Մենք նախկինում հաղորդել էինք, որ աղիքային աղիքային տրիպտոֆանային մետաբոլիտ ինդոլ-3-պրոպիոնաթթվի (IPA) շիճուկային մակարդակն ավելի ցածր է լյարդի ֆիբրոզով հիվանդների մոտ: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ուսումնասիրել ենք ճարպակալմամբ տառապող լյարդերի տրանսկրիպտոմը և ԴՆԹ մեթիլոմը՝ IPA-ի շիճուկային մակարդակի համեմատ, ինչպես նաև IPA-ի դերը լյարդի աստղաձև բջիջների (HSC) ֆենոտիպային ինակտիվացման գործում in vitro:
Ուսումնասիրությանը մասնակցել են 116 գիրացած հիվանդներ, որոնք չունեին 2-րդ տիպի շաքարային դիաբետ (T2DM) (տարիքը՝ 46.8 ± 9.3 տարեկան, մարմնի զանգվածի ինդեքսը՝ 42.7 ± 5.0 կգ/մ²), որոնք բարիատրիկ վիրահատության են ենթարկվել Կուոպիո բարիատրիկ վիրաբուժության կենտրոնում (KOBS): Շրջանառվող IPA մակարդակները չափվել են հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-զանգվածային սպեկտրոմետրիայով (LC-MS), լյարդի տրանսկրիպտոմային վերլուծությունը կատարվել է ընդհանուր ՌՆԹ հաջորդականության միջոցով, իսկ ԴՆԹ մեթիլացման վերլուծությունը՝ Infinium HumanMethylation450 BeadChip-ի միջոցով: In vitro փորձերի համար օգտագործվել են մարդու լյարդի աստղաձև բջիջներ (LX-2):
Արյան շիճուկում IPA մակարդակը կապված էր լյարդում ապոպտոտիկ, միտոֆագիկ և երկարակեցության ուղիներում ներգրավված գեների արտահայտման հետ: AKT սերին/թրեոնին կինազ 1 (AKT1) գենը լյարդի տրանսկրիպտի և ԴՆԹ մեթիլացման պրոֆիլներում ամենատարածված և գերիշխող փոխազդող գենն էր: IPA բուժումը առաջացրել է ապոպտոզ, նվազեցրել է միտոքոնդրիալ շնչառությունը և փոխել բջջային ձևաբանությունը և միտոքոնդրիալ դինամիկան՝ մոդուլացնելով ֆիբրոզը, ապոպտոզը և LX-2 բջիջների գոյատևումը կարգավորող հայտնի գեների արտահայտումը:
Ամփոփելով՝ այս տվյալները հաստատում են, որ IPA-ն ունի պոտենցիալ թերապևտիկ ազդեցություն և կարող է առաջացնել ապոպտոզ և HSC ֆենոտիպը տեղափոխել դեպի ոչ ակտիվ վիճակ, այդպիսով ընդլայնելով լյարդի ֆիբրոզի զսպման հնարավորությունըը՝ խանգարելով HSC ակտիվացմանը և միտոքոնդրիալ նյութափոխանակությանը։
Ճարպակալման և նյութափոխանակության համախտանիշի տարածվածությունը կապված է նյութափոխանակության հետ կապված ճարպային լյարդի հիվանդության (MASLD) աճող դեպքերի հետ. հիվանդությունը ազդում է ընդհանուր բնակչության 25%-ից 30%-ի վրա [1]: MASLD-ի պատճառաբանության հիմնական հետևանքը լյարդի ֆիբրոզն է, որը դինամիկ գործընթաց է, որը բնութագրվում է մանրաթելային արտաբջջային մատրիցի (ECM) անընդհատ կուտակմամբ [2]: Լյարդի ֆիբրոզի մեջ ներգրավված հիմնական բջիջները լյարդի աստղաձև բջիջներն են (HSC), որոնք ցուցաբերում են չորս հայտնի ֆենոտիպ՝ հանգստի, ակտիվացված, ինակտիվացված և ծերացող [3, 4]: HSC-ները կարող են ակտիվացվել և տրանսդիֆերենցվել հանգստի ձևից դեպի պրոլիֆերատիվ ֆիբրոբլաստանման բջիջներ՝ բարձր էներգիայի պահանջարկով, α-հարթ մկանային ակտինի (α-SMA) և I տիպի կոլագենի (Col-I) արտահայտման աճով [5, 6]: Լյարդի ֆիբրոզի վերականգնման ընթացքում ակտիվացված HSC-ները վերացվում են ապոպտոզի կամ ինակտիվացման միջոցով: Այս գործընթացները ներառում են ֆիբրոգեն գեների թուլացում և գոյատևմանն ուղղված գեների մոդուլյացիա (օրինակ՝ NF-κB և PI3K/Akt ազդանշանային ուղիներ) [7, 8], ինչպես նաև միտոքոնդրիալ դինամիկայի և ֆունկցիայի փոփոխություններ [9]:
Տրիպտոֆան մետաբոլիտի՝ ինդոլ-3-պրոպիոնաթթվի (IPA) շիճուկային մակարդակը, որը արտադրվում է աղիներում, նվազել է մարդու նյութափոխանակության հիվանդությունների, այդ թվում՝ MASLD-ի դեպքում [10–13]: IPA-ն կապված է սննդային մանրաթելերի ընդունման հետ, հայտնի է իր հակաօքսիդանտային և հակաբորբոքային ազդեցություններով և թուլացնում է սննդակարգով առաջացած ոչ ալկոհոլային ստեատոհեպատիտի (NASH) ֆենոտիպը in vivo և in vitro [11–14]: Որոշ ապացույցներ վերցված են մեր նախորդ ուսումնասիրությունից, որը ցույց է տվել, որ Կուոպիո բարիատրիկ վիրաբուժության ուսումնասիրության (KOBS) համաձայն՝ շիճուկային IPA մակարդակն ավելի ցածր էր լյարդի ֆիբրոզով հիվանդների մոտ, քան լյարդի ֆիբրոզ չունեցող ճարպակալած հիվանդների մոտ: Ավելին, մենք ցույց տվեցինք, որ IPA-ով բուժումը կարող է նվազեցնել բջիջների ադհեզիայի, բջիջների միգրացիայի և արյունաստեղծ ցողունային բջիջների ակտիվացման դասական մարկերներ հանդիսացող գեների արտահայտությունը մարդու լյարդի աստղաձև բջիջների (LX-2) մոդելում և հանդիսանում է պոտենցիալ հեպատոպաշտպան մետաբոլիտ [15]: Այնուամենայնիվ, մնում է անհասկանալի, թե ինչպես է IPA-ն առաջացնում լյարդի ֆիբրոզի ռեգրեսիա՝ ակտիվացնելով HSC ապոպտոզը և միտոքոնդրիալ կենսաէներգետիկան:
Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս, որ շիճուկային IPA-ն կապված է ճարպակալմամբ, բայց ոչ 2-րդ տիպի շաքարախտով (KOBS) անհատների լյարդում ապոպտոզի, միտոֆագիայի և երկարակեցության ուղիներով հարստացված գեների արտահայտման հետ: Ավելին, մենք պարզեցինք, որ IPA-ն կարող է առաջացնել ակտիվացված արյունաստեղծ ցողունային բջիջների (HSC) մաքրում և քայքայում՝ ինակտիվացման ուղու միջոցով: Այս արդյունքները բացահայտում են IPA-ի նոր դերը, ինչը այն դարձնում է լյարդի ֆիբրոզի ռեգրեսիան խթանելու պոտենցիալ թերապևտիկ թիրախ:
KOBS կոհորտում նախորդ ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ լյարդի ֆիբրոզով հիվանդների մոտ IPA-ի մակարդակը արյան մեջ ավելի ցածր էր՝ համեմատած լյարդի ֆիբրոզ չունեցող հիվանդների հետ [15]: 2-րդ տիպի շաքարախտի հնարավոր շփոթեցնող ազդեցությունը բացառելու համար մենք KOBS ընթացիկ ուսումնասիրությունից որպես ուսումնասիրության խումբ ընդգրկել ենք 116 գիրացած հիվանդների, որոնք չունեին 2-րդ տիպի շաքարախտ (միջին տարիք ± ստանդարտ շեղում. 46.8 ± 9.3 տարի; մարմնի զանգվածի ինդեքս. 42.7 ± 5.0 կգ/մ2) (աղյուսակ 1) [16]: Բոլոր մասնակիցները տվել են գրավոր տեղեկացված համաձայնություն, և ուսումնասիրության արձանագրությունը հաստատվել է Հյուսիսային Սավո շրջանի հիվանդանոցի էթիկայի կոմիտեի կողմից՝ համաձայն Հելսինկիի հռչակագրի (54/2005, 104/2008 և 27/2010):
Լյարդի բիոպսիայի նմուշները վերցվել են բարիատրիկ վիրահատության ժամանակ և հյուսվածաբանորեն գնահատվել են փորձառու պաթոլոգների կողմից՝ համաձայն նախկինում նկարագրված չափանիշների [17, 18]: Գնահատման չափանիշները ամփոփված են լրացուցիչ աղյուսակ S1-ում և նկարագրվել են նախկինում [19]:
