելի մեծ տեսանելի կլաստերներ ձևավորելու համար (Նկար 3): p24 համալիրը հետերոզիգոտ օլիգոմեր է, որը կազմված է խմորիչի չորս տարբեր p24 թաղանթային սպիտակուցներից (35), որոնք ապահովում են բազմարժեք կապ, ինչը կարող է հանգեցնել փոքր GPI-AP կլաստերների խաչաձև կապմանը, այդպիսով առաջացնելով ավելի մեծ կայուն կլաստեր (34): GPI-AP-ների սպիտակուցային էկտոդոմենների միջև փոխազդեցությունը նույնպես կարող է նպաստել դրանց ագրեգացմանը, ինչպես ցույց է տրվել կաթնասունների բևեռացված էպիթելային բջիջներում Գոլջիի մոտ դրանց տեղափոխման ժամանակ (36): Այնուամենայնիվ, երբ C18-C16 ցերամիդը առկա է ER թաղանթում, երբ p24 համալիրը կապվում է Gas1-GFP-ի հետ, մեծ առանձին կլաստերներ չեն ձևավորվի: Հիմքում ընկած մեխանիզմը կարող է կախված լինել երկար ացիլ շղթայով ցերամիդի ֆիզիկական և քիմիական հատկություններից: Արհեստական ​​թաղանթների կենսաֆիզիկական ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ չնայած երկար (C24), և կարճ (C18-C16) ացիլ շղթայով ցերամիդները կարող են առաջացնել փուլային տարանջատում, միայն երկար ացիլ շղթայով ցերամիդները (C24) կարող են խթանել բարձր կորությունը և թաղանթի ծռումը՝ թաղանթը վերաձևավորելու համար: Փոխադարձ հղումով (17, 37, 38): Ցույց է տրվել, որ TMED2-ի՝ Emp24-ի մարդու հոմոլոգի, թաղանթային պարույրը ընտրողաբար փոխազդում է C18 ցերամիդային սֆինգոմիելինի հետ ցիտոպլազմային լոբուլներում (39): Մոլեկուլային դինամիկայի (ՄԴ) մոդելավորումների միջոցով մենք պարզեցինք, որ և՛ C18, և՛ C26 կերամիդները կուտակվում են Emp24 թաղանթային պարույրի ցիտոպլազմային լոբուլների շուրջ, և դրանք ունեն նմանատիպ նախասիրություններ (Նկար S6): Հարկ է նշել, որ սա ցույց է տալիս, որ Emp24-ի թաղանթային պարույրը կարող է հանգեցնել լիպիդների ասիմետրիկ բաշխման թաղանթում: Սա վերջերս ստացված արդյունք է, որը հիմնված է կաթնասունների բջիջների վրա: Նմանատիպ ՄԴ մոդելավորումները նաև ցույց են տալիս եթերային լիպիդների առկայությունը (40): Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ ER26-ի երկու լոբուլներում C26 կերամիդը տեղայնորեն հարստացված է: Երբ լուսային լոբուլներում GPI-AP-ն անմիջապես կապվում է բազմարժեք p24-ի հետ, և C26 կերամիդի կուտակումը p24-ի շուրջ ցիտոպլազմային լոբուլներում կարող է խթանել ուղեկցող սպիտակուցային ագրեգացիան, և մատների միջոցով առաջանում է թաղանթի կորություն (41), ինչը հանգեցնում է GPI-AP-ի բաժանմանը ERES-ին հարակից առանձին շրջանների, ինչը նաև նպաստում է ER թաղանթի խիստ կոր շրջաններին (42): Նախորդ հաղորդագրությունները հաստատել են առաջարկվող մեխանիզմը (43, 44): Օլիգոլեկտինների, հարուցիչների կամ հակամարմինների բազմարժեք կապումը կերամիդային գլիկոսֆինգոլիպիդների (GSL) հետ պլազմային թաղանթի վրա առաջացնում է GSL-ի մեծ ագրեգացիա, ուժեղացնում է փուլային բաժանումը և առաջացնում թաղանթի դեֆորմացիա և ներքինացում (44): Իվաբուչի և այլն (43): Պարզվել է, որ երկար (C24), բայց ոչ կարճ (C16) ացիլային շղթաների առկայության դեպքում, GSL լակտոզիլցերամիդին կապված բազմարժեք լիգանդը առաջացնում է մեծ կլաստերների առաջացում և թաղանթի ներխուժում, իսկ ցիտոպլազմայի վրա Լին-միջնորդավորված ազդանշանի փոխանցումը միահյուսվում է ացիլային շղթաներով միացված նեյտրոֆիլներում:
Կաթնասունների բևեռացված էպիթելային բջիջներում հակա-Գոլջիի ցանցի (TGN) կոնցենտրացիան գագաթային պլազմային թաղանթի մակարդակով վերահսկում է GPI-AP-ի բաժանումը և տեսակավորումը (10, 45): Այս ագրեգացիան պայմանավորված է GPI-AP օլիգոմերացմամբ (36), բայց այն կարող է նաև կախված լինել խմորիչների մեջ հանդիպող կերամիդային շղթայի երկարությունից: Չնայած կաթնասունների GPI-AP-ն ունի եթերային լիպիդային հիմքով խարիսխ, և դրա քիմիական կառուցվածքը շատ տարբերվում է շատ երկար ացիլ շղթայի կերամիդից, վերջերս կատարված ուսումնասիրությունը պարզել է, որ երկու լիպիդներն էլ ունեն էվոլյուցիոն առումով նմանատիպ ֆիզիկական և քիմիական հատկություններ և գործառույթ (40): Հետևաբար, կաթնասունների բջիջներում եթերային լիպիդային մասը կարող է նման լինել խմորիչների C26 կերամիդին, և դրա դերը թաղանթում երկար շղթայի կերամիդի հետ կապվելն է՝ GPI-AP ագրեգացիան և տեսակավորումը խթանելու համար: Չնայած այս հնարավորությունը դեռ պետք է ուղղակիորեն ստուգվի, նախորդ արդյունքները հաստատում են, որ երկար ացիլ շղթայի կերամիդի տեղափոխումը Գոլջիի մարմնով չի իրականացվում ցիտոպլազմային փոխանցման սպիտակուցներով, այլ կախված է GPI խարիսխների սինթեզից, ինչպես խմորիչները: Հետևաբար, էվոլյուցիոն պահպանողական մեխանիզմը, կարծես, կարող է ընտրողաբար համատեղ տեղափոխել շատ երկար ացիլ շղթայով ցերամիդը և GPI-AP-ը (13, 16, 20, 46, 47) նույն տեղափոխման վեզիկուլում։
Խմորիչների և կաթնասունների բևեռացված էպիթելային բջջային համակարգերում GPI-AP-ի ագրեգացիան և այլ պլազմային թաղանթի սպիտակուցներից անջատումը տեղի է ունենում մինչև բջջի մակերեսին հասնելը: Պալադինոն և այլք (48) պարզել են, որ կաթնասունների բևեռացված էպիթելային բջիջների TGN-ի վրա GPI-AP կլաստերացումը ոչ միայն անհրաժեշտ է GPI-AP-ների ապիկալ պլազմային թաղանթում ընտրողական դասակարգման համար, այլև կարգավորում է GPI-AP-ների կլաստերացման կազմակերպումը և դրանց կենսաբանական ակտիվությունը: Բջջային մակերես: Խմորիչների մոտ այս ուսումնասիրությունը ցույց է տվել, որ ER-ի վրա գտնվող C26 կերամիդ-կախյալ GPI-AP կլաստերը կարող է կարգավորել GPI-AP-ի կլաստերի կազմակերպումը և ֆունկցիոնալ ակտիվությունը պլազմային թաղանթի վրա (24, 49): Այս մոդելին համապատասխան, GhLag1 բջիջները ալերգիկ են GPI ինհիբիտորների կամ բջջային պատի ամբողջականությանը ազդող դեղամիջոցների նկատմամբ (28), և խմորիչների բջիջների զուգավորման ժամանակ ծայրային կերամիդի ֆունկցիոնալ Gas1-GFP կլաստերների (49) անհրաժեշտությունը ցույց է տալիս G-ի առաջացումը: hLag1 բջիջների հնարավոր ֆիզիոլոգիական հետևանքները: GPI-AP սխալ: Այնուամենայնիվ, մեր ապագա հետազոտության առարկա կլինի բջջային մակերևույթի ֆունկցիոնալ կազմակերպման ծրագրավորման հետագա ստուգումը ԷՌ-ից՝ լիպիդների երկարության վրա հիմնված տեսակավորման մեթոդով։
Այս աշխատանքում օգտագործված Saccharomyces cerevisiae շտամները ներկայացված են S1 աղյուսակում: Կենդանի բջիջների պատկերման համար SCLIM-ի MMY1583 և MMY1635 շտամները կառուցվել են W303-ի ֆոնի վրա: Sec13-mCherry-ն ֆլուորեսցենտ սպիտակուցային պիտակով արտահայտող այս շտամները կառուցվել են պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (PCR) վրա հիմնված մեթոդով՝ pFA6a պլազմիդը որպես ձևանմուշ օգտագործելով (23): GAL1 պրոմոտորի վերահսկողության տակ ֆլուորեսցենտ սպիտակուցով նշագրված Mid2-iRFP արտահայտող շտամը կառուցվել է հետևյալ կերպ: iRFP-KanMx հաջորդականության ՊՇՌ ուժեղացում pKTiRFP-KAN վեկտորից (E. O'Shea-ի նվեր, Addgene պլազմիդի համար 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; հետազոտական ​​ռեսուրսի նույնականացուցիչ (RRID): Addgene_64687) և ներդրվել էնդոգեն Mid2-ի C-ծայրամասում: Mid2-iRFP գենոմի հաջորդականությունը GAL1 պրոմոտորում ամպլիֆիկացնելուց և կլոնավորելուց հետո, այն ինտեգրվեց pRS306 ինտեգրացիոն պլազմիդի Not I-Sac I տեղամասում: Արդյունքում ստացված pRGS7 պլազմիդը գծայնացվեց Pst I-ով՝ URA3 լոկուսի մեջ ինտեգրվելու համար:
Gas1-GFP միաձուլման գենը արտահայտվում է GAL1 պրոմոտորի վերահսկողության ներքո ցենտրոմերի (CEN) պլազմիդում, որը կառուցված է հետևյալ կերպ։ Gas1-GFP հաջորդականությունը ուժեղացվել է ՊՇՌ-ով pRS416-GAS1-GFP պլազմիդից (24) (L. Popolo-ի նվեր) և կլոնավորվել է CEN պլազմիդի pBEVY-GL LEU2 (C-ի նվեր) Xma I–Xho I տեղում։ Miller; Addgene պլազմիդի համար 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225): Արդյունքում ստացված պլազմիդը անվանվել է pRGS6: Axl2-GFP միաձուլման գենը նույնպես արտահայտվում է pBEVY-GL LEU2 վեկտորի GAL1 պրոմոտորի վերահսկողության ներքո, և դրա կառուցվածքը հետևյալն է։ Axl2-GFP հաջորդականությունը ամպլիֆիկացվել է pRS304-p2HSE-Axl2-GFP պլազմիդից (23) ՊՇՌ-ի միջոցով և կլոնավորվել է pBEVY-GL LEU2 վեկտորի Bam HI-Pst I տեղում: Արդյունքում ստացված պլազմիդը անվանվել է pRGS12: Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված օլիգոնուկլեոտիդների հաջորդականությունը ներկայացված է S2 աղյուսակում:
Շտամը լրացվել է 0.2% ադենինով և 2% գլյուկոզով [YP-դեքստրոզ (YPD)], 2% ռաֆինոզով [YP-ռաֆինոզ] հարուստ խմորիչի քաղվածքով սպիտակուցային p (YP) միջավայրով (1% խմորիչի քաղվածք և 2% սպիտակուցային ept. (YPR)] կամ 2% գալակտոզով [YP-գալակտոզ (YPG)] որպես ածխածնի աղբյուր, կամ սինթետիկ նվազագույն միջավայրում (0.15% խմորիչի ազոտային հիմք և 0.5% ամոնիումի սուլֆատ)՝ սննդի համար անհրաժեշտ համապատասխան ամինաթթուներն ու հիմքերը լրացնելու համար, և պարունակում է 2% գլյուկոզ (սինթետիկ գլյուկոզային նվազագույն միջավայր) կամ 2% գալակտոզա (սինթետիկ գալակտոզային նվազագույն միջավայր) որպես ածխածնի աղբյուր։
Իրական ժամանակի պատկերման համար, ջերմաստիճանին զգայուն sec31-1 մուտանտ բջիջները, որոնք արտահայտում էին կառուցվածքը GAL1 պրոմոտորի տակ, աճեցվել են YPR միջավայրում 24°C ջերմաստիճանում գիշերը մինչև միջին լոգարիթմական փուլը: YPG-ում 24°C ջերմաստիճանում 1 ժամ ինդուկցիայի ենթարկվելուց հետո, բջիջները ինկուբացվել են SG-ում 37°C ջերմաստիճանում 30 րոպե, ապա տեղափոխվել են 24°C ջերմաստիճան՝ սեկրեցիայի բլոկից դուրս գալու համար: Կոնկանավալին A-ն օգտագործվել է բջիջները ապակե սահիկի վրա ֆիքսելու համար և պատկերվել է SCLIM-ի միջոցով: SCLIM-ը Olympus IX-71 շրջված ֆլուորեսցենտային մանրադիտակի և UPlanSApo 100×1.4 թվային ապերտուրայի յուղային ոսպնյակի (Olympus), բարձր արագության և բարձր ազդանշան-աղմուկ հարաբերակցությամբ պտտվող սկավառակային կոնֆոկալ սկաների (Yokogawa Electric), հատուկ սպեկտրոմետրի և հատուկ սառեցման համադրություն է: Համակարգի պատկերի ուժեղացուցիչը (Hamamatsu Photonics) կարող է ապահովել խոշորացնող ոսպնյակի համակարգ՝ ×266.7 վերջնական մեծացմամբ և լիցքով միացված սարքի տեսախցիկով, որը բազմապատկում է էլեկտրոնները (Hamamatsu Photonics) (21): Պատկերի ստացումը կատարվում է հատուկ ծրագրաշարով (Yokogawa Electric): 3D պատկերների համար մենք օգտագործել ենք հատուկ պատրաստված պիեզոէլեկտրական ակտիվատոր՝ օբյեկտիվի ուղղահայաց տատանման համար, և օպտիկական մասերը հավաքագրել ենք 100 նմ հեռավորության վրա գտնվող կույտում: Z-կույտի պատկերը վերածվում է 3D վոքսելային տվյալների, իսկ պտտվող սկավառակային կոնֆոկալ մանրադիտակի համար օգտագործվող տեսական կետային տարածման ֆունկցիան օգտագործվում է Volocity ծրագրաշարի (PerkinElmer) կողմից դեկոնվոլյուցիայի մշակման համար: Volocity ծրագրաշարի միջոցով համատեղ տեղակայման վերլուծության համար ավտոմատ շեմի սահմանման համար չափվել է ERES-ը, ներառյալ բեռը: Գծային սկանավորման վերլուծությունը կատարվել է MetaMorph ծրագրաշարի (Molecular Devices) միջոցով:
Վիճակագրական նշանակալիությունը որոշելու համար օգտագործեք GraphPad Prism ծրագիրը: Երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստի և սովորական միակողմանի դիսպերսիայի վերլուծության (ANOVA) թեստի համար խմբերի միջև տարբերությունները համարվում են նշանակալի ազդեցություն ունեցող P <0.05 (*)-ի վրա:
Gas1-GFP-ի ֆլուորեսցենտային մանրադիտակի համար լոգարիթմական փուլի բջիջները աճեցվել են YPD-ում գիշերը և հավաքվել ցենտրիֆուգացման միջոցով, երկու անգամ լվացվել են ֆոսֆատային բուֆերային աղաջրով և ինկուբացվել սառույցի վրա առնվազն 15 րոպե, ապա շարունակվել են մանրադիտակի տակ՝ ինչպես նկարագրվել է նախկինում՝ Ստուգում (24): Ստուգման համար օգտագործվել է Leica DMi8 մանրադիտակը (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), որը հագեցած է օբյեկտիվ ոսպնյակով, L5 (GFP) ֆիլտրով, Hamamatsu տեսախցիկով և Application Suite X (LAS X) ծրագրաշարով:
Նմուշները դենատուրացվել են SDS նմուշային բուֆերով 65°C ջերմաստիճանում 10 րոպե, ապա առանձնացվել են SDS-պոլիակրիլամիդային գել էլեկտրոֆորեզով (PAGE): Իմունոբլոտինգային վերլուծության համար յուրաքանչյուր գծի համար բեռնվել է 10 մկլ նմուշ: Առաջնային հակամարմին. Օգտագործվել է ճագարի պոլիկլոնալ հակա-Gas1՝ 1:3000 նոսրացմամբ, ճագարի պոլիկլոնալ հակա-Emp24՝ 1:500 նոսրացմամբ և ճագարի պոլիկլոնալ հակա-GFP (նվեր Հ. Ռիզմանից)՝ 1:3000 նոսրացմամբ: Մկան մոնոկլոնալ հակա-Pgk1 հակամարմինն օգտագործվել է 1:5000 նոսրացմամբ (նվեր Ջ. դե լա Կրուզից): Երկրորդային հակամարմին. Ձիու պերօքսիդազով (HRP) կոնյուգացված այծի հակա-ճագարի իմունոգլոբուլին G (IgG)՝ օգտագործված 1:3000 նոսրացմամբ (Փիրս): HRP-կոնյուգացված այծի հակա-մկան IgG՝ օգտագործված 1:3000 նոսրացմամբ (Փիրս): Իմունային պատասխանի գոտին դիտարկվել է SuperSignal West Pico ռեակտիվի (Thermo Fisher Scientific) քեմիլյումինեսցենցիայի մեթոդով։
Ինչպես նկարագրված է (31)-ում, հարստացված ER ֆրակցիայի վրա իրականացվել է բնական իմունոպառեցման փորձ։ Հակիրճ ասած, խմորիչի բջիջները լվացվել են TNE բուֆերով [50 մՄ տրիս-HCl (pH 7.5), 150 մՄ NaCl, 5 մՄ EDTA, 1 մՄ ֆենիլմեթիլսուլֆոնիլֆտորիդ և պրոտեազի ինհիբիտորի խառնուրդ) 600 նմ (OD600) երկարությամբ և 100 օպտիկական խտությամբ երկու անգամ։ Այն կոտրվել է ապակե գնդիկներով, ապա բջջային մնացորդները և ապակե գնդիկները հեռացվել են ցենտրիֆուգացման միջոցով։ Այնուհետև վերին շերտը ցենտրիֆուգացվել է 17,000 գ-ի վրա 15 րոպե 4°C ջերմաստիճանում։ Գնդիկը վերստին սուսպենդացվել է TNE-ի մեջ և ավելացվել է դիգիտալիս սապոնին մինչև 1% վերջնական կոնցենտրացիա։ Կուպրիզացիան ինկուբացվել է 1 ժամ՝ պտտվելով 4°C ջերմաստիճանում, ապա անլուծելի բաղադրիչները հեռացվել են ցենտրիֆուգացման միջոցով 13,000 գ-ի վրա 4°C ջերմաստիճանում 60 րոպե։ Gas1-GFP իմունոպրեցիպիտացիայի համար նախ նախնական ինկուբացեք նմուշը դատարկ ագարոզային գնդիկներով (ChromoTek) 4°C ջերմաստիճանում 1 ժամ, ապա ինկուբացեք GFP-Trap_A-ով (ChromoTek) 4°C ջերմաստիճանում 3 ժամ: Իմունոպրեցիպիտացված գնդիկները հինգ անգամ լվացվեցին 0.2% դիգօքսիգենին պարունակող TNE-ով, էլուացվեցին SDS նմուշային բուֆերով, առանձնացվեցին SDS-PAGE-ի վրա և վերլուծվեցին իմունոբլոտինգի միջոցով:
Ինչպես նկարագրված է (31)-ում, խաչաձև կապի որոշում է իրականացվել հարստացված ER ֆրակցիայի վրա: Հակիրճ ասած, հարստացված ER ֆրակցիան ինկուբացվել է 0.5 մՄ դիթիոբիս(սուկցինիմիդիլ պրոպիոնատ)-ի հետ (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 րոպե): Խաչաձև կապի ռեակցիան մարվել է գլիցինի ավելացմամբ (50 մՄ վերջնական կոնցենտրացիա, 5 րոպե, 20°C):
Ինչպես նախկինում նկարագրվել է (50), իրականացվել է ցերամիդի MS վերլուծություն վայրի տիպի և GhLag1 շտամներում: Ամփոփելով՝ բջիջները աճեցվել են մինչև էքսպոնենցիալ փուլ (3-ից 4 OD600 միավոր/մլ) YPD-ում 30°C ջերմաստիճանում, և հավաքվել է 25×107 բջիջ: Դրանց նյութափոխանակությունը մարվում է եռաքաղցաթթվով: Օգտագործվում է արդյունահանման լուծիչ [էթանոլ, ջուր, եթեր, պիրիդին և 4.2 N ամոնիումի հիդրօքսիդ (15:15:5:1:0.018 v/v)] և 1.2 նմոլ ներքին ստանդարտ C17 ցերամիդ (860517, Avanti բևեռային լիպիդ) որակ): Օգտագործվում է մոնոմեթիլամինային ռեակտիվ [մեթանոլ, ջուր, n-բութանոլ և մեթիլամինի լուծույթ (4:3:1:5 v/v)]՝ արդյունահանման թույլ ալկալային հիդրոլիզ կատարելու համար, ապա օգտագործվում է ջրով հագեցած n-բութանոլ՝ աղազրկելու համար: Վերջապես, քաղվածքը վերստին լուծվել է դրական ռեժիմի լուծիչում [քլորոֆորմ/մեթանոլ/ջուր (2:7:1) + 5 մՄ ամոնիումի ացետատ] և ներարկվել է զանգվածային սպեկտրոմետրի մեջ: Սֆինգոլիպիդների մոլեկուլների նույնականացման և քանակական որոշման համար իրականացվել է բազմակի ռեակցիայի մոնիթորինգ (MRM): TSQ Vantage երրորդային քառաբևեռ զանգվածային սպեկտրոմետրը (Thermo Fisher Scientific) հագեցած է լիպիդային վերլուծության համար նախատեսված Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ռոբոտացված նանոհոսքային իոնային աղբյուրով: Բախման էներգիան օպտիմալացված է կերամիդի յուրաքանչյուր կատեգորիայի համար: MS տվյալները ստացվել են դրական ռեժիմով: Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակի համար լիպիդային ազդանշանը երեք անկախ չափումների միջնարժեքն է:
Ինչպես նկարագրված է (31)-ում, Gas1-GFP արտահայտող բջիջները (800×107) ենթարկվել են բնական իմունոպրեցիպիտացիայի: Մաքրված Gas1-GFP-ն առանձնացվել է SDS-PAGE-ի միջոցով և տեղափոխվել պոլիվինիլիդենֆտորիդային (PVDF) թաղանթի մեջ: Սպիտակուցը տեսանելի է դարձել PVDF-ը ամիդային սևով ներկելու միջոցով: Gas1-GFP գոտին կտրվել է PVDF-ից և լվացվել 5 անգամ մեթանոլով և մեկ անգամ՝ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի-MS (LC-MS) որակի ջրով: Թաղանթային շերտը 37°C ջերմաստիճանում 3 ժամ ինկուբացելով 500 մկլ 0.3 Մ NaOAc (pH 4.0), բուֆերով և 500 մկլ թարմ լուծված 1 Մ նատրիումի նիտրիտային խառնուրդով, լիպիդային ֆրակցիան ազատվում է Gas1-GFP-ից և լիզացվում: Ինոզին ֆոսֆատ կերամիդի արտազատում գլյուկոզամինի և ինոզիտոլի (51) միջև: Դրանից հետո, թաղանթային շերտը չորս անգամ լվացվեց LC-MS որակի ջրով, չորացվեց սենյակային ջերմաստիճանում և պահվեց ազոտի մթնոլորտում -80°C ջերմաստիճանում մինչև վերլուծությունը: Որպես վերահսկիչ միջոց, յուրաքանչյուր փորձի համար օգտագործվել է PVDF թաղանթի դատարկ նմուշ: Gas1-GFP-ից արդյունահանված լիպիդը այնուհետև վերլուծվել է MS մեթոդով՝ նկարագրվածի համաձայն (50): Ամփոփելով՝ GPI-lipid պարունակող PVDF շերտերը վերասուսպենդացվել են 75 մկլ բացասական կաղապարի լուծիչում [քլորոֆորմ/մեթանոլ (1:2) + 5 մՄ ամոնիումի ացետատ] և ենթարկվել են սֆինգոլիպիդային տեսակների էլեկտրացողման իոնացման (ESI)-MRM/MS վերլուծության (TSQ Vantage): Այս դեպքում, MS տվյալները ստացվել են բացասական իոնային ռեժիմով:
Ինչպես նշվեց ավելի վաղ, GPI խարիսխի լիպիդային մասը առանձնացվեց [3H]-ինոզիտոլով նշագրված GPI-AP-ից (16): Լիպիդները առանձնացվեցին բարակ շերտային քրոմատոգրաֆիայի միջոցով՝ օգտագործելով լուծիչ համակարգ (55:45:10 քլորոֆորմ-մեթանոլ-0.25% KCl) և վիզուալիզացվեցին FLA-7000 (Fujifilm) միջոցով:
Gas1-GFP (600×107) արտահայտող բջիջները երկու անգամ լվացվել են TNE բուֆերով՝ TNE բուֆերով, ապա կոտրվել են ապակե գնդիկներով, ապա ցենտրիֆուգացվել՝ բջջային մնացորդներն ու ապակե գնդիկները հեռացնելու համար: Այնուհետև վերին շերտը ցենտրիֆուգացվել է 17,000 գ-ով 1 ժամ 4°C ջերմաստիճանում: Գնդիկը լվացվել է TNE-ով և ինկուբացվել 1 U PI-PLC (Invitrogen)-ով TNE-ում, որը պարունակում է 0.2% դիգիտալիս սապոնին, 1 ժամ 37°C ջերմաստիճանում: Ֆերմենտային մշակումից հետո թաղանթը հեռացվել է ցենտրիֆուգացման միջոցով 17,000 գ-ով 4°C ջերմաստիճանում 1 ժամ: Gas1-GFP-ն իմունոպրեցիպիտատացնելու համար վերին շերտը ինկուբացվել է GFP-Trap_A (ChromoTek)-ով 4°C ջերմաստիճանում ամբողջ գիշեր: SDS-PAGE-ով առանձնացված մաքրված Gas1-GFP-ն ներկվել է Coomassie-ի փայլուն կապույտ գույնով: Gas1-GFP ներկման գոտին կտրվեց ջրատարը շրջապատող մոխրագույնից, ապա յոդոացետամիդով ալկիլացումից և դիթիոթրեիտոլով վերականգնումից հետո կատարվեց գելային մարսողություն տրիպսինով: Եզրահատիկացրեք և չորացրեք տրիպսինային պեպտիդները և պեպտիդները GPI-գլիկաններով: Չորացրած պեպտիդը լուծվեց 20 մկլ ջրի մեջ: Մի մասը (8 մկլ) ներարկեք LC-ի մեջ: Պեպտիդները որոշակի գրադիենտային պայմաններում առանձնացնելու համար օգտագործվել է օկտադեցիլսիլանային (ODS) սյուն (Develosil 300ODS-HG-5; ներքին տրամագիծը՝ 150 մմ × 1.0 մմ; Nomura Chemical, Այչիի պրեֆեկտուրա, Ճապոնիա): Շարժական փուլը լուծիչ A-ն է (0.08% մրջնաթթու) և լուծիչ B-ն (0.15% մրջնաթթու 80% ացետոնիտրիլում): Accela HPLC համակարգով (Thermo Fisher Scientific, Բոստոն, Մասաչուսեթս) սյունը լուծիչ A-ով էլուացնելու համար օգտագործվել է 55 րոպեի ընթացքում 50 մկլ րոպե-1 հոսքի արագությամբ 5 րոպեի ընթացքում, ապա լուծիչ B-ի կոնցենտրացիան բարձրացվել է մինչև 40% (ԱՄՆ): Էլյուատը անընդհատ ներմուծվել է ESI իոնային աղբյուրի մեջ, և տրիպսինային պեպտիդները և GPI-գլիկաններով պեպտիդները վերլուծվել են LTQ Orbitrap XL-ով (հիբրիդային գծային իոնային թակարդ-օրբիտրապ զանգվածային սպեկտրոմետր; Thermo Fisher Scientific): MS համակարգում մազանոթային աղբյուրի լարումը սահմանվել է 4.5 կՎ, իսկ փոխանցման մազանոթի ջերմաստիճանը պահպանվել է 300°C-ի վրա: Մազանոթային լարումը և խողովակի ոսպնյակի լարումը սահմանվել են համապատասխանաբար 15 Վ և 50 Վ: MS տվյալները ստացվել են դրական իոնային ռեժիմով (60,000 լուծաչափ, զանգվածի ճշգրտություն՝ 10 մաս միլիոնում)՝ 300/մ/զ զանգվածի/լիցքի հարաբերակցության (մ/զ) 3000 զանգվածի տիրույթում: MS/MS տվյալները ստացվել են LTQ Orbitrap XL-ի իոնային թակարդի միջոցով [տվյալների վրա հիմնված առաջին 3 թվանշանները՝ բախման հետևանքով առաջացած դիսոցիացիա (CID)]:
ՄԴ մոդելավորումները կատարվել են GROMACS (52) ծրագրաշարի և MARTINI 2 ուժային դաշտի (53-55) միջոցով: Այնուհետև CHARMM GUI թաղանթային կառուցիչը (56, 57) օգտագործվել է դիոլեոիլֆոսֆատիդիլխոլին (DOPC) և Cer C18 կամ DOPC և Cer C26 պարունակող երկշերտ կառուցելու համար: Cer C26-ի տոպոլոգիան և կոորդինատները ստացվել են DXCE-ից՝ սֆինգոզինի պոչից ավելորդ գնդիկները հեռացնելով: Օգտագործեք ստորև նկարագրված գործընթացը՝ կրկնակի շերտը հավասարակշռելու և այն գործարկելու համար, այնուհետև օգտագործեք համակարգի վերջին կոորդինատները՝ Emp24 պարունակող համակարգ կառուցելու համար: Խմորիչի Emp24-ի թաղանթային տիրույթը (մնացորդներ 173-ից 193) կառուցվել է որպես α-պարույր՝ օգտագործելով տեսողական MD (VMD) գործիքի մոլեկուլային կառուցվածքը (58): Այնուհետև, համընկնող լիպիդները հեռացնելուց հետո, սպիտակուցը կոպիտ հատիկավորվել է և տեղադրվել երկշերտի մեջ՝ օգտագործելով CHARMM GUI: Վերջնական համակարգը պարունակում է 1202 DOPC և 302 Cer C26 կամ 1197 DOPC և 295 Cer C18 և Emp24: Համակարգը իոնացրեք մինչև 0.150M կոնցենտրացիա: Երկու երկշերտ կազմությունների համար կատարվել են չորս անկախ կրկնօրինակներ:
Լիպիդային երկշերտը հավասարակշռվում է CHARMM GUI գործընթացի միջոցով, որը ներառում է 405,000 քայլի նվազագույնի հասցնելը և հավասարակշռումը, որտեղ դիրքի սահմանափակումները աստիճանաբար նվազեցվում և վերացվում են, իսկ ժամանակային քայլը մեծանում է 0.005 ps-ից մինչև 0.02 ps: Հավասարակշռությունից հետո այն արտադրում է 6 մկվրկ՝ 0.02 ps ժամանակային քայլով: Emp24-ը տեղադրելուց հետո օգտագործեք նույն CHARMM GUI գործընթացը՝ համակարգը նվազագույնի հասցնելու և հավասարակշռելու համար, ապա աշխատացրեք 8 վայրկյան արտադրության մեջ:
Բոլոր համակարգերի համար, հավասարակշռման գործընթացի ընթացքում, ճնշումը կարգավորվում է Բերենդսենի բարոստատով (59), իսկ արտադրության գործընթացի ընթացքում՝ Պարրինելլո-Ռահմանի բարոստատով (60): Բոլոր դեպքերում միջին ճնշումը 1 բար է, և օգտագործվում է կիսաիզոտրոպ ճնշման միացման սխեմա: Հավասարակշռման և արտադրության գործընթացում, սպիտակուցի, լիպիդի և լուծիչի մասնիկների ջերմաստիճանը համապատասխանաբար միացնելու համար օգտագործվում է արագության վերակարգավորմամբ ջերմակարգավորիչ (61): Ամբողջ գործողության ընթացքում նպատակային ջերմաստիճանը 310K է: Ոչ կապող փոխազդեցությունը հաշվարկվում է զույգերի ցուցակ ստեղծելով՝ օգտագործելով Վերլեի սխեման՝ 0.005 բուֆերային հանդուրժողականությամբ: Կուլոնի անդամը հաշվարկվում է ռեակցիայի դաշտի և 1.1 նմ կտրման հեռավորության միջոցով: Վանդեր-Վալսի անդամը օգտագործում է 1.1 նմ կտրման հեռավորությամբ կտրման սխեմա, իսկ Վերլեի կտրման սխեման օգտագործվում է պոտենցիալ շեղման համար (62):
VMD-ի միջոցով DOPC ֆոսֆատային գնդիկների կամ կերամիդային AM1 գնդիկների և սպիտակուցի միջև սահմանային ալիքի երկարությունը 0.7 նմ է, և հաշվարկվում է սպիտակուցի հետ փոխազդող լիպիդների քանակը: Հետևյալ բանաձևի համաձայն, հաշվարկեք սպառման-հարստացման (DE) գործակիցը, ինչպես նշված է (63)-ում. DE գործակից = (սպիտակուցում ընդհանուր լիպիդների քանակը 0.7) սպիտակուցում 0.7 (Cer-ի քանակը ընդհանուր լիպիդներում):
Հաղորդված արժեքը ստացվում է որպես միջին, իսկ սխալի սյուները SE-ի չորս անկախ պատճեններն են: DE գործակցի վիճակագրական նշանակալիությունը հաշվարկվում է t թեստով [(միջինDE-գործակից-1)/SE]: Հաշվարկեք P արժեքը միակողմանի բաշխումից:
GROMACS գործիքը օգտագործվել է հետագծի վերջին 250 նվ-ում Emp24 պարունակող համակարգի երկչափ կողմնային խտության քարտեզը հաշվարկելու համար: Ցերամիդի հարստացման/քայքայման քարտեզը ստանալու համար Cer-ի խտության քարտեզը բաժանվում է Cer-ի և DOPC-ի քարտեզի գումարի վրա, ապա բաժանվում է մարմնում Cer-ի կոնցենտրացիայի վրա: Օգտագործվում է նույն գունային քարտեզի սանդղակը:
Այս հոդվածի լրացուցիչ նյութերի համար այցելեք http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 կայքը։
Սա բաց մատչելիության հոդված է, որը տարածվում է Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ի պայմաններով, որը թույլ է տալիս օգտագործել, տարածել և վերարտադրել ցանկացած միջավայրում, քանի դեռ վերջնական օգտագործումը առևտրային շահույթի համար չէ, և նախադրյալն այն է, որ բնօրինակ աշխատանքը ճիշտ է: Հղում:
Նշում. Մենք խնդրում ենք ձեզ տրամադրել ձեր էլեկտրոնային փոստի հասցեն միայն այն դեպքում, եթե այն ձեր կողմից խորհուրդ տրվող անձը իմանա, որ դուք ցանկանում եք, որ նա տեսնի էլեկտրոնային նամակը, և որ այն սպամ չէ: Մենք չենք գրանցի որևէ էլեկտրոնային փոստի հասցե:
Այս հարցն օգտագործվում է ձեր այցելու լինելը ստուգելու և ավտոմատ սպամի ուղարկումը կանխելու համար։
Սոֆյա Ռոդրիգես-Գալյարդո, Կաձուո Կուրոկավա, Սուսանա Սաբիդո-Բոզո, Ալեխանդրո Կորտես · Գոմես (Ալեխանդրո Կորտես-Գոմես), Ացուկո Իկեդա (Ացուկո Իկեդա), Վալերիա Զոնի (Վալերիա Զոնի), Աուքսիլիադորա Ագիլերա-Ռոմերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Ռոմերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Ռոմերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Ռոմերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Լոպեո. Վագա (Միհո Վագա), Միսակո Արման (Միսակո Արման), Միյակո Ռիման (Միյակո Ռիման), Պրոու Ակիրա, Ստեֆանո Ֆաննի, Ակիհիկո Նականո, Մանուել Մունիզ
Եռաչափ բարձր թույլտվությամբ իրական ժամանակի պատկերումը բացահայտում է կերամիդային շղթայի երկարության կարևորությունը ընտրողական ելքային կետերում սպիտակուցների տեսակավորման համար։
Սոֆյա Ռոդրիգես-Գալյարդո, Կաձուո Կուրոկավա, Սուսանա Սաբիդո-Բոզո, Ալեխանդրո Կորտես · Գոմես (Ալեխանդրո Կորտես-Գոմես), Ացուկո Իկեդա (Ացուկո Իկեդա), Վալերիա Զոնի (Վալերիա Զոնի), Աուքսիլիադորա Ագիլերա-Ռոմերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Ռոմերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Ռոմերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Ռոմերո-Լոպեերո-Լոպեերո-Լոպեո. Վագա (Միհո Վագա), Միսակո Արման (Միսակո Արման), Միյակո Ռիման (Միյակո Ռիման), Պրոու Ակիրա, Ստեֆանո Ֆաննի, Ակիհիկո Նականո, Մանուել Մունիզ
Եռաչափ բարձր թույլտվությամբ իրական ժամանակի պատկերումը բացահայտում է կերամիդային շղթայի երկարության կարևորությունը ընտրողական ելքային կետերում սպիտակուցների տեսակավորման համար։
©2020 Գիտության առաջընթացի ամերիկյան ասոցիացիա. բոլոր իրավունքները պաշտպանված են: AAAS-ը HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef և COUNTER ընկերությունների գործընկերն է: ScienceAdvances ISSN 2375-2548.