Սովից վերցված շիճուկի նմուշները վերլուծվել են ոչ թիրախային հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի-զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (LC-MS) միջոցով՝ մետաբոլոմիկայի վերլուծության համար (n = 116): Նմուշները վերլուծվել են UHPLC-qTOF-MS համակարգի միջոցով (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany), ինչպես նկարագրվել է նախկինում19: Իզոպրոպիլ սպիրտի (IPA) նույնականացումը հիմնված է պահպանման ժամանակի և MS/MS սպեկտրի մաքուր ստանդարտների հետ համեմատության վրա: IPA ազդանշանի ինտենսիվությունը (գագաթնակետի մակերեսը) հաշվի է առնվել բոլոր հետագա վերլուծություններում [20]:
Լյարդի ամբողջական ՌՆԹ-ի հաջորդականացումը կատարվել է Illumina HiSeq 2500-ի միջոցով, և տվյալները նախնական մշակվել են նախկինում նկարագրվածի համաձայն [19, 21, 22]: Մենք իրականացրել ենք միտոքոնդրիալ ֆունկցիայի/կենսագենեզի վրա ազդող տրանսկրիպտների թիրախային դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծություն՝ օգտագործելով MitoMiner 4.0 տվյալների բազայից ընտրված 1957 գեներ [23]: Լյարդի ԴՆԹ-ի մեթիլացման վերլուծությունը կատարվել է Infinium HumanMethylation450 BeadChip-ի (Illumina, Սան Դիեգո, Կալիֆոռնիա, ԱՄՆ) միջոցով՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված նույն մեթոդաբանությունը [24, 25]:
Մարդու լյարդի աստղաձև բջիջները (LX-2) բարեհամբույր կերպով տրամադրվել են պրոֆեսոր Ստեֆանո Ռոմեոյի կողմից և կուլտիվացվել ու պահպանվել են DMEM/F12 միջավայրում (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106): IPA-ի աշխատանքային դոզան ընտրելու համար LX-2 բջիջները մշակվել են IPA-ի տարբեր կոնցենտրացիաներով (10 μM, 100 μM և 1 mM; Sigma, 220027) DMEM/F12 միջավայրում 24 ժամվա ընթացքում: Ավելին, IPA-ի HSC-ները ապաակտիվացնելու ունակությունը հետազոտելու համար LX-2 բջիջները համատեղ մշակվել են 5 նգ/մլ TGF-β1-ով (R&D systems, 240-B-002/CF) և 1 mM IPA-ով շիճուկազուրկ միջավայրում 24 ժամվա ընթացքում: Համապատասխան տրանսպորտային միջոցի վերահսկման համար TGF-β1-ի բուժման համար օգտագործվել է 0.1% BSA պարունակող 4 նՄ HCL, իսկ IPA-ի բուժման համար՝ 0.05% DMSO, և երկուսն էլ օգտագործվել են միասին՝ համակցված բուժման համար։
Ապոպտոզը գնահատվել է FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit-ի միջոցով՝ 7-AAD-ով (Biolegend, Սան Դիեգո, Կալիֆոռնիա, ԱՄՆ, Cat# 640922)՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների: Հակիրճ ասած, LX-2-ը (1 × 105 բջիջ/հոսք) կուլտիվացվել է գիշերը 12-հոսքանոց ափսեներում, ապա մշակվել է IPA-ի կամ IPA-ի և TGF-β1-ի բազմակի դեղաչափերով: Հաջորդ օրը լողացող և կպչուն բջիջները հավաքվել են, տրիպսինացվել, լվացվել PBS-ով, վերասուզվել Annexin V կապող բուֆերում և ինկուբացվել FITC-Annexin V-ի և 7-AAD-ի հետ 15 րոպե:
Կենդանի բջիջների միտոքոնդրիաները ներկվել են օքսիդատիվ ակտիվության համար՝ օգտագործելով Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA): MTR անալիզների համար LX-2 բջիջները ինկուբացվել են հավասար խտություններով՝ IPA-ի և TGF-β1-ի հետ: 24 ժամ անց կենդանի բջիջները տրիպսինացվել են, լվացվել PBS-ով, ապա ինկուբացվել են 100 μM MTR-ով շիճուկազուրկ միջավայրում՝ 37°C ջերմաստիճանում, 20 րոպե, ինչպես նկարագրվել է նախկինում [26]: Կենդանի բջիջների ձևաբանության վերլուծության համար բջջի չափը և ցիտոպլազմային բարդությունը վերլուծվել են համապատասխանաբար՝ առաջ շարժվող ցրման (FSC) և կողմնային ցրման (SSC) պարամետրերով:
Բոլոր տվյալները (30,000 դեպք) ստացվել են NovoCyte Quanteon (Agilent) ծրագրաշարի միջոցով և վերլուծվել են NovoExpress® 1.4.1 կամ FlowJo V.10 ծրագրաշարի միջոցով։
Թթվածնի սպառման արագությունը (OCR) և արտաբջջային թթվայնացման արագությունը (ECAR) չափվել են իրական ժամանակում՝ օգտագործելով Seahorse արտաբջջային հոսքի վերլուծիչ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), որը հագեցած է Seahorse XF Cell Mito Stress-ով, արտադրողի հրահանգների համաձայն: Հակիրճ ասած, 2 × 104 LX-2 բջիջ/հոսք ցանվել է XF96 բջջային կուլտուրայի ափսեների վրա: Գիշերային ինկուբացիայից հետո բջիջները մշակվել են իզոպրոպանոլով (IPA) և TGF-β1-ով (Լրացուցիչ մեթոդներ 1): Տվյալների վերլուծությունը կատարվել է Seahorse XF Wave ծրագրաշարի միջոցով, որը ներառում է Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator-ը: Դրանից հաշվարկվել է կենսաէներգետիկ առողջության ինդեքսը (BHI) [27]:
Ընդհանուր ՌՆԹ-ն տրանսկրիպցիայի է ենթարկվել կԴՆԹ-ի: Հատուկ մեթոդների համար տե՛ս [15] հղումը: Մարդու 60S ռիբոսոմային թթվային սպիտակուց P0-ի (RPLP0) և ցիկլոֆիլին A1-ի (PPIA) mRNA մակարդակները օգտագործվել են որպես կոնստիտուցիոնալ գեների վերահսկողություն: QuantStudio 6 pro իրական ժամանակի ՊՇՌ համակարգը (Thermo Fisher, Landsmeer, Նիդեռլանդներ) օգտագործվել է TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit-ի (Applied Biosystems) կամ Sensifast SYBR Lo-ROX Kit-ի (Bioline, BIO 94050) հետ, և գեների հարաբերական արտահայտման ծալքը հաշվարկվել է համեմատական ​​Ct արժեքի ցիկլային պարամետրերի (ΔΔCt) և ΔΔCt մեթոդի միջոցով: Պրայմերների մանրամասները տրամադրված են լրացուցիչ S2 և S3 աղյուսակներում:
Միջուկային ԴՆԹ-ն (ncDNA) և միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն (mtDNA) արդյունահանվել են DNeasy արյան և հյուսվածքի հավաքածուի (Qiagen) միջոցով, ինչպես նկարագրվել է նախկինում [28]: Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի հարաբերական քանակը հաշվարկվել է՝ հաշվարկելով յուրաքանչյուր թիրախային միտոքոնդրիալ ԴՆԹ շրջանի և միջուկային ԴՆԹ-ի երեք շրջանների (mtDNA/ncDNA) երկրաչափական միջինի հարաբերակցությունը, ինչպես մանրամասն նկարագրված է Լրացուցիչ մեթոդներ 2-ում: Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի և ncDNA-ի պրայմերների մանրամասները ներկայացված են Լրացուցիչ աղյուսակ S4-ում:
Կենդանի բջիջները ներկվել են Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA)-ով՝ միջբջջային և ներբջջային միտոքոնդրիալ ցանցերը պատկերացնելու համար: LX-2 բջիջները (1 × 104 բջիջ/հոսք) կուլտիվացվել են ապակե սլայդների վրա համապատասխան ապակե հատակով կուլտիվացիոն թիթեղներում (Ibidi GmbH, Martinsried, Գերմանիա): 24 ժամ անց կենդանի LX-2 բջիջները ինկուբացվել են 100 μM MTR-ով 20 րոպե 37°C ջերմաստիճանում, իսկ բջջային կորիզները ներկվել են DAPI-ով (1 մկգ/մլ, Sigma-Aldrich), ինչպես նկարագրվել է նախկինում [29]: Միտոքոնդրիալ ցանցերը պատկերացվել են Zeiss Axio Observer ինվերտ մանրադիտակի (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Յենա, Գերմանիա) միջոցով, որը հագեցած է Zeiss LSM 800 կոնֆոկալ մոդուլով 37°C ջերմաստիճանում խոնավացված մթնոլորտում՝ 5% CO2-ով, օգտագործելով 63×NA 1.3 օբյեկտիվ: Մենք ստացել ենք տասը Z-շարքի պատկերներ յուրաքանչյուր նմուշի տեսակի համար: Յուրաքանչյուր Z-շարքը պարունակում է 30 հատված, որոնցից յուրաքանչյուրը 9.86 մկմ հաստությամբ է: Յուրաքանչյուր նմուշի համար տասը տարբեր տեսադաշտերի պատկերներ են ստացվել ZEN 2009 ծրագրաշարի միջոցով (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Յենա, Գերմանիա), իսկ միտոքոնդրիալ ձևաբանության վերլուծությունը կատարվել է ImageJ ծրագրաշարի միջոցով (v1.54d) [30, 31]՝ համաձայն լրացուցիչ մեթոդներ 3-ում մանրամասն նկարագրված պարամետրերի:
Բջիջները ֆիքսվել են 2% գլուտարալդեհիդով 0.1 Մ ֆոսֆատային բուֆերում, որին հաջորդել է ֆիքսացիան 1% օսմիումի տետրօքսիդի լուծույթով (Sigma Aldrich, MO, ԱՄՆ), աստիճանաբար ջրազրկվել են ացետոնով (Merck, Դարմշտադտ, Գերմանիա) և վերջապես ներդրվել են էպօքսիդային խեժի մեջ: Գերբարակ հատվածները պատրաստվել և ներկվել են 1% ուրանիլացետատով (Merck, Դարմշտադտ, Գերմանիա) և 1% կապարի ցիտրատով (Merck, Դարմշտադտ, Գերմանիա): Ուլտրակառուցվածքային պատկերները ստացվել են JEM 2100F EXII թափանցելի էլեկտրոնային մանրադիտակով (JEOL Ltd, Տոկիո, Ճապոնիա)՝ 80 կՎ արագացնող լարման դեպքում:
IPA-ով 24 ժամ մշակված LX-2 բջիջների ձևաբանությունը վերլուծվել է փուլային կոնտրաստային մանրադիտակով՝ 50x մեծացմամբ՝ օգտագործելով Zeiss ինվերտ լույսի մանրադիտակ (Zeiss Axio Vert.A1 և AxioCam MRm, Յենա, Գերմանիա):
Կլինիկական տվյալները արտահայտվել են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում կամ միջնարժեք (միջքառորդական միջակայք՝ IQR): Երեք ուսումնասիրության խմբերի միջև տարբերությունները համեմատելու համար օգտագործվել է վարիացիայի միակողմանի վերլուծություն (շարունակական փոփոխականներ) կամ χ² թեստ (կատեգորիկ փոփոխականներ): Կեղծ դրական ցուցանիշը (FDR) օգտագործվել է բազմակի թեստավորման շտկման համար, և FDR < 0.05 ունեցող գեները համարվել են վիճակագրորեն նշանակալի: CpG ԴՆԹ մեթիլացումը IPA ազդանշանի ինտենսիվության հետ համեմատելու համար օգտագործվել է Սփիրմանի կոռելյացիոն վերլուծությունը՝ ներկայացնելով անվանական p արժեքներ (p < 0.05):
Ուղիների վերլուծությունը կատարվել է վեբ-հիմքով գեների հավաքածուի վերլուծության գործիքի (WebGestalt) միջոցով՝ 268 տրանսկրիպտների (նոմինալ p < 0.01), 119 միտոքոնդրիաների հետ կապված տրանսկրիպտների (նոմինալ p < 0.05) և 4350 CpG-ների համար՝ 3093 լյարդի տրանսկրիպտներից, որոնք կապված էին շիճուկային IPA մակարդակի հետ: Համընկնող գեները գտնելու համար օգտագործվել է ազատորեն հասանելի Venny DB (տարբերակ 2.1.0) գործիքը, իսկ սպիտակուց-սպիտակուց փոխազդեցությունները պատկերացնելու համար՝ StringDB (տարբերակ 11.5) գործիքը:
LX-2 փորձի համար նմուշները ստուգվել են նորմալության համար՝ օգտագործելով Դ'Ագոստինո-Պիրսոնի թեստը: Տվյալները ստացվել են առնվազն երեք կենսաբանական կրկնօրինակներից և ենթարկվել են միակողմանի ANOVA-ի՝ Բոնֆերոնիի հետհոկ թեստով: 0.05-ից պակաս p-արժեքը համարվել է վիճակագրորեն նշանակալի: Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում, և փորձերի քանակը նշված է յուրաքանչյուր նկարում: Բոլոր վերլուծություններն ու գրաֆիկները կատարվել են Windows-ի համար նախատեսված GraphPad Prism 8 վիճակագրական ծրագրի միջոցով (GraphPad Software Inc., տարբերակ 8.4.3, Սան Դիեգո, ԱՄՆ):
Նախ, մենք ուսումնասիրեցինք շիճուկային IPA մակարդակի կապը լյարդի, ամբողջ մարմնի և միտոքոնդրիալ տրանսկրիպտների հետ։ Ընդհանուր տրանսկրիպտի պրոֆիլում շիճուկային IPA մակարդակի հետ կապված ամենաուժեղ գենը MAPKAPK3-ն էր (FDR = 0.0077; միտոգեն-ակտիվացված սպիտակուցային կինազ-ակտիվացված սպիտակուցային կինազ 3). միտոքոնդրիաների հետ կապված տրանսկրիպտի պրոֆիլում ամենաուժեղ կապված գենը AKT1-ն էր (FDR = 0.7621; AKT սերին/թրեոնին կինազ 1) (Լրացուցիչ ֆայլ 1 և Լրացուցիչ ֆայլ 2):
Այնուհետև մենք վերլուծեցինք գլոբալ տրանսկրիպտները (n = 268; p < 0.01) և միտոքոնդրիաների հետ կապված տրանսկրիպտները (n = 119; p < 0.05), վերջնական արդյունքում ապոպտոզը նույնականացնելով որպես ամենակարևոր կանոնիկ ուղի (p = 0.0089): Արյան շիճուկի IPA մակարդակի հետ կապված միտոքոնդրիալ տրանսկրիպտների համար մենք կենտրոնացանք ապոպտոզի (FDR = 0.00001), միտոֆագիայի (FDR = 0.00029) և TNF ազդանշանային ուղիների (FDR = 0.000006) վրա (Նկար 1A, աղյուսակ 2 և լրացուցիչ նկարներ 1A-B):
Մարդու լյարդում գլոբալ, միտոքոնդրիաների հետ կապված տրանսկրիպտների և ԴՆԹ մեթիլացման համընկնող վերլուծություն՝ կապված շիճուկային IPA մակարդակների հետ: A-ն ներկայացնում է 268 գլոբալ տրանսկրիպտ, 119 միտոքոնդրիաների հետ կապված տրանսկրիպտ և ԴՆԹ մեթիլացված տրանսկրիպտներ, որոնք քարտեզագրված են շիճուկային IPA մակարդակների հետ կապված 3092 CpG տեղամասերի վրա (p արժեքներ < 0.01 գլոբալ տրանսկրիպտների և մեթիլացված ԴՆԹ-ի համար, և p արժեքներ < 0.05 միտոքոնդրիալ տրանսկրիպտների համար): Հիմնական համընկնող տրանսկրիպտները ներկայացված են մեջտեղում (AKT1 և YKT6): B Ամենաբարձր փոխազդեցության միավորով (0.900) 13 գեների փոխազդեցության քարտեզը այլ գեների հետ կառուցվել է 56 համընկնող գեներից (սև գծի շրջան), որոնք զգալիորեն կապված էին շիճուկային IPA մակարդակների հետ՝ օգտագործելով StringDB առցանց գործիքը: Կանաչ. Գեներ, որոնք քարտեզագրված են Գեների օնտոլոգիայի (GO) բջջային բաղադրիչին՝ միտոքոնդրիաներին (GO:0005739): AKT1-ը ամենաբարձր գնահատականն ունեցող սպիտակուցն է (0.900)՝ այլ սպիտակուցների հետ փոխազդեցությունների համար՝ հիմնվելով տվյալների վրա (հիմնված տեքստի մշակման, փորձերի, տվյալների բազաների և համատեղ արտահայտման վրա): Ցանցային հանգույցները ներկայացնում են սպիտակուցներ, իսկ եզրերը՝ սպիտակուցների միջև կապեր:
Քանի որ աղիքային միկրոբիոտայի մետաբոլիտները կարող են կարգավորել էպիգենետիկ կազմը ԴՆԹ մեթիլացման միջոցով [32], մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք շիճուկային IPA մակարդակները կապված են լյարդի ԴՆԹ մեթիլացման հետ: Մենք պարզեցինք, որ շիճուկային IPA մակարդակների հետ կապված երկու հիմնական մեթիլացման տեղամասերը գտնվում էին պրոլին-սերինով հարուստ 3-րդ շրջանի (C19orf55) և ջերմային շոկի սպիտակուցի B ընտանիքի (փոքր) 6-րդ անդամի (HSPB6) մոտ (Լրացուցիչ ֆայլ 3): 4350 CpG-ի ԴՆԹ մեթիլացումը (p < 0.01) կապված էր շիճուկային IPA մակարդակների հետ և հարստացված էր երկարակեցության կարգավորող ուղիներով (p = 0.006) (Նկար 1A, աղյուսակ 2 և լրացուցիչ նկար 1C):
Մարդու լյարդում IPA-ի շիճուկային մակարդակների, գլոբալ տրանսկրիպտների, միտոքոնդրիաների հետ կապված տրանսկրիպտների և ԴՆԹ մեթիլացման միջև կապերի հիմքում ընկած կենսաբանական մեխանիզմները հասկանալու համար մենք կատարեցինք նախորդ ուղու վերլուծության մեջ նույնականացված գեների համընկնման վերլուծություն (Նկար 1Ա): 56 համընկնող գեների ուղու հարստացման վերլուծության արդյունքները (Նկար 1Ա-ի սև գծի ներսում) ցույց տվեցին, որ ապոպտոզի ուղին (p = 0.00029) ընդգծեց երեք վերլուծությունների համար ընդհանուր երկու գեներ՝ AKT1 և YKT6 (YKT6 v-SNARE հոմոլոգ), ինչպես ցույց է տրված Վեննի դիագրամում (Լրացուցիչ նկար 2 և նկար 1Ա): Հետաքրքիր է, որ մենք պարզեցինք, որ AKT1-ը (cg19831386) և YKT6-ը (cg24161647) դրականորեն կապված էին շիճուկային IPA մակարդակների հետ (Լրացուցիչ ֆայլ 3): Գենային արգասիքների միջև հնարավոր սպիտակուցային փոխազդեցությունները բացահայտելու համար մենք որպես մուտքային տվյալներ ընտրեցինք 56 համընկնող գեների մեջ ամենաբարձր ընդհանուր շրջանի միավորով (0.900) 13 գեն և կառուցեցինք փոխազդեցության քարտեզ: Վստահության մակարդակի (սահմանային վստահության) համաձայն՝ ամենաբարձր միավորը (0.900) ստացած AKT1 գենը գտնվում էր վերևում (Նկար 1Բ):
Հիմնվելով ուղու վերլուծության վրա՝ մենք պարզեցինք, որ ապոպտոզը հիմնական ուղին է, ուստի մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք IPA-ով բուժումը կազդի HSC-ների ապոպտոզի վրա in vitro: Մենք նախկինում ցույց ենք տվել, որ IPA-ի տարբեր դեղաչափերը (10 μM, 100 μM և 1 mM) ոչ թունավոր են LX-2 բջիջների համար [15]: Այս ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ IPA-ով բուժումը 10 μM և 100 μM չափաբաժիններով մեծացրել է կենսունակ և նեկրոտիկ բջիջների քանակը: Այնուամենայնիվ, վերահսկիչ խմբի համեմատ, բջիջների կենսունակությունը նվազել է 1 մՄ IPA կոնցենտրացիայի դեպքում, մինչդեռ բջիջների նեկրոզի արագությունը մնացել է անփոփոխ (Նկար 2A, B): Հաջորդը, LX-2 բջիջներում ապոպտոզ առաջացնելու համար օպտիմալ կոնցենտրացիան գտնելու համար, մենք փորձարկել ենք 10 μM, 100 μM և 1 mM IPA 24 ժամվա ընթացքում (Նկար 2A-E և լրացուցիչ նկար 3A-B): Հետաքրքիր է, որ IPA 10 μM և 100 μM-ը նվազեցրել է ապոպտոզի արագությունը (%), սակայն IPA 1 mM-ը մեծացրել է ուշ ապոպտոզի և ապոպտոզի արագությունը (%)՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ, ուստի ընտրվել է հետագա փորձերի համար (Նկարներ 2A–D):
IPA-ն առաջացնում է LX-2 բջիջների ապոպտոզ: Անեքսին V-ի և 7-AAD կրկնակի ներկման մեթոդը կիրառվել է ապոպտոզի արագությունը և բջջային ձևաբանությունը հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով քանակականացնելու համար: BA բջիջները ինկուբացվել են 10 μM, 100 μM և 1 mM IPA-ի հետ 24 ժամ կամ F–H TGF-β1-ի (5 նգ/մլ) և 1 mM IPA-ի հետ շիճուկազուրկ միջավայրում 24 ժամ: A: կենդանի բջիջներ (Անեքսին V -/ 7AAD-); B: նեկրոտիկ բջիջներ (Անեքսին V -/ 7AAD+); C, F: վաղ (Անեքսին V +/ 7AAD-); D, G: ուշ (Անեքսին V+/7AAD.+); E, H: վաղ և ուշ ապոպտոզի ընդհանուր բջիջների տոկոսը ապոպտոզի արագության մեջ (%): Տվյալները արտահայտվում են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում, n = 3 անկախ փորձ: Վիճակագրական համեմատությունները կատարվել են միակողմանի ANOVA-ի միջոցով՝ Bonferroni-ի հետադարձ կապի թեստով: *p < 0.05; ****p < 0.0001
Ինչպես մենք նախկինում ցույց ենք տվել, 5 նգ/մլ TGF-β1-ը կարող է առաջացնել HSC ակտիվացում՝ մեծացնելով դասական մարկերային գեների արտահայտությունը [15]: LX-2 բջիջները մշակվել են 5 նգ/մլ TGF-β1-ով և 1 մՄ IPA-ով համակցված (Նկ. 2E–H): TGF-β1-ով բուժումը չի փոխել ապոպտոզի մակարդակը, սակայն IPA-ի համատեղ բուժումը մեծացրել է ուշ ապոպտոզը և ապոպտոզի մակարդակը (%)՝ համեմատած TGF-β1-ով բուժման հետ (Նկ. 2E–H): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ 1 մՄ IPA-ն կարող է խթանել ապոպտոզը LX-2 բջիջներում՝ անկախ TGF-β1 ինդուկցիայից:
Մենք հետագայում ուսումնասիրեցինք IPA-ի ազդեցությունը LX-2 բջիջների միտոքոնդրիալ շնչառության վրա: Արդյունքները ցույց տվեցին, որ 1 մՄ IPA-ն նվազեցրել է թթվածնի սպառման արագության (OCR) պարամետրերը՝ ոչ միտոքոնդրիալ շնչառություն, բազալ և մաքսիմալ շնչառություն, պրոտոնների արտահոսք և ATP արտադրություն՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ (Նկար 3A, B), մինչդեռ կենսաէներգետիկ առողջության ինդեքսը (BHI) չի փոխվել:
IPA-ն նվազեցնում է միտոքոնդրիալ շնչառությունը LX-2 բջիջներում: Միտոքոնդրիալ շնչառության կորը (OCR) ներկայացված է որպես միտոքոնդրիալ շնչառության պարամետրեր (ոչ միտոքոնդրիալ շնչառություն, բազալ շնչառություն, առավելագույն շնչառություն, պրոտոնի արտահոսք, ATP-ի առաջացում, SRC և BHI): A և B բջիջները ինկուբացվել են համապատասխանաբար 10 μM, 100 μM և 1 mM IPA-ով 24 ժամ: C և D բջիջները ինկուբացվել են TGF-β1-ով (5 նգ/մլ) և 1 mM IPA-ով շիճուկազուրկ միջավայրում համապատասխանաբար 24 ժամ: Բոլոր չափումները նորմալացվել են ԴՆԹ-ի պարունակության համար՝ օգտագործելով CyQuant հավաքածուն: BHI՝ կենսաէներգետիկ առողջության ինդեքս; SRC՝ շնչառական պահուստային հզորություն; OCR՝ թթվածնի սպառման արագություն: Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում (SD), n = 5 անկախ փորձեր: Վիճակագրական համեմատությունները կատարվել են միակողմանի ANOVA-ի և Bonferroni-ի հետհոկ թեստի միջոցով: *p < 0.05; **p < 0.01; և ***p < 0.001:
TGF-β1-ով ակտիվացված LX-2 բջիջների կենսաէներգետիկ պրոֆիլի վրա IPA-ի ազդեցության ավելի համապարփակ պատկերացում կազմելու համար մենք վերլուծեցինք միտոքոնդրիալ օքսիդատիվ ֆոսֆորիլացումը OCR-ի միջոցով (Նկար 3C,D): Արդյունքները ցույց տվեցին, որ TGF-β1-ով բուժումը կարող է նվազեցնել առավելագույն շնչառությունը, շնչառական պահուստային հզորությունը (SRC) և BHI-ն՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ (Նկար 3C,D): Բացի այդ, համակցված բուժումը նվազեցրեց բազալ շնչառությունը, պրոտոնների արտահոսքը և ATP-ի արտադրությունը, սակայն SRC-ն և BHI-ն զգալիորեն ավելի բարձր էին, քան TGF-β1-ով բուժվածների մոտ (Նկար 3C,D):
Մենք նաև իրականացրեցինք Seahorse ծրագրաշարի կողմից տրամադրված «Բջջային էներգիայի ֆենոտիպի թեստը» (Լրացուցիչ նկ. 4A–D): Ինչպես ցույց է տրված լրացուցիչ նկ. 3B-ում, TGF-β1 բուժումից հետո և՛ OCR-ի, և՛ ECAR-ի նյութափոխանակության պոտենցիալները նվազել են, սակայն համակցված և IPA բուժման խմբերում տարբերություն չի նկատվել վերահսկիչ խմբի համեմատ: Ավելին, OCR-ի ինչպես բազալ, այնպես էլ սթրեսի մակարդակները նվազել են համակցված և IPA բուժումից հետո՝ վերահսկիչ խմբի համեմատ (Լրացուցիչ նկ. 4C): Հետաքրքիր է, որ նմանատիպ օրինաչափություն է նկատվել համակցված թերապիայի դեպքում, որտեղ ECAR-ի բազալ և սթրեսի մակարդակներում փոփոխություն չի նկատվել TGF-β1 բուժման համեմատ (Լրացուցիչ նկ. 4C): HSC-ների դեպքում միտոքոնդրիալ օքսիդատիվ ֆոսֆորիլացման նվազումը և համակցված բուժման՝ SCR-ն և BHI-ն վերականգնելու ունակությունը TGF-β1 բուժման ազդեցությունից հետո չեն փոխել նյութափոխանակության պոտենցիալը (OCR և ECAR): Ամփոփելով՝ այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ IPA-ն կարող է նվազեցնել HSC-ների կենսաէներգիան, ինչը ենթադրում է, որ IPA-ն կարող է առաջացնել ավելի ցածր էներգետիկ պրոֆիլ, որը HSC ֆենոտիպը տեղափոխում է դեպի ինակտիվացում (Լրացուցիչ նկար 4D):
IPA-ի ազդեցությունը միտոքոնդրիալ դինամիկայի վրա ուսումնասիրվել է միտոքոնդրիալ ձևաբանության և ցանցային կապերի եռաչափ քանակականացման, ինչպես նաև MTR ներկման միջոցով (Նկար 4 և Լրացուցիչ Նկար 5): Նկար 4-ը ցույց է տալիս, որ վերահսկիչ խմբի համեմատ, TGF-β1-ով բուժումը նվազեցրել է միջին մակերեսի մակերեսը, ճյուղերի քանակը, ճյուղերի ընդհանուր երկարությունը և ճյուղերի միացման քանակը (Նկար 4A և B) և փոխել է միտոքոնդրիաների համամասնությունը գնդաձևից մինչև միջանկյալ ձևաբանություն (Նկար 4C): Միայն IPA բուժումը նվազեցրել է միտոքոնդրիալ միջին ծավալը և փոխել միտոքոնդրիաների համամասնությունը գնդաձևից մինչև միջանկյալ ձևաբանություն՝ վերահսկիչ խմբի համեմատ (Նկար 4A): Ի տարբերություն դրա, միտոքոնդրիալ թաղանթային պոտենցիալից կախված MTR-ով գնահատված գնդաձևությունը, ճյուղերի միջին երկարությունը և միտոքոնդրիալ ակտիվությունը (Նկար 4A և E) մնացել են անփոփոխ, և այս պարամետրերը չեն տարբերվել խմբերի միջև: Ամփոփելով՝ այս արդյունքները ենթադրում են, որ TGF-β1-ը և IPA բուժումը, կարծես, մոդուլացնում են միտոքոնդրիալ ձևը և չափը, ինչպես նաև ցանցային բարդությունը կենդանի LX-2 բջիջներում:
IPA-ն փոխում է միտոքոնդրիալ դինամիկան և միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի առատությունը LX-2 բջիջներում: Ա. TGF-β1-ով (5 նգ/մլ) և 1 մՄ IPA-ով 24 ժամ ինկուբացված կենդանի LX-2 բջիջների ներկայացուցչական կոնֆոկալ պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս Mitotracker™ Red CMXRos-ով ներկված միտոքոնդրիալ ցանցերը և DAPI-ով կապույտ գույնով ներկված կորիզները: Բոլոր տվյալները պարունակում էին առնվազն 15 պատկեր մեկ խմբում: Մենք ձեռք բերեցինք 10 Z-stack պատկեր յուրաքանչյուր նմուշի տեսակի համար: Յուրաքանչյուր Z-առանցքի հաջորդականությունը պարունակում էր 30 շերտ, որոնցից յուրաքանչյուրը 9.86 մկմ հաստությամբ էր: Սանդղակի գիծը՝ 10 մկմ: Բ. Ներկայացուցչական օբյեկտներ (միայն միտոքոնդրիալներ), որոնք նույնականացվել են պատկերին ադապտիվ շեմային արժեք կիրառելով: Միտոքոնդրիալ ձևաբանական ցանցային կապերի քանակական վերլուծություն և համեմատություն է իրականացվել յուրաքանչյուր խմբի բոլոր բջիջների համար: Գ. Միտոքոնդրիալ ձևի հարաբերակցությունների հաճախականություն: 0-ին մոտ արժեքները ցույց են տալիս գնդաձև ձևեր, իսկ 1-ին մոտ արժեքները՝ թելանման ձևեր: Դ Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի (մտԴՆԹ) պարունակությունը որոշվել է «Նյութեր և մեթոդներ» բաժնում նկարագրվածի պես։ Ե Mitotracker™ Red CMXRos վերլուծությունը կատարվել է հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով (30,000 իրադարձություն), ինչպես նկարագրված է «Նյութեր և մեթոդներ» բաժնում։ Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում, n = 3 անկախ փորձեր։ Վիճակագրական համեմատությունները կատարվել են միակողմանի ANOVA-ի և Bonferroni-ի հետհոկ թեստի միջոցով։ *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Այնուհետև մենք վերլուծեցինք LX-2 բջիջների միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի պարունակությունը որպես միտոքոնդրիալների քանակի ցուցանիշ: Համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ, միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի պարունակությունը բարձրացել էր TGF-β1-ով բուժված խմբում (Նկար 4D): Համեմատած TGF-β1-ով բուժված խմբի հետ, միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի պարունակությունը նվազել էր համակցված բուժման խմբում (Նկար 4D), ինչը ենթադրում է, որ IPA-ն կարող է նվազեցնել միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի պարունակությունը և հնարավոր է՝ միտոքոնդրիալների քանակը, ինչպես նաև միտոքոնդրիալ շնչառությունը (Նկար 3C): Ավելին, IPA-ն, կարծես, նվազեցնում էր միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի պարունակությունը համակցված բուժման ժամանակ, բայց չէր ազդում MTR-միջնորդավորված միտոքոնդրիալ ակտիվության վրա (Նկարներ 4A–C):
Մենք ուսումնասիրեցինք IPA-ի կապը LX-2 բջիջներում ֆիբրոզի, ապոպտոզի, գոյատևման և միտոքոնդրիալ դինամիկայի հետ կապված գեների mRNA մակարդակների հետ (Նկար 5A–D): Վերահսկիչ խմբի համեմատ, TGF-β1-ով բուժված խումբը ցույց տվեց այնպիսի գեների արտահայտման աճ, ինչպիսիք են կոլագեն I տիպի α2 շղթան (COL1A2), α-հարթ մկանային ակտինը (αSMA), մատրիցային մետաղոպրոտեինազ 2-ը (MMP2), մետաղոպրոտեինազ 1-ի հյուսվածքային արգելակիչը (TIMP1) և դինամին 1-անման գենը (DRP1), ինչը վկայում է ֆիբրոզի և ակտիվացման աճի մասին: Ավելին, վերահսկիչ խմբի համեմատ, TGF-β1-ով բուժումը նվազեցրեց միջուկային պրեգնան X ընկալիչի (PXR), կասպազ 8-ի (CASP8), MAPKAPK3-ի, B-բջջային α արգելակիչի, միջուկային գործոն κ գենի թեթև պեպտիդի ուժեղացուցիչի (NFκB1A) և միջուկային գործոն κB կինազային ենթամիավոր β արգելակիչի (IKBKB) mRNA մակարդակները (Նկար 5A–D): TGF-β1 բուժման համեմատ, TGF-β1-ի և IPA-ի համակցված բուժումը նվազեցրել է COL1A2-ի և MMP2-ի ​​էքսպրեսիան, սակայն բարձրացրել է PXR-ի, TIMP1-ի, B-բջջային լիմֆոմա-2-ի (BCL-2), CASP8-ի, NFκB1A-ի, NFκB1-β-ի և IKBKB-ի mRNA մակարդակները: IPA բուժումը զգալիորեն նվազեցրել է MMP2-ի, Bcl-2-ասոցացված սպիտակուց X-ի (BAX), AKT1-ի, տեսողական նյարդի ատրոֆիայի սպիտակուց 1-ի (OPA1) և միտոքոնդրիալ միաձուլման սպիտակուց 2-ի (MFN2) էքսպրեսիան, մինչդեռ CASP8-ի, NFκB1A-ի, NFκB1B-ի և IKBKB-ի էքսպրեսիան աճել է վերահսկիչ խմբի համեմատ: Այնուամենայնիվ, տարբերություն չի հայտնաբերվել կասպազ-3-ի (CASP3), ապոպտոզային պեպտիդազի ակտիվացնող գործոն 1-ի (APAF1), միտոքոնդրիալ միաձուլման սպիտակուց 1-ի (MFN1) և ճեղքման սպիտակուց 1-ի (FIS1) էքսպրեսիայի մեջ: Ամփոփելով՝ այս արդյունքները ենթադրում են, որ IPA բուժումը մոդուլացնում է ֆիբրոզի, ապոպտոզի, գոյատևման և միտոքոնդրիալ դինամիկայի հետ կապված գեների արտահայտությունը։ Մեր տվյալները ենթադրում են, որ IPA բուժումը նվազեցնում է ֆիբրոզը LX-2 բջիջներում. միևնույն ժամանակ, այն խթանում է գոյատևումը՝ ֆենոտիպը տեղափոխելով դեպի ինակտիվացում։
IPA-ն մոդուլացնում է ֆիբրոբլաստների, ապոպտոզի, կենսունակության և միտոքոնդրիալ դինամիկայի գեների արտահայտությունը LX-2 բջիջներում: Հիստոգրամները ցույց են տալիս mRNA-ի արտահայտությունը էնդոգեն վերահսկողության (RPLP0 կամ PPIA) նկատմամբ, այն բանից հետո, երբ LX-2 բջիջները ինդուկցվել են TGF-β1-ով և IPA-ով շիճուկազուրկ միջավայրում 24 ժամ: A-ն ցույց է տալիս ֆիբրոբլաստները, B-ն՝ ապոպտոզի բջիջները, C-ն՝ գոյատևող բջիջները, իսկ D-ն՝ միտոքոնդրիալ դինամիկայի գեների արտահայտությունը: Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում (SD), n = 3 անկախ փորձեր: Վիճակագրական համեմատությունները կատարվել են միակողմանի ANOVA-ի և Bonferroni-ի հետհոկ թեստի միջոցով: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Այնուհետև, բջիջների չափի (FSC-H) և ցիտոպլազմային բարդության (SSC-H) փոփոխությունները գնահատվել են հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով (Նկար 6A,B), իսկ IPA բուժումից հետո բջիջների ձևաբանության փոփոխությունները գնահատվել են թափանցող էլեկտրոնային մանրադիտակի (TEM) և փուլային կոնտրաստային մանրադիտակի միջոցով (Լրացուցիչ նկար 6A-B): Ինչպես և սպասվում էր, TGF-β1-ով բուժված խմբի բջիջները չափսերով մեծացել են վերահսկիչ խմբի համեմատ (Նկար 6A,B), ցույց տալով կոպիտ էնդոպլազմային ցանցի (ER*) և ֆագոլիզոսոմների (P) դասական ընդլայնում, ինչը վկայում է արյունաստեղծ ցողունային բջիջների (HSC) ակտիվացման մասին (Լրացուցիչ նկար 6A): Այնուամենայնիվ, TGF-β1-ով բուժված խմբի համեմատ, TGF-β1 և IPA համակցված բուժման խմբում բջիջների չափը, ցիտոպլազմային բարդությունը (Նկար 6A,B) և ER* պարունակությունը նվազել են (Լրացուցիչ նկար 6A): Ավելին, IPA բուժումը նվազեցրեց բջիջների չափը, ցիտոպլազմային բարդությունը (Նկար 6A, B), P և ER* պարունակությունը (Լրացուցիչ Նկ. 6A)՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ։ Բացի այդ, ապոպտոզային բջիջների պարունակությունը IPA բուժումից 24 ժամ անց ավելացավ՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ (սպիտակ նետեր, լրացուցիչ Նկ. 6B): Ամփոփելով՝ այս արդյունքները ենթադրում են, որ 1 մՄ IPA-ն կարող է խթանել HSC ապոպտոզը և հակադարձել TGF-β1-ի կողմից առաջացած բջիջների ձևաբանական պարամետրերի փոփոխությունները, այդպիսով կարգավորելով բջիջների չափը և բարդությունը, որոնք կարող են կապված լինել HSC ինակտիվացման հետ։
IPA-ն փոխում է LX-2 բջիջների բջիջների չափը և ցիտոպլազմային բարդությունը: Հոսքային ցիտոմետրիայի վերլուծության ներկայացուցչական պատկերներ: Վերլուծության մեջ օգտագործվել է LX-2 բջիջների համար հատուկ դարպասային ռազմավարություն՝ SSC-A/FSC-A՝ բջջային պոպուլյացիան սահմանելու համար, FSC-H/FSC-A՝ դուբլետները նույնականացնելու համար, և SSC-H/FSC-H՝ բջիջների չափի և բարդության վերլուծության համար: Բջիջները ինկուբացվել են TGF-β1-ի (5 նգ/մլ) և 1 մՄ IPA-ի հետ շիճուկազուրկ միջավայրում 24 ժամ: LX-2 բջիջները բաշխվել են ստորին ձախ քառորդում (SSC-H-/FSC-H-), վերին ձախ քառորդում (SSC-H+/FSC-H-), ստորին աջ քառորդում (SSC-H-/FSC-H+) և վերին աջ քառորդում (SSC-H+/FSC-H+)՝ բջիջների չափի և ցիտոպլազմային բարդության վերլուծության համար: Բ. Բջջային ձևաբանությունը վերլուծվել է հոսքային ցիտոմետրիայի միջոցով՝ օգտագործելով FSC-H (առաջ շարժվող ցրում, բջջի չափս) և SSC-H (կողմնակի ցրում, ցիտոպլազմային բարդություն) (30,000 դեպք): Տվյալները ներկայացված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում, n = 3 անկախ փորձ: Վիճակագրական համեմատությունները կատարվել են միակողմանի ANOVA-ի և Bonferroni-ի post hoc թեստի միջոցով: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 և ****p < 0.0001:
Աղիքային մետաբոլիտները, ինչպիսին է IPA-ն, դարձել են հետազոտությունների թեժ թեմա, ինչը ենթադրում է, որ աղիքային միկրոբիոտայում կարող են հայտնաբերվել նոր թիրախներ: Հետևաբար, հետաքրքիր է, որ IPA-ն, որը մենք կապել ենք մարդկանց մոտ լյարդի ֆիբրոզի հետ [15], կենդանիների մոդելներում ցույց է տրվել որպես պոտենցիալ հակաֆիբրոզային միացություն [13, 14]: Այստեղ մենք առաջին անգամ ցույց ենք տալիս շիճուկային IPA-ի և գլոբալ լյարդի տրանսկրիպտոմիկայի և ԴՆԹ մեթիլացման միջև կապը 2-րդ տիպի շաքարախտ (T2D) չունեցող ճարպակալած անհատների մոտ՝ ընդգծելով ապոպտոզը, միտոֆագիան և երկարակեցությունը, ինչպես նաև լյարդի հոմեոստազը կարգավորող AKT1 հնարավոր թեկնածու գենը: Մեր ուսումնասիրության մեկ այլ նորամուծությունն այն է, որ մենք ցույց տվեցինք IPA բուժման փոխազդեցությունը ապոպտոզի, բջջային ձևաբանության, միտոքոնդրիալ կենսաէներգետիկայի և դինամիկայի հետ LX-2 բջիջներում՝ ցույց տալով ավելի ցածր էներգետիկ սպեկտր, որը HSC ֆենոտիպը տեղափոխում է դեպի ինակտիվացում, ինչը IPA-ն դարձնում է լյարդի ֆիբրոզի բարելավման պոտենցիալ թեկնածու:
Մենք պարզեցինք, որ ապոպտոզը, միտոֆագիան և երկարակեցությունը լյարդի գեներում հարստացված ամենակարևոր կանոնիկ ուղիներն են, որոնք կապված են շիճուկային IPA-ի հետ: Միտոքոնդրիալ որակի վերահսկման (MQC) համակարգի խափանումը կարող է հանգեցնել միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի, միտոֆագիայի և ապոպտոզի, դրանով իսկ նպաստելով MASLD-ի առաջացմանը [33, 34]: Հետևաբար, մենք կարող ենք ենթադրել, որ IPA-ն կարող է ներգրավված լինել բջջային դինամիկայի և միտոքոնդրիալ ամբողջականության պահպանման մեջ՝ լյարդում ապոպտոզի, միտոֆագիայի և երկարակեցության միջոցով: Մեր տվյալները ցույց տվեցին, որ երկու գեներ ընդհանուր էին երեք փորձարկումներում՝ YKT6-ը և AKT1-ը: Հարկ է նշել, որ YKT6-ը SNARE սպիտակուց է, որը մասնակցում է բջջային թաղանթի միաձուլման գործընթացին: Այն դեր է խաղում աուտոֆագիայի և միտոֆագիայի մեջ՝ աուտոֆագոսոմի վրա STX17-ի և SNAP29-ի հետ նախաձեռնողական համալիր ձևավորելով, դրանով իսկ նպաստելով աուտոֆագոսոմների և լիզոսոմների միաձուլմանը [35]: Ավելին, YKT6 ֆունկցիայի կորուստը հանգեցնում է միտոֆագիայի խանգարման [36], մինչդեռ YKT6-ի ակտիվացումը կապված է լյարդի բջջային քաղցկեղի (HCC) առաջընթացի հետ, ինչը ցույց է տալիս բջիջների գոյատևման աճ [37]: Մյուս կողմից, AKT1-ը ամենակարևոր փոխազդող գենն է և կարևոր դեր է խաղում լյարդի հիվանդությունների մեջ, ներառյալ PI3K/AKT ազդանշանային ուղին, բջջային ցիկլը, բջիջների միգրացիան, բազմացումը, օջախային ադհեզիան, միտոքոնդրիալ ֆունկցիան և կոլագենի սեկրեցիան [38–40]: Ակտիվացված PI3K/AKT ազդանշանային ուղին կարող է ակտիվացնել արյունաստեղծ ցողունային բջիջները (HSC), որոնք բջիջներ են, որոնք պատասխանատու են արտաբջջային մատրիցի (ECM) արտադրության համար, և դրա դիսռեգուլյացիան կարող է նպաստել լյարդի ֆիբրոզի առաջացմանը և առաջընթացին [40]: Բացի այդ, AKT-ն բջիջների գոյատևման հիմնական գործոններից մեկն է, որը կանխում է p53-կախյալ բջջային ապոպտոզը, և AKT-ի ակտիվացումը կարող է կապված լինել լյարդի բջիջների ապոպտոզի արգելակման հետ [41, 42]: Ստացված արդյունքները ենթադրում են, որ IPA-ն կարող է ներգրավված լինել լյարդի միտոքոնդրիաների հետ կապված ապոպտոզի մեջ՝ ազդելով հեպատոցիտների որոշման վրա՝ մտնել ապոպտոզի մեջ, թե գոյատևել։ Այս ազդեցությունները կարող են կարգավորվել AKT և/կամ YKT6 թեկնածու գեներով, որոնք կարևոր են լյարդի հոմեոստազի համար։
Մեր արդյունքները ցույց տվեցին, որ 1 մՄ IPA-ն առաջացրել է ապոպտոզ և նվազեցրել է միտոքոնդրիալ շնչառությունը LX-2 բջիջներում՝ անկախ TGF-β1 բուժումից: Հատկանշական է, որ ապոպտոզը ֆիբրոզի լուծման և արյունաստեղծ ցողունային բջիջների (HSC) ակտիվացման հիմնական ուղի է, ինչպես նաև լյարդի ֆիբրոզի շրջելի ֆիզիոլոգիական արձագանքի հիմնական իրադարձություն է [4, 43]: Ավելին, BHI-ի վերականգնումը LX-2 բջիջներում համակցված բուժումից հետո նոր պատկերացում տվեց IPA-ի պոտենցիալ դերի մասին միտոքոնդրիալ կենսաէներգետիկայի կարգավորման մեջ: Հանգստի և ոչ ակտիվ պայմաններում արյունաստեղծ բջիջները սովորաբար օգտագործում են միտոքոնդրիալ օքսիդատիվ ֆոսֆորիլացումը՝ ATP արտադրելու համար և ունեն ցածր նյութափոխանակության ակտիվություն: Մյուս կողմից, HSC ակտիվացումը ուժեղացնում է միտոքոնդրիալ շնչառությունը և կենսասինթեզը՝ գլիկոլիտիկ վիճակի մեջ մտնելու էներգիայի պահանջները փոխհատուցելու համար [44]: Այն փաստը, որ IPA-ն չի ազդել նյութափոխանակության ներուժի և ECAR-ի վրա, ենթադրում է, որ գլիկոլիտիկ ուղին պակաս առաջնահերթ է: Նմանապես, մեկ այլ ուսումնասիրություն ցույց տվեց, որ 1 մՄ IPA-ն կարողացավ մոդուլացնել միտոքոնդրիալ շնչառական շղթայի ակտիվությունը կարդիոմիոցիտներում, մարդու հեպատոցիտային բջջային գծում (Huh7) և մարդու պորտալարի երակի էնդոթելային բջիջներում (HUVEC): Այնուամենայնիվ, IPA-ի որևէ ազդեցություն չի հայտնաբերվել կարդիոմիոցիտներում գլիկոլիզի վրա, ինչը ենթադրում է, որ IPA-ն կարող է ազդել այլ բջջային տեսակների կենսաէներգետիկայի վրա [45]: Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ 1 մՄ IPA-ն կարող է գործել որպես մեղմ քիմիական անջատիչ, քանի որ այն կարող է զգալիորեն նվազեցնել ֆիբրոգեն գեների արտահայտությունը, բջջային ձևաբանությունը և միտոքոնդրիալ կենսաէներգետիկան՝ առանց mtDNA-ի քանակը փոխելու [46]: Միտոքոնդրիալ անջատիչները կարող են արգելակել կուլտուրայի առաջացրած ֆիբրոզը և HSC ակտիվացումը [47] և նվազեցնել միտոքոնդրիալ ATP-ի արտադրությունը, որը կարգավորվում կամ ինդուկցվում է որոշակի սպիտակուցներով, ինչպիսիք են անջատող սպիտակուցները (UCP) կամ ադենին նուկլեոտիդային տրանսլոկազը (ANT): Կախված բջջի տեսակից, այս երևույթը կարող է պաշտպանել բջիջները ապոպտոզից և/կամ խթանել ապոպտոզը [46]: Այնուամենայնիվ, անհրաժեշտ են հետագա ուսումնասիրություններ՝ պարզաբանելու IPA-ի դերը որպես միտոքոնդրիալ ապակապակցիչ արյունաստեղծ ցողունային բջիջների ապաակտիվացման գործում։
Այնուհետև մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք միտոքոնդրիալ շնչառության փոփոխությունները արտացոլվում են կենդանի LX-2 բջիջների միտոքոնդրիալ ձևաբանության մեջ: Հետաքրքիր է, որ TGF-β1-ի բուժումը փոխում է միտոքոնդրիալ համամասնությունը գնդաձևից մինչև միջանկյալ, նվազեցնելով միտոքոնդրիալ ճյուղավորումը և ավելացնելով DRP1-ի էքսպրեսիան, որը միտոքոնդրիալ ճեղքման հիմնական գործոն է [48]: Ավելին, միտոքոնդրիալ մասնատումը կապված է ցանցի ընդհանուր բարդության հետ, և միաձուլումից դեպի ճեղքման անցումը կարևոր է արյունաստեղծ ցողունային բջիջների (HSC) ակտիվացման համար, մինչդեռ միտոքոնդրիալ ճեղքման արգելակումը հանգեցնում է HSC ապոպտոզի [49]: Այսպիսով, մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ TGF-β1 բուժումը կարող է առաջացնել միտոքոնդրիալ ցանցի բարդության նվազում՝ ճյուղավորման նվազման հետ, որն ավելի տարածված է ակտիվացված արյունաստեղծ ցողունային բջիջների (HSC) հետ կապված միտոքոնդրիալ ճեղքման դեպքում: Ավելին, մեր տվյալները ցույց տվեցին, որ IPA-ն կարող է փոխել միտոքոնդրիալների համամասնությունը գնդաձևից մինչև միջանկյալ ձև, դրանով իսկ նվազեցնելով OPA1-ի և MFN2-ի էքսպրեսիան: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ OPA1-ի նվազումը կարող է առաջացնել միտոքոնդրիալ թաղանթային պոտենցիալի նվազում և առաջացնել բջջային ապոպտոզ [50]: Հայտնի է, որ MFN2-ը միջնորդում է միտոքոնդրիալ միաձուլումը և ապոպտոզը [51]: Ստացված արդյունքները ենթադրում են, որ LX-2 բջիջների ինդուկցիան TGF-β1-ի և/կամ IPA-ի կողմից, կարծես թե, մոդուլացնում է միտոքոնդրիալների ձևն ու չափը, ինչպես նաև ակտիվացման վիճակը և ցանցի բարդությունը:
Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ TGFβ-1-ի և IPA-ի համակցված բուժումը կարող է նվազեցնել mtDNA-ն և բջջային ձևաբանական պարամետրերը՝ կարգավորելով ֆիբրոզի, ապոպտոզի և գոյատևման հետ կապված գեների mRNA արտահայտությունը ապոպտոզից խուսափող բջիջներում: Իրոք, IPA-ն նվազեցրել է AKT1-ի և կարևոր ֆիբրոզի գեների, ինչպիսիք են COL1A2-ը և MMP2-ը, mRNA արտահայտման մակարդակը, բայց մեծացրել է CASP8-ի արտահայտման մակարդակը, որը կապված է ապոպտոզի հետ: Մեր արդյունքները ցույց են տվել, որ IPA-ով բուժումից հետո BAX արտահայտությունը նվազել է, իսկ TIMP1 ընտանիքի ենթամիավորների, BCL-2-ի և NF-κB-ի mRNA արտահայտությունը աճել է, ինչը ենթադրում է, որ IPA-ն կարող է խթանել գոյատևման ազդանշանները արյունաստեղծ ցողունային բջիջներում (HSC), որոնք խուսափում են ապոպտոզից: Այս մոլեկուլները կարող են գործել որպես գոյատևմանն ուղղված ազդանշաններ ակտիվացված արյունաստեղծ ցողունային բջիջներում, ինչը կարող է կապված լինել հակաապոպտոզային սպիտակուցների (օրինակ՝ Bcl-2) արտահայտման աճի, պրոապոպտոզային BAX-ի արտահայտման նվազման և TIMP-ի ու NF-κB-ի միջև բարդ փոխազդեցության հետ [5, 7]: IPA-ն իր ազդեցությունն իրականացնում է PXR-ի միջոցով, և մենք պարզեցինք, որ TGF-β1-ի և IPA-ի համակցված բուժումը մեծացնում է PXR mRNA-ի արտահայտման մակարդակը, ինչը վկայում է HSC ակտիվացման ճնշման մասին: Ակտիվացված PXR ազդանշանային ուղին հայտնի է նրանով, որ կանխում է HSC ակտիվացումը ինչպես in vivo, այնպես էլ in vitro [52, 53]: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ IPA-ն կարող է մասնակցել ակտիվացված HSC-ների մաքրմանը՝ խթանելով ապոպտոզը, նվազեցնելով ֆիբրոզը և միտոքոնդրիալ նյութափոխանակությունը, ինչպես նաև ուժեղացնելով գոյատևման ազդանշանները, որոնք բնորոշ գործընթացներ են, որոնք ակտիվացված HSC ֆենոտիպը փոխակերպում են ոչ ակտիվացվածի: IPA-ի ապոպտոզում պոտենցիալ մեխանիզմի և դերի մեկ այլ հնարավոր բացատրությունն այն է, որ այն մաքրում է դիսֆունկցիոնալ միտոքոնդրիաները հիմնականում միտոֆագիայի (ներքին ուղի) և արտաքին TNF ազդանշանային ուղու միջոցով (աղյուսակ 1), որը ուղղակիորեն կապված է NF-κB գոյատևման ազդանշանային ուղու հետ (Լրացուցիչ նկար 7): Հետաքրքիր է, որ IPA-ի հետ կապված հարստացված գեները կարող են ինդուկցել ապոպտոզի պրո-ապոտոզային և գոյատևման պրո-ազդանշաններ ապոպտոզի ուղում [54], ինչը ենթադրում է, որ IPA-ն կարող է ինդուկցել ապոպտոզի ուղին կամ գոյատևումը՝ փոխազդելով այս գեների հետ: Այնուամենայնիվ, թե ինչպես է IPA-ն ինդուկցում ապոպտոզ կամ գոյատևում HSC ակտիվացման ընթացքում և դրա մեխանիստական ​​ուղիները, մնում են անհասկանալի:
IPA-ն մանրէային մետաբոլիտ է, որը ձևավորվում է սննդային տրիպտոֆանից՝ աղիքային միկրոբիոտայի միջոցով: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ այն ունի հակաբորբոքային, հակաօքսիդանտային և էպիգենետիկ կարգավորող հատկություններ աղիքային միջավայրում:[55] Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ IPA-ն կարող է մոդուլացնել աղիքային պատնեշի գործառույթը և նվազեցնել օքսիդատիվ սթրեսը, ինչը կարող է նպաստել դրա տեղային ֆիզիոլոգիական ազդեցություններին:[56] Փաստորեն, IPA-ն տեղափոխվում է թիրախային օրգաններ արյան շրջանառության միջոցով, և քանի որ IPA-ն ունի նմանատիպ հիմնական մետաբոլիտների կառուցվածք տրիպտոֆանի, սերոտոնինի և ինդոլի ածանցյալների հետ, IPA-ն իրականացնում է նյութափոխանակության գործողություններ, որոնք հանգեցնում են մրցակցային նյութափոխանակության ճակատագրերի:[52] IPA-ն կարող է մրցակցել տրիպտոֆանից ստացված մետաբոլիտների հետ՝ ֆերմենտների կամ ընկալիչների վրա կապող տեղամասերի համար, հնարավոր է՝ խաթարելով նորմալ նյութափոխանակության ուղիները: Սա ընդգծում է դրա ֆարմակոկինետիկայի և ֆարմակոդինամիկայի վերաբերյալ հետագա ուսումնասիրությունների անհրաժեշտությունը՝ դրա թերապևտիկ պատուհանն ավելի լավ հասկանալու համար:[57] Դեռևս պարզ չէ, թե արդյոք սա կարող է տեղի ունենալ նաև արյունաստեղծ ցողունային բջիջներում (HSC):
Մենք ընդունում ենք, որ մեր ուսումնասիրությունն ունի որոշ սահմանափակումներ: IPA-ի հետ կապված կապերը հատուկ ուսումնասիրելու համար մենք բացառեցինք 2-րդ տիպի շաքարային դիաբետով (T2DM) հիվանդներին: Մենք ընդունում ենք, որ սա սահմանափակում է մեր արդյունքների լայն կիրառելիությունը 2-րդ տիպի շաքարային դիաբետով և լյարդի առաջադեմ հիվանդությամբ հիվանդների մոտ: Չնայած մարդու շիճուկում IPA-ի ֆիզիոլոգիական կոնցենտրացիան 1-10 մկՄ է [11, 20], 1 մՄ IPA կոնցենտրացիան ընտրվել է ամենաբարձր ոչ թունավոր կոնցենտրացիայի [15] և ապոպտոզի ամենաբարձր մակարդակի հիման վրա՝ առանց նեկրոտիկ բջիջների պոպուլյացիայի տոկոսային տարբերության: Չնայած այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործվել են IPA-ի գերֆիզիոլոգիական մակարդակները, ներկայումս IPA-ի արդյունավետ դոզայի վերաբերյալ կոնսենսուս չկա [52]: Չնայած մեր արդյունքները նշանակալի են, IPA-ի ավելի լայն նյութափոխանակության ճակատագիրը մնում է հետազոտության ակտիվ ոլորտ: Ավելին, շիճուկում IPA-ի մակարդակի և լյարդի տրանսկրիպտների ԴՆԹ մեթիլացման միջև կապի վերաբերյալ մեր արդյունքները ստացվել են ոչ միայն արյունաստեղծ ցողունային բջիջներից (HSC), այլև լյարդի հյուսվածքներից: Մենք որոշեցինք օգտագործել մարդու LX-2 բջիջները՝ հիմնվելով տրանսկրիպտոմային վերլուծության մեր նախորդ արդյունքների վրա, որոնք ցույց էին տալիս, որ IPA-ն կապված է արյունաստեղծ ցողունային բջիջների (HSC) ակտիվացման հետ [15], և HSC-ները լյարդի ֆիբրոզի առաջընթացի հիմնական բջիջներն են: Լյարդը կազմված է բազմաթիվ բջջային տեսակներից, ուստի IPA-ի դերը և դրա փոխազդեցությունը լյարդի այլ բջիջների տեսակների հետ ուսումնասիրելու համար պետք է դիտարկել այլ բջջային մոդելներ, ինչպիսիք են հեպատոցիտ-HSC-իմունային բջիջների համատեղ կուլտուրայի համակարգը՝ զուգակցված կասպազի ակտիվացման և ԴՆԹ-ի մասնատման հետ, ինչպես նաև գործողության մեխանիզմը, ներառյալ սպիտակուցի մակարդակը: