Հոդվածը «Բուսակերների դիմադրողականության բարելավումը հարուցիչների և վնասատուների նկատմամբ» հետազոտական ​​թեմայի մի մասն է, դիտեք բոլոր 5 հոդվածները
Սնկային բույսերի նեկրոզի՝ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary հիվանդության հարուցիչը կիրառում է բազմաշերտ ռազմավարություն՝ տարբեր տեր բույսեր վարակելու համար: Այս ուսումնասիրությունը առաջարկում է դիամին L-օրնիթինի՝ ոչ սպիտակուցային ամինաթթվի օգտագործումը, որը խթանում է այլ էական ամինաթթուների սինթեզը, որպես այլընտրանքային կառավարման ռազմավարություն՝ Phaseolus vulgaris L.-ի մոլեկուլային, ֆիզիոլոգիական և կենսաքիմիական արձագանքները Pseudomonas sclerotiorum-ի կողմից առաջացած սպիտակ բորբոսի նկատմամբ բարելավելու համար: In vitro փորձարկումները ցույց են տվել, որ L-օրնիթինը զգալիորեն արգելակել է S. pyrenoidosa-ի միցելիումային աճը՝ դեղաչափից կախված եղանակով: Ավելին, այն կարող է զգալիորեն նվազեցնել սպիտակ բորբոսի ծանրությունը ջերմոցային պայմաններում: Ավելին, L-օրնիթինը խթանել է մշակված բույսերի աճը, ինչը ցույց է տալիս, որ L-օրնիթինի փորձարկված կոնցենտրացիաները ֆիտոթոքսիկ չեն մշակված բույսերի համար: Բացի այդ, L-օրնիտինը ուժեղացրել է ոչ ֆերմենտային հակաօքսիդանտների (ընդհանուր լուծվող ֆենոլներ և ֆլավոնոիդներ) և ֆերմենտային հակաօքսիդանտների (կատալազ (CAT), պերօքսիդազ (POX) և պոլիֆենոլ օքսիդազ (PPO)) էքսպրեսիան, ինչպես նաև մեծացրել է հակաօքսիդանտներին առնչվող երեք գեների (PvCAT1, PvSOD և PvGR) էքսպրեսիան: Ավելին, in silico վերլուծությունը բացահայտել է S. sclerotiorum գենոմում ենթադրյալ օքսալոացետատ ացետիլհիդրոլազ (SsOAH) սպիտակուցի առկայությունը, որը շատ նման էր Aspergillus fijiensis (AfOAH) և Penicillium sp. (PlOAH) օքսալոացետատ ացետիլհիդրոլազ (SsOAH) սպիտակուցներին՝ ֆունկցիոնալ վերլուծության, պահպանված դոմենների և տոպոլոգիայի առումով: Հետաքրքիր է, որ L-օրնիթինի ավելացումը կարտոֆիլի դեքստրոզային արգանակի (PDB) միջավայրում զգալիորեն նվազեցրել է SsOAH գենի էքսպրեսիան S. sclerotiorum միցելիում: Նմանապես, L-օրնիթինի էկզոգեն կիրառումը զգալիորեն նվազեցրել է SsOAH գենի արտահայտությունը մշակված բույսերից հավաքված սնկային միցելիում: Վերջապես, L-օրնիթինի կիրառումը զգալիորեն նվազեցրել է թրթնջկաթթվի սեկրեցիան ինչպես PDB միջավայրում, այնպես էլ վարակված տերևներում: Եզրակացնելով՝ L-օրնիթինը կարևոր դեր է խաղում օքսիդա-վերականգնման կարգավիճակի պահպանման, ինչպես նաև վարակված բույսերի պաշտպանական ռեակցիայի բարելավման գործում: Այս ուսումնասիրության արդյունքները կարող են օգնել մշակել սպիտակ բորբոսի դեմ պայքարի նորարարական, էկոլոգիապես մաքուր մեթոդներ և մեղմել դրա ազդեցությունը լոբու և այլ մշակաբույսերի արտադրության վրա:
Սպիտակ բորբոսը, որն առաջանում է նեկրոտրոֆիկ Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary սնկով, կործանարար, բերքատվությունը նվազեցնող հիվանդություն է, որը լուրջ սպառնալիք է ներկայացնում լոբու (Phaseolus vulgaris L.) համաշխարհային արտադրության համար (Bolton et al., 2006): Sclerotinia sclerotiorum-ը հողում տարածվող սնկային բույսերի պաթոգեններից ամենադժվար վերահսկվողներից մեկն է՝ ավելի քան 600 բուսատեսակների լայն տեսականիով և տիրոջ հյուսվածքները արագորեն ոչ սպեցիֆիկ եղանակով թրջելու ունակությամբ (Liang and Rollins, 2018): Անբարենպաստ պայմաններում այն ​​անցնում է իր կյանքի ցիկլի կրիտիկական փուլ՝ երկար ժամանակ մնալով անգործունակ՝ որպես սև, կոշտ, սերմնանման կառուցվածքներ հողում, որոնք կոչվում են «սկլերոտիաներ», կամ որպես սպիտակ, փափուկ աճեր վարակված բույսերի միցելիումում կամ ցողունի մեջ (Schwartz et al., 2005): S. sclerotiorum-ը կարող է առաջացնել սկլերոտիաներ, ինչը թույլ է տալիս նրան երկար ժամանակ գոյատևել վարակված դաշտերում և պահպանվել հիվանդության ընթացքում (Schwartz et al., 2005): Սկլերոտիաները հարուստ են սննդարար նյութերով, կարող են պահպանվել հողում երկար ժամանակ և ծառայել որպես հետագա վարակների հիմնական վարակիչ նյութ (Schwartz et al., 2005): Բարենպաստ պայմաններում սկլերոտիաները բողբոջում են և արտադրում են օդակաթիլային սպորներ, որոնք կարող են վարակել բույսի բոլոր վերգետնյա մասերը, ներառյալ, բայց չսահմանափակվելով ծաղիկներով, ցողուններով կամ պատիճներով (Schwartz et al., 2005):
Sclerotinia sclerotiorum-ը օգտագործում է բազմաշերտ ռազմավարություն իր տեր բույսերը վարակելու համար, որը ներառում է համակարգված իրադարձությունների շարք՝ սկլերոտիալ բողբոջումից մինչև ախտանիշների զարգացումը: Սկզբում S. sclerotiorum-ը արտադրում է կախված սպորներ (կոչվում են ասկոսպորներ) սնկանման կառուցվածքներից, որոնք կոչվում են ապոթեցիներ, որոնք օդային ճանապարհով տարածվում են և զարգանում են ոչ շարժուն սկլերոտիաների՝ վարակված բույսերի մնացորդների վրա (Bolton et al., 2006): Այնուհետև սունկը արտազատում է թրթնջուկային թթու, որը վիրուլենտության գործոն է՝ բույսի բջջային պատի pH-ը կարգավորելու, ֆերմենտատիվ քայքայումը և հյուսվածքների ներխուժումը խթանելու (Hegedus and Rimmer, 2005) և տեր բույսի օքսիդատիվ պայթյունը ճնշելու համար: Այս թթվայնացման գործընթացը թուլացնում է բույսի բջջային պատը՝ ստեղծելով բարենպաստ միջավայր սնկային բջջային պատը քայքայող ֆերմենտների (CWDE) բնականոն և արդյունավետ գործունեության համար, թույլ տալով պաթոգենին հաղթահարել ֆիզիկական պատնեշը և ներթափանցել տեր հյուսվածքներ (Marciano et al., 1983): Ներթափանցելուց հետո S. sclerotiorum-ը արտազատում է մի շարք CWDE-ներ, ինչպիսիք են պոլիգալակտուրոնազը և ցելյուլազը, որոնք նպաստում են դրա տարածմանը վարակված հյուսվածքներում և առաջացնում հյուսվածքային նեկրոզ: Վնասվածքների և հիֆալային գորգերի առաջընթացը հանգեցնում է սպիտակ բորբոսի բնորոշ ախտանիշների (Hegedus and Rimmer, 2005): Միևնույն ժամանակ, տեր բույսերը ճանաչում են պաթոգենին կապված մոլեկուլային օրինաչափությունները (PAMPs) օրինաչափությունների ճանաչման ընկալիչների (PRRs) միջոցով՝ առաջացնելով մի շարք ազդանշանային իրադարձություններ, որոնք, ի վերջո, ակտիվացնում են պաշտպանական ռեակցիաները:
Հիվանդությունների դեմ պայքարի տասնամյակներ տևած ջանքերին չնայած, լոբու մեջ, ինչպես նաև այլ առևտրային մշակաբույսերում, բավարար դիմացկուն սաղմնային պլազմայի պակաս կա՝ պաթոգենի դիմադրողականության, գոյատևման և հարմարվողականության պատճառով: Հետևաբար, հիվանդությունների կառավարումը չափազանց մարտահրավեր է և պահանջում է ինտեգրված, բազմակողմանի ռազմավարություն, որը ներառում է մշակութային պրակտիկայի, կենսաբանական վերահսկողության և քիմիական ֆունգիցիդների համադրություն (O'Sullivan et al., 2021): Սպիտակ բորբոսի քիմիական դեմ պայքարն ամենաարդյունավետն է, քանի որ ֆունգիցիդները, ճիշտ և ճիշտ ժամանակին կիրառվելու դեպքում, կարող են արդյունավետորեն վերահսկել հիվանդության տարածումը, նվազեցնել վարակի ծանրությունը և նվազագույնի հասցնել բերքի կորուստները: Այնուամենայնիվ, ֆունգիցիդների չափազանց օգտագործումը և չափազանց կախվածությունը կարող են հանգեցնել S. sclerotiorum-ի դիմացկուն շտամների առաջացմանը և բացասաբար ազդել ոչ թիրախային օրգանիզմների, հողի առողջության և ջրի որակի վրա (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024): Հետևաբար, շրջակա միջավայրի համար անվտանգ այլընտրանքների որոնումը դարձել է գերակա խնդիր:
Պոլիամինները (ՊԱ), ինչպիսիք են պուտրեցինը, սպերմիդինը, սպերմինը և կադավերինը, կարող են ծառայել որպես խոստումնալից այլընտրանքներ հողում աճող բույսերի պաթոգենների դեմ, այդպիսով ամբողջությամբ կամ մասնակիորեն նվազեցնելով վտանգավոր քիմիական ֆունգիցիդների օգտագործումը (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024): Բարձրակարգ բույսերում ՊԱ-ները մասնակցում են բազմաթիվ ֆիզիոլոգիական գործընթացների, այդ թվում՝ բջիջների բաժանման, դիֆերենցման և աբիոտիկ և կենսաբանական սթրեսների նկատմամբ արձագանքի (Killiny and Nehela, 2020): Դրանք կարող են գործել որպես հակաօքսիդանտներ, օգնել ռեակտիվ թթվածնային տեսակների (ROS) կլանմանը, պահպանել օքսիդա-վերականգնողական հոմեոստազը (Nehela and Killiny, 2023), ինդուկցել պաշտպանական գեներ (Romero et al., 2018), կարգավորել տարբեր նյութափոխանակության ուղիներ (Nehela and Killiny, 2023), մոդուլացնել էնդոգեն ֆիտոհորմոնները (Nehela and Killiny, 2019), ստեղծել համակարգային ձեռքբերովի դիմադրություն (SAR) և կարգավորել բույս-պաթոգեն փոխազդեցությունները (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022): Հարկ է նշել, որ բույսերի պաշտպանության մեջ ՖԹ-ների կոնկրետ մեխանիզմներն ու դերը տարբերվում են՝ կախված բույսի տեսակից, պաթոգեններից և շրջակա միջավայրի պայմաններից: Բույսերում ամենատարածված ՖԹ-ն կենսասինթեզվում է էական պոլիամին L-օրնիթինից (Killiny and Nehela, 2020):
L-օրնիտինը բազմակի դեր է խաղում բույսերի աճի և զարգացման մեջ: Օրինակ, նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ բրնձի (Oryza sativa) մեջ օրնիտինը կարող է կապված լինել ազոտի վերամշակման (Liu et al., 2018), բրնձի բերքատվության, որակի և բույրի (Lu et al., 2020) և ջրային սթրեսի նկատմամբ արձագանքի (Yang et al., 2000) հետ: Ավելին, L-օրնիթինի էկզոգեն կիրառումը զգալիորեն բարելավել է շաքարի ճակնդեղի (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) երաշտի նկատմամբ դիմադրողականությունը և մեղմացրել է աղային սթրեսը սոխի (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) և գետնանուշի (Anacardium occidentale) բույսերի մոտ (da Rocha et al., 2012): L-օրնիթինի հնարավոր դերը աբիոտիկ սթրեսից պաշտպանության մեջ կարող է պայմանավորված լինել մշակված բույսերում պրոլինի կուտակման մեջ դրա մասնակցությամբ: Օրինակ, նախկինում հաղորդվել է, որ պրոլինի նյութափոխանակության հետ կապված գեները, ինչպիսիք են օրնիտին դելտա ամինոտրանսֆերազը (դելտա-OAT) և պրոլին դեհիդրոգենազը (ProDH1 և ProDH2) գեները, մասնակցում են Nicotiana benthamiana և Arabidopsis thaliana-ի պաշտպանությանը ոչ տեր Pseudomonas syringae շտամներից (Senthil-Kumar and Mysore, 2012): Մյուս կողմից, սնկային օրնիտին դեկարբօքսիլազը (ODC) անհրաժեշտ է պաթոգենի աճի համար (Singh et al., 2020): Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici-ի ODC-ն թիրախավորելը տեր-ի կողմից ինդուկցված գեների լռեցման (HIGS) միջոցով զգալիորեն մեծացրել է լոլիկի բույսերի դիմադրողականությունը ֆուզարիումի թառամման նկատմամբ (Singh et al., 2020): Այնուամենայնիվ, էկզոգեն օրնիթինի կիրառման հնարավոր դերը կենսաբանական սթրեսների, ինչպիսիք են ֆիտոպաթոգենները, դեմ լավ ուսումնասիրված չէ: Ավելի կարևոր է, որ օրնիթինի ազդեցությունը հիվանդությունների նկատմամբ դիմադրության և դրանց հետ կապված կենսաքիմիական և ֆիզիոլոգիական երևույթների վրա մեծ մասամբ դեռևս չուսումնասիրված է։
Լոբազգիների S. sclerotiorum վարակի բարդության ըմբռնումը կարևոր է արդյունավետ վերահսկողության ռազմավարությունների մշակման համար: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք նպատակ ունեինք բացահայտել դիամին L-օրնիթինի պոտենցիալ դերը որպես Sclerotinia sclerotiorum վարակի նկատմամբ լոբազգի բույսերի պաշտպանական մեխանիզմների և դիմադրության բարելավման հիմնական գործոն: Մենք ենթադրում ենք, որ վարակված բույսերի պաշտպանական ռեակցիաների բարելավումից բացի, L-օրնիթինը նաև հիմնական դեր է խաղում օքսիդա-վերականգնման կարգավիճակի պահպանման գործում: Մենք ենթադրում ենք, որ L-օրնիթինի պոտենցիալ ազդեցությունները կապված են ֆերմենտատիվ և ոչ ֆերմենտատիվ հակաօքսիդանտային պաշտպանական մեխանիզմների կարգավորման և սնկային պաթոգենության/վիրուլենտության գործոնների և դրանց հետ կապված սպիտակուցների խանգարման հետ: L-օրնիթինի այս կրկնակի ֆունկցիոնալությունը այն դարձնում է խոստումնալից թեկնածու՝ սպիտակ բորբոսի ազդեցությունը մեղմելու և սովորական լոբազգի մշակաբույսերի դիմադրությունը այս հզոր սնկային պաթոգենի նկատմամբ բարձրացնելու կայուն ռազմավարության համար: Ներկայիս ուսումնասիրության արդյունքները կարող են օգնել սպիտակ բորբոսի վերահսկման և լոբազգիների արտադրության վրա դրա ազդեցությունը մեղմելու նորարարական, էկոլոգիապես մաքուր մեթոդների մշակման գործում:
Այս ուսումնասիրության մեջ որպես փորձարարական նյութ օգտագործվել է սովորական լոբու զգայուն առևտրային տեսակ՝ Գիզա 3-ը (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3): Առողջ սերմերը բարեհամբույր կերպով տրամադրվել են Եգիպտոսի Գյուղատնտեսական հետազոտությունների կենտրոնի (ARC) դաշտային մշակաբույսերի հետազոտությունների բաժնի (FCRI) լոբազգիների հետազոտությունների բաժնի կողմից: Հինգ սերմ ցանվել է պլաստիկե ամանների մեջ (ներքին տրամագիծը՝ 35 սմ, խորությունը՝ 50 սմ), որոնք լցված են S. sclerotiorum-ով վարակված հողով՝ ջերմոցային պայմաններում (25 ± 2 °C, հարաբերական խոնավություն՝ 75 ± 1%, 8 ժամ լույս/16 ժամ մութ): Ցանից (DPS) 7-10 օր անց սածիլները նոսրացվել են՝ յուրաքանչյուր ամանում թողնելով միայն երկու սածիլ՝ միատարր աճով և երեք լիովին լայնացած տերևներով: Բոլոր ամանների մեջ դրված բույսերը ջրվել են երկու շաբաթը մեկ անգամ և ամսական պարարտացվել են տվյալ տեսակի համար խորհուրդ տրված չափաբաժնով:
L-օրնիթինիդիամինի (հայտնի է նաև որպես (+)-(S)-2,5-դիամինոպենտանոաթթու; Sigma-Aldrich, Դարմշտադտ, Գերմանիա) 500 մգ/լ կոնցենտրացիա պատրաստելու համար 50 մգ-ը նախ լուծվել է 100 մլ ստերիլ թորած ջրի մեջ։ Այնուհետև ստացված լուծույթը նոսրացվել է և օգտագործվել հետագա փորձերում։ Հակիրճ ասած, L-օրնիթինի կոնցենտրացիաների վեց շարք (12.5, 25, 50, 75, 100 և 125 մգ/լ) փորձարկվել են in vitro պայմաններում։ Բացի այդ, որպես բացասական վերահսկողություն (Mock) օգտագործվել է ստերիլ թորած ջուր, իսկ որպես դրական վերահսկողություն՝ առևտրային ֆունգիցիդ «Rizolex-T» 50% թրջվող փոշի (toclofos-methyl 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Ղարբիա նահանգ, Եգիպտոս)։ Առևտրային ֆունգիցիդ «Ռիզոլեքս-Տ»-ն փորձարկվել է in vitro հինգ կոնցենտրացիաներով (2, 4, 6, 8 և 10 մգ/լ):
Սպիտակ բորբոսի բնորոշ ախտանիշներ ցուցաբերող սովորական լոբու ցողունների և պատիճների նմուշներ (վարակի մակարդակը՝ 10–30%) հավաքվել են առևտրային ֆերմաներից: Չնայած վարակված բուսական նյութերի մեծ մասը նույնականացվել է տեսակների/տարբերակների միջոցով (զգայուն առևտրային տեսակ՝ Գիզա 3), մյուսները, հատկապես տեղական շուկաներից ստացվածները, անհայտ տեսակի էին: Հավաքված վարակված նյութերը նախ մակերեսային ախտահանվել են 0.5% նատրիումի հիպոքլորիտի լուծույթով 3 րոպե, այնուհետև մի քանի անգամ լվացվել են ստերիլ թորած ջրով և չորացվել ստերիլ ֆիլտրի թղթով՝ ավելորդ ջուրը հեռացնելու համար: Այնուհետև վարակված օրգանները կտրվել են փոքր կտորների միջին հյուսվածքից (առողջ և վարակված հյուսվածքների միջև), կուլտիվացվել են կարտոֆիլի դեքստրոզային ագարի (PDA) միջավայրում և ինկուբացվել 25 ± 2 °C ջերմաստիճանում՝ 12 ժամ լույս/12 ժամ մթության ցիկլով 5 օրվա ընթացքում՝ սկլերոտիաների առաջացումը խթանելու համար: Միցելիալ ծայրի մեթոդը նույնպես օգտագործվել է խառը կամ աղտոտված կուլտուրաներից սնկային իզոլյատները մաքրելու համար: Մաքրված սնկային իզոլյատը նախ նույնականացվել է իր մշակութային ձևաբանական բնութագրերի հիման վրա, ապա հաստատվել է որպես S. sclerotiorum՝ մանրադիտակային առանձնահատկությունների հիման վրա: Վերջապես, բոլոր մաքրված մեկուսացված շտամները ստուգվել են պաթոգենության համար զգայուն տարածված լոբու Giza 3 սորտի վրա՝ Կոխի պոստուլատներին համապատասխանելու համար։
Բացի այդ, S. sclerotiorum-ի ամենաինվազիվ իզոլյատը (իզոլյատ #3) հետագայում հաստատվեց ներքին տրանսկրիպցիայի միջոցով (ITS) հաջորդականության որոշման միջոցով, ինչպես նկարագրվել է White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017-ի կողմից: Հակիրճ ասած, իզոլյատները կուլտիվացվել են կարտոֆիլի դեքստրոզային արգանակում (PDB) և ինկուբացվել են 25 ± 2 °C ջերմաստիճանում 5-7 օրվա ընթացքում: Այնուհետև սնկային միցելիումը հավաքվել է, զտվել է պանրով, երկու անգամ լվացվել է ստերիլ ջրով և չորացվել ստերիլ ֆիլտրի թղթով: Գենոմային ԴՆԹ-ն իզոլացվել է Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit-ի միջոցով (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024): Այնուհետև ITS rDNA շրջանը ամպլիֆիկացվել է ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; սպասվող չափը՝ 540 զույգ հիմք) հատուկ պրայմեր զույգի միջոցով (Baturo-Ciesniewska et al., 2017): Մաքրված ՊՇՌ արգասիքները ներկայացվել են հաջորդականության որոշման (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.): ITS rDNA հաջորդականությունները հաջորդականացվել են երկկողմանի՝ օգտագործելով Սանգերի հաջորդականության որոշման մեթոդը: Հավաքված հարցման հաջորդականությունները այնուհետև համեմատվել են GenBank-ում և Կենսատեխնոլոգիական տեղեկատվության ազգային կենտրոնում (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) առկա վերջին տվյալների հետ՝ օգտագործելով BLASTn ծրագրակազմը: Հարցման հաջորդականությունը համեմատվել է S. sclerotiorum-ի 20 այլ շտամների/իզոլյատների հետ, որոնք վերցված են NCBI GenBank-ում (Լրացուցիչ աղյուսակ S1) վերջին տվյալներից՝ օգտագործելով ClustalW-ը Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package-ում (MEGA-11; տարբերակ 11) (Kumar et al., 2024): Էվոլյուցիոն վերլուծությունը կատարվել է առավելագույն հավանականության մեթոդով և ընդհանուր ժամանակային շրջելի նուկլեոտիդային փոխարինման մոդելով (Nei and Kumar, 2000): Ցուցադրվում է ամենաբարձր լոգարիթմական հավանականություն ունեցող ծառը: Հևրիստիկ որոնման սկզբնական ծառը ընտրվում է՝ ընտրելով այն ծառը, որն ունի ավելի բարձր լոգարիթմական հավանականություն հարևանների միացման (NJ) ծառի (Kumar et al., 2024) և առավելագույն խնայողության (MP) ծառի միջև: NJ ծառը կառուցվել է զույգային հեռավորության մատրիցով, որը հաշվարկվել է ընդհանուր ժամանակային շրջելի մոդելի միջոցով (Nei and Kumar, 2000):
L-օրնիթինի և «Ռիզոլեքս-Տ» բակտերիասպանի հակաբակտերիալ ակտիվությունը որոշվել է in vitro՝ ագարի դիֆուզիայի մեթոդով: Մեթոդ. Վերցրեք L-օրնիթինի համապատասխան քանակի (500 մգ/լ) հիմնական լուծույթը և մանրակրկիտ խառնեք այն 10 մլ PDA սննդարար միջավայրի հետ՝ համապատասխանաբար 12.5, 25, 50, 75, 100 և 125 մգ/լ վերջնական կոնցենտրացիաներով լուծույթներ պատրաստելու համար: «Ռիզոլեքս-Տ» ֆունգիցիդի հինգ կոնցենտրացիաներ (2, 4, 6, 8 և 10 մգ/լ) և ստերիլ թորած ջուր օգտագործվել են որպես վերահսկիչ: Միջավայրի պնդացումից հետո, Sclerotinia sclerotiorum կուլտուրայի 4 մմ տրամագծով թարմ պատրաստված միցելիալ խցանը տեղափոխվել է Պետրիի ամանի կենտրոն և կուլտիվացվել է 25±2°C ջերմաստիճանում, մինչև միցելիումը ծածկի ամբողջ վերահսկիչ Պետրիի ամանը, որից հետո գրանցվել է սնկային աճը: Հաշվարկեք S. sclerotiorum-ի ճառագայթային աճի արգելակման տոկոսային արգելակումը՝ օգտագործելով հավասարում 1-ը.
Փորձը կրկնվել է երկու անգամ՝ յուրաքանչյուր վերահսկիչ/փորձարարական խմբի համար վեց կենսաբանական կրկնօրինակով և յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակի համար հինգ ծաղկամանով (յուրաքանչյուր ծաղկամանում երկու բույս): Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակ վերլուծվել է երկու անգամ (երկու տեխնիկական կրկնօրինակ)՝ փորձարարական արդյունքների ճշգրտությունը, հուսալիությունը և վերարտադրելիությունն ապահովելու համար: Բացի այդ, պրոբիտ ռեգրեսիոն վերլուծությունը կիրառվել է կիսամաքսիմալ արգելակող կոնցենտրացիան (IC50) և IC99-ը հաշվարկելու համար (Prentice, 1976):
Ջերմոցային պայմաններում L-օրնիթինի ներուժը գնահատելու համար անցկացվել են երկու հաջորդական ամանային փորձեր: Հակիրճ ասած, ամանները լցվել են ստերիլիզացված կավա-ավազային հողով (3:1) և ցանվել են S. sclerotiorum-ի թարմ պատրաստված մշակույթով: Նախ, S. sclerotiorum-ի ամենաինվազիվ մեկուսացված մանրէը (մեկուսացված #3) ցանվել է՝ մեկ սկլերոտիումը կիսով չափ կտրելով, այն դեմքով դեպի ներքև դնելով PDA-ի վրա և ինկուբացվելով 25°C ջերմաստիճանում մշտական ​​​​մթության մեջ (24 ժամ) 4 օր՝ միցելիումի աճը խթանելու համար: Այնուհետև առաջատար եզրից վերցվել են չորս 5 մմ տրամագծով ագարի խցաններ և ցանվել են 100 գ ցորենի և բրնձի թեփի ստերիլ խառնուրդով (1:1, v/v), և բոլոր սրվակները ինկուբացվել են 25 ± 2°C ջերմաստիճանում՝ 12 ժամ լույս/12 ժամ մթություն ցիկլի տակ՝ սկլերոտիաների առաջացումը խթանելու համար: Հող ավելացնելուց առաջ բոլոր սրվակների պարունակությունը մանրակրկիտ խառնվել է՝ միատարրություն ապահովելու համար: Այնուհետև, յուրաքանչյուր ամանի մեջ ավելացվել է 100 գ գաղութացնող թեփի խառնուրդ՝ հարուցիչների հաստատուն կոնցենտրացիան ապահովելու համար: Պատվաստված ամանները ջրվել են՝ սնկային աճը ակտիվացնելու համար և 7 օրով տեղադրվել են ջերմոցային պայմաններում:
Այնուհետև յուրաքանչյուր ամանի մեջ ցանվեց Գիզա 3 տեսակի հինգ սերմ: L-օրնիտինով և Rizolex-T ֆունգիցիդով մշակված ամանների համար ստերիլիզացված սերմերը նախ երկու ժամ թրջվեցին երկու միացությունների ջրային լուծույթում՝ համապատասխանաբար մոտ 250 մգ/լ և 50 մգ/լ վերջնական IC99 կոնցենտրացիայով, ապա մեկ ժամ չորացվեցին օդում ցանելուց առաջ: Մյուս կողմից, սերմերը թրջվեցին ստերիլ թորած ջրի մեջ՝ որպես բացասական վերահսկողություն: 10 օր անց, առաջին ջրելուց առաջ, սածիլները նոսրացվեցին՝ յուրաքանչյուր ամանում թողնելով միայն երկու մաքուր սածիլ: Բացի այդ, S. sclerotiorum-ով վարակվածությունն ապահովելու համար, նույն զարգացման փուլում գտնվող լոբու բույսերի ցողունները (10 օր) կտրվեցին երկու տարբեր տեղերում՝ օգտագործելով ստերիլիզացված վիրակապ, և յուրաքանչյուր վերքի մեջ տեղադրվեց մոտավորապես 0.5 գ գաղութացնող թեփի խառնուրդ, որին հաջորդեց բարձր խոնավություն՝ բոլոր պատվաստված բույսերում վարակը և հիվանդության զարգացումը խթանելու համար: Վերահսկիչ բույսերը նմանապես վիրավորվել են, և վերքի մեջ տեղադրվել է հավասար քանակությամբ (0.5 գ) ստերիլ, չգաղութացված թեփի խառնուրդ, որը պահվել է բարձր խոնավության պայմաններում՝ հիվանդության զարգացման համար միջավայրը մոդելավորելու և բուժական խմբերի միջև համապատասխանությունն ապահովելու համար։
Մշակման եղանակը՝ Լոբու սածիլները ջրվել են L-օրնիթինի (250 մգ/լ) 500 մլ ջրային լուծույթով կամ Rizolex-T ֆունգիցիդով (50 մգ/լ)՝ հողը ոռոգելով, այնուհետև մշակումը կրկնվել է երեք անգամ՝ 10 օրվա ընդմիջումով: Պլացեբո-մշակված վերահսկիչ խմբերը ոռոգվել են 500 մլ ստերիլ թորած ջրով: Բոլոր մշակումները կատարվել են ջերմոցային պայմաններում (25 ± 2°C, 75 ± 1% հարաբերական խոնավություն և 8 ժամ լույս/16 ժամ մթություն ֆոտոպերիոդ): Բոլոր ամանները ջրվել են երկշաբաթը մեկ և ամսական մշակվել են հավասարակշռված NPK պարարտանյութով (20-20-20, 3.6% ծծմբով և TE միկրոտարրերով; Zain Seeds, Եգիպտոս)՝ 3-4 գ/լ կոնցենտրացիայով՝ տերևային ցողմամբ՝ համաձայն տվյալ տեսակի համար առաջարկությունների և արտադրողի հրահանգների: Եթե ​​այլ բան նշված չէ, յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակից 72 ժամ հետո (hpt) հավաքվել են լիովին ընդարձակված հասուն տերևներ (վերևից 2-րդ և 3-րդ տերևները), հոմոգենացվել, միավորվել և պահվել -80°C ջերմաստիճանում՝ հետագա վերլուծությունների համար, ներառյալ, բայց չսահմանափակվելով դրանով, օքսիդատիվ սթրեսի ինդիկատորների in situ հիստոքիմիական տեղայնացումը, լիպիդների պերօքսիդացումը, ֆերմենտատիվ և ոչ ֆերմենտատիվ հակաօքսիդանտները և գեների էքսպրեսիան։
Սպիտակ բորբոսի վարակի ինտենսիվությունը գնահատվել է ամեն շաբաթ՝ պատվաստումից 21 օր հետո (dpi)՝ օգտագործելով 1-9 սանդղակ (Լրացուցիչ աղյուսակ S2), որը հիմնված է Թերանի և այլոց կողմից (2006) փոփոխված Պետզոլդտի և Դիքսոնի սանդղակի (1996) վրա: Հակիրճ ասած, լոբու բույսերի ցողուններն ու ճյուղերը հետազոտվել են՝ սկսած պատվաստման կետից՝ միջհանգույցների և հանգույցների երկայնքով վնասվածքների առաջընթացը հետևելու համար: Այնուհետև չափվել է վնասվածքի հեռավորությունը պատվաստման կետից մինչև ցողունի կամ ճյուղի երկայնքով ամենահեռավոր կետը, և վնասվածքի տեղակայման հիման վրա նշանակվել է 1-9 միավոր, որտեղ (1)-ը ցույց է տալիս վարակի կետի մոտ տեսանելի վարակի բացակայություն, իսկ (2-9)-ը՝ վնասվածքի չափի աստիճանական աճ և առաջընթաց հանգույցների/միջհանգույցների երկայնքով (Լրացուցիչ աղյուսակ S2): Այնուհետև սպիտակ բորբոսի վարակի ինտենսիվությունը վերածվել է տոկոսի՝ օգտագործելով բանաձև 2-ը.
Բացի այդ, հիվանդության զարգացման կորի տակ գտնվող մակերեսը (AUDPC) հաշվարկվել է բանաձևով (Shaner and Finney, 1977), որը վերջերս հարմարեցվել է սովորական լոբու սպիտակ փտման համար (Chauhan et al., 2020)՝ օգտագործելով 3-րդ հավասարումը։
Որտեղ Yi = հիվանդության ծանրությունը ti ժամանակի դրությամբ, Yi+1 = հիվանդության ծանրությունը հաջորդ ti ժամանակի դրությամբ, ti = առաջին չափման ժամանակը (օրերով), ti+1 = հաջորդ չափման ժամանակը (օրերով), n = ժամանակային կամ դիտարկման կետերի ընդհանուր քանակը: Լոբու բույսի աճի պարամետրերը, ներառյալ բույսի բարձրությունը (սմ), բույսի ճյուղերի քանակը և բույսի տերևների քանակը, գրանցվել են շաբաթական 21 օրվա ընթացքում բոլոր կենսաբանական կրկնօրինակներում:
Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակման ժամանակ տերևների նմուշները (վերևից երկրորդ և երրորդ լիովին զարգացած տերևները) հավաքվել են մշակումից հետո 45-րդ օրը (վերջին մշակումից 15 օր անց): Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակը բաղկացած էր հինգ ամանից (յուրաքանչյուր ամանում՝ երկու բույս): Մոտ 500 մգ մանրացված հյուսվածք օգտագործվել է ֆոտոսինթետիկ գունանյութերի (քլորոֆիլ a, քլորոֆիլ b և կարոտինոիդներ) արդյունահանման համար՝ օգտագործելով 80% ացետոն 4°C ջերմաստիճանում մթության մեջ: 24 ժամ անց նմուշները ցենտրիֆուգացվել են, և վերին շերտը հավաքվել է քլորոֆիլ a-ի, քլորոֆիլ b-ի և կարոտինոիդների պարունակությունը գունաչափականորեն որոշելու համար՝ օգտագործելով UV-160A սպեկտրոֆոտոմետր (Shimadzu Corporation, Ճապոնիա)՝ համաձայն (Lichtenthaler, 1987) մեթոդի՝ չափելով կլանումը երեք տարբեր ալիքի երկարություններում (A470, A646 և A663 նմ): Վերջապես, ֆոտոսինթետիկ գունանյութերի պարունակությունը հաշվարկվել է Լիխտենտհալերի (1987) կողմից նկարագրված հետևյալ 4-6 բանաձևերի միջոցով:
Մշակումից 72 ժամ անց (hpt), յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակից հավաքվել են տերևներ (վերևից երկրորդ և երրորդ լիովին զարգացած տերևները)՝ ջրածնի պերօքսիդի (H2O2) և սուպերօքսիդ անիոնի (O2•−) in situ հիստոքիմիական տեղայնացման համար: Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակը բաղկացած էր հինգ ամաններից (յուրաքանչյուր ամանում՝ երկու բույս): Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակ վերլուծվել է կրկնօրինակով (երկու տեխնիկական կրկնօրինակ)՝ մեթոդի ճշգրտությունը, հուսալիությունը և վերարտադրելիությունն ապահովելու համար: H2O2-ը և O2•−-ը որոշվել են համապատասխանաբար 0.1% 3,3′-դիամինոբենզիդինի (DAB; Sigma-Aldrich, Դարմշտադտ, Գերմանիա) կամ ազոտային կապույտ տետրազոլիումի (NBT; Sigma-Aldrich, Դարմշտադտ, Գերմանիա) միջոցով՝ հետևելով Ռոմերո-Պուերտասի և այլոց (2004) և Ադամի և այլոց (1989) կողմից նկարագրված մեթոդներին՝ աննշան փոփոխություններով: H2O2-ի հյուսվածաքիմիական տեղայնացման համար տեղում, թերթիկները վակուումային եղանակով ներծծվել են 0.1% DAB-ով 10 մՄ Tris բուֆերում (pH 7.8) և այնուհետև ինկուբացվել են սենյակային ջերմաստիճանում լույսի ներքո 60 րոպե: Տերևիկները սպիտակեցվել են 0.15% (v/v) TCA-ով 4:1 (v/v) էթանոլ:քլորֆորմում (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Կահիրե, Եգիպտոս) և այնուհետև ենթարկվել լույսի ազդեցությանը մինչև մգանալը: Նմանապես, փականները վակուումային եղանակով ներծծվել են 10 մՄ կալիումի ֆոսֆատային բուֆերով (pH 7.8), որը պարունակում է 0.1 w/v % HBT՝ O2•−-ի տեղում հյուսվածաքիմիական տեղայնացման համար: Տերևիկները ինկուբացվել են սենյակային ջերմաստիճանում լույսի ներքո 20 րոպե, այնուհետև սպիտակեցվել են վերը նշվածի պես, ապա լուսավորվել են մինչև մուգ կապույտ/մանուշակագույն բծերի առաջացումը: Արդյունքում ստացված շագանակագույն (որպես H2O2 ինդիկատոր) կամ կապտամանուշակագույն (որպես O2•− ինդիկատոր) գույնի ինտենսիվությունը գնահատվել է ImageJ պատկերի մշակման փաթեթի Ֆիջի տարբերակի միջոցով (http://fiji.sc; մուտք գործվել է 2024 թվականի մարտի 7-ին):
Մալոնդիալդեհիդը (MDA; որպես լիպիդների պերօքսիդացման մարկեր) որոշվել է Դյուի և Բրամլեջի (1992) մեթոդով՝ աննշան փոփոխություններով: Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակից (վերևից երկրորդ և երրորդ լիովին զարգացած տերևներ) տերևները հավաքվել են մշակումից 72 ժամ անց (hpt): Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակը ներառում էր հինգ աման (յուրաքանչյուր ամանում երկու բույս): Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակ վերլուծվել է կրկնօրինակով (երկու տեխնիկական կրկնօրինակ)՝ մեթոդի ճշգրտությունը, հուսալիությունը և վերարտադրելիությունն ապահովելու համար: Հակիրճ ասած, MDA-ի արդյունահանման համար օգտագործվել է 0.5 գ աղացած տերևի հյուսվածք՝ 20% եռաքաղցաթթվով (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) պարունակող, որը պարունակում է 0.01% բուտիլացված հիդրօքսիտոլուոլ (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA): Այնուհետև վերին շերտում MDA պարունակությունը որոշվել է գունաչափական եղանակով՝ չափելով կլանումը 532 և 600 նմ-ում՝ օգտագործելով UV-160A սպեկտրոֆոտոմետր (Shimadzu Corporation, Ճապոնիա) և արտահայտվել է նմոլ գ−1 FW-ով։
Ոչ ֆերմենտային և ֆերմենտային հակաօքսիդանտների գնահատման համար, յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակից 72 ժամ հետո (hpt) հավաքվել են տերևներ (վերևից երկրորդ և երրորդ լիովին զարգացած տերևները): Յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակը բաղկացած էր հինգ ամաններից (յուրաքանչյուր ամանում՝ երկու բույս): Յուրաքանչյուր կենսաբանական նմուշ վերլուծվել է կրկնօրինակով (երկու տեխնիկական նմուշ): Երկու տերև մանրացվել է հեղուկ ազոտով և օգտագործվել անմիջապես ֆերմենտային և ոչ ֆերմենտային հակաօքսիդանտների, ընդհանուր ամինաթթուների, պրոլինի պարունակության, գեների արտահայտման և օքսալատի քանակական որոշման համար:
Լուծվող ֆենոլների ընդհանուր քանակը որոշվել է Ֆոլին-Չիոկալտեուի ռեակտիվի (Sigma-Aldrich, Սենթ Լուիս, Միսսուրի, ԱՄՆ) միջոցով՝ Կահկոնենի և այլոց (1999) կողմից նկարագրված մեթոդի աննշան փոփոխություններով: Հակիրճ ասած, մոտավորապես 0.1 գ համասեռ տերևի հյուսվածքը արդյունահանվել է 20 մլ 80% մեթանոլով մթության մեջ 24 ժամ, և վերին շերտը հավաքվել է ցենտրիֆուգացումից հետո: Նմուշի քաղվածքի 0.1 մլ-ը խառնվել է 0.5 մլ Ֆոլին-Չիոկալտեուի ռեակտիվի (10%) հետ, թափահարվել է 30 վայրկյան և թողնվել մթության մեջ 5 րոպե: Այնուհետև յուրաքանչյուր խողովակին ավելացվել է 0.5 մլ 20% նատրիումի կարբոնատի լուծույթ (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Կահիրե, Եգիպտոս), լավ խառնվել և ինկուբացվել է սենյակային ջերմաստիճանում մթության մեջ 1 ժամ: Ինկուբացիայից հետո ռեակցիայի խառնուրդի կլանումը չափվել է 765 նմ-ում՝ օգտագործելով UV-160A սպեկտրոֆոտոմետր (Shimadzu Corporation, Ճապոնիա): Նմուշի քաղվածքներում ընդհանուր լուծվող ֆենոլների կոնցենտրացիան որոշվել է գալաթթվի տրամաչափման կորի միջոցով (Fisher Scientific, Հեմփթոն, Նյու Հեմփշիր, ԱՄՆ) և արտահայտվել է գալաթթվի համարժեքի միլիգրամներով մեկ գրամի թարմ քաշի համար (մգ GAE գ-1 թարմ քաշ):
Լուծվող ֆլավոնոիդների ընդհանուր պարունակությունը որոշվել է Ջերիդանեի և այլոց (2006) մեթոդով՝ աննշան փոփոխություններով: Հակիրճ ասած, վերը նշված մեթանոլի քաղվածքի 0.3 մլ-ը խառնվել է 0.3 մլ 5% ալյումինի քլորիդի լուծույթի հետ (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, ԱՄՆ), եռանդուն խառնվել է, ապա ինկուբացվել է սենյակային ջերմաստիճանում 5 րոպե, որին հաջորդել է 0.3 մլ 10% կալիումի ացետատի լուծույթի (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Կահիրե, Եգիպտոս) ավելացումը, մանրակրկիտ խառնվել և ինկուբացվել սենյակային ջերմաստիճանում 30 րոպե մթության մեջ: Ինկուբացիայից հետո ռեակցիայի խառնուրդի կլանումը չափվել է 430 նմ-ում՝ օգտագործելով UV-160A սպեկտրոֆոտոմետր (Shimadzu Corporation, Ճապոնիա): Նմուշային քաղվածքներում լուծվող ֆլավոնոիդների ընդհանուր կոնցենտրացիան որոշվել է ռուտինի տրամաչափման կորի միջոցով (TCI America, Portland, OR, ԱՄՆ) և այնուհետև արտահայտվել է ռուտինի համարժեքի միլիգրամներով՝ թարմ քաշի մեկ գրամի համար (մգ RE գ-1 թարմ քաշ):
Լոբու տերևների ընդհանուր ազատ ամինաթթուների պարունակությունը որոշվել է Յոկոյամայի և Հիրամացուի (2003) առաջարկած և Սանի և այլոց (2006) կողմից փոփոխված մեթոդի հիման վրա մոդիֆիկացված նինհիդրինային ռեակտիվի միջոցով (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA): Հակիրճ ասած, 0.1 գ մանրացված հյուսվածքը արդյունահանվել է pH 5.4 բուֆերով, և վերին շերտի 200 մկլ-ը ռեակցիայի մեջ է մտցվել 200 մկլ նինհիդրինի (2%) և 200 մկլ պիրիդինի (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) հետ, ինկուբացվել է եռացող ջրային լոգարանում 30 րոպե, այնուհետև սառեցվել և չափվել է 580 նմ-ում՝ օգտագործելով UV-160A սպեկտրոֆոտոմետր (Shimadzu Corporation, Japan): Մյուս կողմից, պրոլինը որոշվել է Բեյթսի մեթոդով (Bates et al., 1973): Պրոլինը արդյունահանվել է 3% սուլֆոսալիցիլաթթվով (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ԱՄՆ) և ցենտրիֆուգացումից հետո վերին շերտի 0.5 մլ-ը խառնվել է 1 մլ սառցադաշտային քացախաթթվի (Fisher Scientific, Hampton, NH, ԱՄՆ) և նինհիդրինի ռեակտիվի հետ, ինկուբացվել է 90°C ջերմաստիճանում 45 րոպե, սառեցվել և չափվել է 520 նմ-ում՝ օգտագործելով վերը նշված նույն սպեկտրոֆոտոմետրը: Տերևների արդյունահանումներում ազատ ամինաթթուների և պրոլինի ընդհանուր քանակը որոշվել է համապատասխանաբար գլիցինի և պրոլինի տրամաչափման կորերի միջոցով (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ԱՄՆ) և արտահայտվել է մգ/գ թարմ քաշով:
Հակաօքսիդանտ ֆերմենտների ֆերմենտային ակտիվությունը որոշելու համար մոտավորապես 500 մգ համասեռացված հյուսվածք էքստրակցվել 3 մլ 50 մՄ Tris բուֆերով (pH 7.8), որը պարունակում էր 1 մՄ EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Սենթ Լուիս, Միսսուրի, ԱՄՆ) և 7.5% պոլիվինիլպիրոլիդոն (PVP; Sigma-Aldrich, Սենթ Լուիս, Միսսուրի, ԱՄՆ), ցենտրիֆուգացվել է 10,000 × g ջերմաստիճանում 20 րոպե սառնարանային պայմաններում (4°C), և հավաքվել է վերին շերտը (հում ֆերմենտային քաղվածք) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023): Այնուհետև կատալազը (CAT) ռեակցիայի մեջ է մտցվել 2 մլ 0.1 Մ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆերի (pH 6.5; Sigma-Aldrich, Սենթ Լուիս, Միսսուրի, ԱՄՆ) և 100 մկլ 269 մՄ H2O2 լուծույթի հետ՝ դրա ֆերմենտային ակտիվությունը որոշելու համար՝ համաձայն Աեբիի (1984) մեթոդի՝ աննշան փոփոխություններով (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023): Գուայակոլ-կախյալ պերօքսիդազի (POX) ֆերմենտային ակտիվությունը որոշվել է Հարախի և այլոց (2009) մեթոդով: (2008)՝ աննշան փոփոխություններով (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023), և պոլիֆենոլ օքսիդազի (PPO) ֆերմենտային ակտիվությունը որոշվել է 2.2 մլ 100 մՄ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆերի (pH 6.0), 100 մկլ գուայակոլի (TCI chemicals, Portland, OR, USA) և 100 մկլ 12 մՄ H2O2-ի հետ ռեակցիայից հետո: Մեթոդը փոքր-ինչ փոփոխվել է (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023): Փորձարկումը կատարվել է 0.1 Մ ֆոսֆատային բուֆերում (pH 6.0) թարմ պատրաստված 3 մլ կատեխոլի լուծույթի (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 Մ) հետ ռեակցիայից հետո: CAT ակտիվությունը չափվել է H2O2-ի քայքայման մոնիթորինգով՝ 240 նմ-ում (A240), POX ակտիվությունը չափվել է կլանման աճի մոնիթորինգով՝ 436 նմ-ում (A436), իսկ PPO ակտիվությունը չափվել է UV-160A սպեկտրոֆոտոմետրով (Շիմադզու, Ճապոնիա) յուրաքանչյուր 30 վայրկյանը մեկ 495 նմ-ում (A495) կլանման տատանումները գրանցելով։
Վերջին մշակումից 72 ժամ անց լոբու տերևներում (վերևից երկրորդ և երրորդ լիովին զարգացած տերևները) հակաօքսիդանտային երեք գեների տրանսկրիպտ մակարդակները հայտնաբերելու համար օգտագործվել է իրական ժամանակի RT-PCR մեթոդը, որը կիրառվել է վերջին մշակումից 72 ժամ անց՝ լոբու տերևներում (վերևից երկրորդ և երրորդ լիովին զարգացած տերևները) երեք հակաօքսիդանտային գեների տրանսկրիպտ մակարդակները հայտնաբերելու համար (օրինակ՝ վերևից երկրորդ և երրորդ լիարժեք զարգացած տերևները): Հակիրճ ասած, ՌՆԹ-ն մեկուսացվել է Simply P Total RNA Extraction Kit-ի միջոցով (կատալոգի համար՝ BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Չինաստան): Այնուհետև, արտադրողի հրահանգներին համապատասխան, կԴՆԹ-ն սինթեզվել է TOP script™ cDNA Synthesis Kit-ի միջոցով: Վերոնշյալ երեք գեների պրայմերների հաջորդականությունները ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ S3-ում: Որպես տնային տնտեսության գեն օգտագործվել է PvActin-3-ը (GenBank մուտքագրման համարը՝ XM_068616709.1), և գենի հարաբերական արտահայտությունը հաշվարկվել է 2-ΔΔCT մեթոդով (Livak and Schmittgen, 2001): Ցուցադրվել է ակտինի կայունությունը կենսաբանական սթրեսի (սովորական լոբազգիների և անտրակնոզ սնկի՝ Colletotrichum lindemuthianum-ի միջև անհամատեղելի փոխազդեցություն) և աբիոտիկ սթրեսի (երաշտ, աղիություն, ցածր ջերմաստիճան) պայմաններում (Borges et al., 2012):
Սկզբում մենք իրականացրեցինք S. sclerotiorum-ի օքսալոացետատ ացետիլհիդրոլազի (OAH) սպիտակուցների գենոմի լայնածավալ in silico վերլուծություն՝ օգտագործելով սպիտակուց-սպիտակուց BLAST գործիքը (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005): Հակիրճ ասած, մենք օգտագործեցինք Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank accession number XP_040799428.1; 342 ամինաթթուներ) և Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank accession number XP_056833920.1; 316 ամինաթթուներ) OAH-ը որպես հարցման հաջորդականություններ՝ S. sclerotiorum-ի (taxide: 5180) հոմոլոգ սպիտակուցը քարտեզագրելու համար: BLASTp-ն իրականացվել է S. sclerotiorum-ի ամենավերջին հասանելի գենոմային տվյալների նկատմամբ՝ Ազգային կենսատեխնոլոգիական տեղեկատվության կենտրոնի (NCBI) կայքում՝ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/, GenBank-ում:
Բացի այդ, S. sclerotiorum-ից կանխատեսված OAH գենը (SsOAH) և A. fijiensis CBS 313.89-ից AfOAH-ի և P. lagena-ից PlOAH-ի էվոլյուցիոն վերլուծությունը և ֆիլոգենետիկ ծառը եզրակացվել են MEGA11-ում առավելագույն հավանականության մեթոդի (Tamura et al., 2021) և JTT մատրիցային մոդելի (Jones et al., 1992) միջոցով: Ֆիլոգենետիկ ծառը համակցվել է S. sclerotiorum-ից բոլոր կանխատեսված OAH գեների (SsOAH) սպիտակուցային հաջորդականությունների բազմակի դասավորվածության վերլուծության և հարցման հաջորդականության հետ՝ օգտագործելով Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007): Բացի այդ, S. sclerotiorum-ից ստացված SsOAH-ի լավագույնս համապատասխանող ամինաթթվային հաջորդականությունները համապատասխանեցվել են հարցման հաջորդականություններին (AfOAH և PlOAH) (Larkin et al., 2007)՝ օգտագործելով ClustalW-ն (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), իսկ համապատասխանության մեջ պահպանված շրջանները վիզուալիզացվել են ESPript գործիքի միջոցով (տարբերակ 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php):
Ավելին, S. sclerotiorum SsOAH-ի կանխատեսված ֆունկցիոնալ ներկայացուցչական տիրույթները և պահպանված տեղամասերը ինտերակտիվ կերպով դասակարգվել են տարբեր ընտանիքների՝ օգտագործելով InterPro գործիքը (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021): Վերջապես, կանխատեսված S. sclerotiorum SsOAH-ի եռաչափ (3D) կառուցվածքային մոդելավորումը կատարվել է Protein Homology/Analogy Recognition Engine-ի միջոցով (Phyre2 սերվերի 2.0 տարբերակ; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) և վավերացվել է SWISS-MODEL սերվերի միջոցով (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014): Կանխատեսված եռաչափ կառուցվածքները (PDB ձևաչափ) ինտերակտիվ կերպով վիզուալիզացվել են UCSF-Chimera փաթեթի միջոցով (տարբերակ 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004):
Քանակական իրական ժամանակի ֆլուորեսցենտ ՊՇՌ-ն օգտագործվել է Sclerotinia sclerotiorum-ի միցելիում օքսալոացետատ ացետիլհիդրոլազի (SsOAH; GenBank մուտքագրման համար՝ XM_001590428.1) տրանսկրիպցիոն մակարդակը որոշելու համար: Հակիրճ ասած, S. sclerotiorum-ը ներարկվել է PDB պարունակող սրվակի մեջ և տեղադրվել է թափահարվող ինկուբատորում (մոդել՝ I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 25 ± 2 °C ջերմաստիճանում 24 ժամ, 150 պտ/րոպե արագությամբ և մշտական ​​մթության մեջ (24 ժամ)՝ միցելիումի աճը խթանելու համար: Այնուհետև բջիջները մշակվել են L-օրնիտինով և Rizolex-T ֆունգիցիդով՝ վերջնական IC50 կոնցենտրացիաներով (համապատասխանաբար մոտավորապես 40 և 3.2 մգ/լ), ապա կուլտիվացվել են ևս 24 ժամ նույն պայմաններում: Ինկուբացիայից հետո կուլտուրաները ցենտրիֆուգացվել են 2500 պտ/րոպե արագությամբ 5 րոպե, և վերին շերտը (սնկային միցելիում) հավաքվել է գեների արտահայտման վերլուծության համար: Նմանապես, սնկային միցելիումը հավաքվել է վարակվելուց 0, 24, 48, 72, 96 և 120 ժամ անց վարակված բույսերից, որոնք վարակված հյուսվածքների մակերեսին առաջացրել էին սպիտակ բորբոս և բամբակյա միցելիում: ՌՆԹ-ն արդյունահանվել է սնկային միցելիումից, ապա կԴՆԹ-ն սինթեզվել է վերը նկարագրվածի պես: SsOAH-ի պրայմերների հաջորդականությունները ներկայացված են լրացուցիչ աղյուսակ S3-ում: SsActin-ը (GenBank մուտքագրման համար՝ XM_001589919.1) օգտագործվել է որպես տնային տնտեսության գեն, և գեների հարաբերական արտահայտությունը հաշվարկվել է 2-ΔΔCT մեթոդով (Livak and Schmittgen, 2001):
Թթվային թթուն որոշվել է կարտոֆիլի դեքստրոզային արգանակում (PDB) և բույսերի նմուշներում, որոնք պարունակում էին Sclerotinia sclerotiorum սնկային պաթոգեն՝ համաձայն Շյուի և Չժանի (2000) մեթոդի՝ աննշան փոփոխություններով: Հակիրճ ասած, S. sclerotiorum իզոլյատները ներարկվել են PDB պարունակող սրվակների մեջ, ապա կուլտիվացվել են թափահարվող ինկուբատորում (մոդել I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 150 պտ/րոպե արագությամբ 25 ± 2 °C ջերմաստիճանում 3-5 օրվա ընթացքում մշտական ​​մթության մեջ (24 ժամ)՝ միցելիումի աճը խթանելու համար: Ինկուբացիայից հետո սնկային մշակույթը նախ զտվել է Whatman #1 ֆիլտրի թղթի միջով, ապա ցենտրիֆուգացվել է 2500 պտ/րոպե արագությամբ 5 րոպե՝ մնացորդային միցելիումը հեռացնելու համար: Վերին շերտը հավաքվել և պահվել է 4°C ջերմաստիճանում՝ օքսալատի հետագա քանակական որոշման համար: Բույսերի նմուշների պատրաստման համար մոտավորապես 0.1 գ բուսական հյուսվածքի բեկորներ արդյունահանվել են երեք անգամ թորած ջրով (յուրաքանչյուր անգամ 2 մլ): Այնուհետև նմուշները ցենտրիֆուգացվել են 2500 պտ/րոպե արագությամբ 5 րոպե, վերին շերտը չոր ֆիլտրացվել է Whatman No. 1 ֆիլտրի թղթի միջով և հավաքագրվել հետագա վերլուծության համար։
Թրթնջուկային թթվի քանակական վերլուծության համար ռեակցիայի խառնուրդը պատրաստվել է ապակե խցանով խողովակի մեջ հետևյալ հերթականությամբ՝ 0.2 մլ նմուշ (կամ PDB կուլտուրայի ֆիլտրատ կամ թրթնջուկային թթվի ստանդարտ լուծույթ), 0.11 մլ բրոմֆենոլ կապույտ (BPB, 1 մՄ; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, ԱՄՆ), 0.198 մլ 1 Մ ծծմբական թթու (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Կահիրե, Եգիպտոս) և 0.176 մլ 100 մՄ կալիումի դիքրոմատ (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, ԱՄՆ), ապա լուծույթը նոսրացվել է մինչև 4.8 մլ թորած ջրով, եռանդուն խառնվել և անմիջապես տեղադրվել է 60°C ջրային բաղնիքի մեջ: 10 րոպե անց ռեակցիան դադարեցվել է՝ ավելացնելով 0.5 մլ նատրիումի հիդրօքսիդի լուծույթ (NaOH; 0.75 Մ): Ռեակցիայի խառնուրդի կլանումը (A600) չափվել է 600 նմ-ում՝ օգտագործելով UV-160 սպեկտրոֆոտոմետր (Shimadzu Corporation, Ճապոնիա): PDB-ն և թորած ջուրը օգտագործվել են որպես համապատասխանաբար կուլտուրայի ֆիլտրատների և բույսերի նմուշների քանակական որոշման վերահսկիչներ: Կուլտուրայի ֆիլտրատներում թրթնջուկային թթվի կոնցենտրացիաները, որոնք արտահայտված են թրթնջուկային թթվի միկրոգրամներով PDB միջավայրի մեկ միլիլիտրում (μg.mL−1), և տերևի քաղվածքներում, որոնք արտահայտված են թրթնջուկային թթվի մեկ գրամ թարմ քաշի մեկ միկրոգրամով (μg.g−1 FW), որոշվել են թրթնջուկային թթվի տրամաչափման կորի միջոցով (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Ուոլթհեմ, Մասաչուսեթս, ԱՄՆ):
Ուսումնասիրության ողջ ընթացքում բոլոր փորձերը նախագծվել են լիովին պատահականացված նախագծով (CRD)՝ յուրաքանչյուր մշակման համար վեց կենսաբանական կրկնօրինակով և յուրաքանչյուր կենսաբանական կրկնօրինակի համար հինգ ամանով (յուրաքանչյուր ամանի համար երկու բույս), եթե այլ բան նշված չէ: Կենսաբանական կրկնօրինակները վերլուծվել են կրկնօրինակով (երկու տեխնիկական կրկնօրինակ): Տեխնիկական կրկնօրինակները օգտագործվել են նույն փորձի վերարտադրելիությունը ստուգելու համար, բայց չեն օգտագործվել վիճակագրական վերլուծության մեջ՝ կեղծ կրկնօրինակներից խուսափելու համար: Տվյալները վիճակագրորեն վերլուծվել են դիսպերսիայի վերլուծության (ANOVA) միջոցով, որին հաջորդել է Թյուքի-Կրամերի անկեղծորեն նշանակալի տարբերության (HSD) թեստը (p ≤ 0.05): In vitro փորձերի համար IC50 և IC99 արժեքները հաշվարկվել են պրոբիտ մոդելի միջոցով և հաշվարկվել են 95% վստահության միջակայքերը:
Եգիպտոսի Էլ Ղաբիա նահանգի տարբեր սոյայի դաշտերից հավաքվել է ընդհանուր առմամբ չորս իզոլյատ։ PDA միջավայրի վրա բոլոր իզոլյատները առաջացրել են կրեմագույն սպիտակ միցելիում, որը արագորեն դարձել է բամբակի նման սպիտակ (Նկար 1Ա), ապա բեժ կամ շագանակագույն՝ սկլերոցիումի փուլում։ Սկլերոտիաները սովորաբար խիտ, սև, գնդաձև կամ անկանոն ձևի են, 5.2-ից 7.7 մմ երկարությամբ և 3.4-ից 5.3 մմ տրամագծով (Նկար 1Բ)։ Չնայած չորս իզոլյատների մոտ 25 ± 2 °C ջերմաստիճանում 10-12 օրվա ինկուբացիայից հետո մշակութային միջավայրի եզրին զարգացվել է սկլերոտիաների սահմանային պատկեր (Նկար 1Ա), սկլերոտիաների քանակը մեկ ափսեի մեջ զգալիորեն տարբեր էր դրանց միջև (P < 0.001), որտեղ իզոլյատ 3-ն ուներ սկլերոտիաների ամենամեծ քանակը (32.33 ± 1.53 սկլերոտիա մեկ ափսեի մեջ, Նկ. 1Գ)։ Նմանապես, #3 մեկուսացված նյութը PDB-ում արտադրել է ավելի շատ թրթնջկաթթու, քան մյուս մեկուսացված նյութերը (3.33 ± 0.49 մկգ.մլ−1; Նկ. 1D): #3 մեկուսացված նյութը ցույց է տվել ֆիտոպաթոգեն Sclerotinia sclerotiorum սնկի բնորոշ ձևաբանական և մանրադիտակային բնութագրերը: Օրինակ, PDA-ի վրա #3 մեկուսացված նյութի գաղութները արագ աճել են, կրեմագույն սպիտակ են (Նկար 1A), հակադարձ բեժ կամ բաց սաղմոնի գույնի դեղնա-շագանակագույն, և պահանջվել է 6-7 օր 25 ± 2°C ջերմաստիճանում՝ 9 սմ տրամագծով թիթեղի մակերեսը ամբողջությամբ ծածկելու համար: Վերոնշյալ ձևաբանական և մանրադիտակային բնութագրերի հիման վրա #3 մեկուսացված նյութը նույնականացվել է որպես Sclerotinia sclerotiorum:
Նկար 1. Սովորական լոբազգի մշակաբույսերից ստացված S. sclerotiorum իզոլյատների բնութագրերը և պաթոգենությունը: (A) S. sclerotiorum չորս իզոլյատների միցելիալ աճը PDA միջավայրում, (B) S. sclerotiorum չորս իզոլյատների սկլերոտիաները, (C) սկլերոտիաների քանակը (յուրաքանչյուր թիթեղի համար), (D) թրթնջկաթթվի սեկրեցիան PDB միջավայրում (μg.mL−1) և (E) S. sclerotiorum չորս իզոլյատների հիվանդության ծանրությունը (%) ջերմոցային պայմաններում զգայուն առևտրային լոբազգիների Giza 3 տեսակի վրա: Արժեքները ներկայացնում են հինգ կենսաբանական կրկնօրինակների միջին ± ստանդարտ շեղումը (n = 5): Տարբեր տառերը ցույց են տալիս վիճակագրորեն նշանակալի տարբերություններ բուժումների միջև (p < 0.05): (F–H) Սպիտակ բորբոսի բնորոշ ախտանիշները հայտնվել են համապատասխանաբար վերգետնյա ցողունների և սիլիկոնների վրա՝ #3 իզոլյատով պատվաստումից 10 օր անց (dpi): (I) S. sclerotiorum #3 իզոլյատ-ի ներքին տրանսկրիպցիայի ենթարկված միջադիրի (ITS) շրջանի էվոլյուցիոն վերլուծությունը կատարվել է առավելագույն հավանականության մեթոդով և համեմատվել է Կենսատեխնոլոգիական տեղեկատվության ազգային կենտրոնի (NCBI) տվյալների բազայից (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ստացված 20 հղման իզոլյատների/շտամների հետ։ Կլաստերացման գծերի վերևում նշված թվերը ցույց են տալիս շրջանի ծածկույթը (%), իսկ կլաստերացման գծերի տակ նշված թվերը՝ ճյուղի երկարությունը։
Ավելին, պաթոգենությունը հաստատելու համար, ստացված S. sclerotiorum-ի չորս իզոլյատներ օգտագործվել են ջերմոցային պայմաններում Giza 3 առևտրային լոբու զգայուն տեսակը ցանելու համար, ինչը համապատասխանում է Կոխի դրույթներին (Նկար 1E): Չնայած ստացված բոլոր սնկային իզոլյատները պաթոգեն էին և կարող էին վարակել կանաչ լոբին (cv. Giza 3), առաջացնելով սպիտակ բորբոսի բնորոշ ախտանիշներ բոլոր վերգետնյա մասերում (Նկար 1F), հատկապես ցողունների (Նկար 1G) և պատիճների (Նկար 1H) վրա ցանելուց 10 օր անց (dpi), իզոլյատ 3-ը ամենաագրեսիվ իզոլյատն էր երկու անկախ փորձերում: Իզոլյատ 3-ը հիվանդության ամենաբարձր ծանրությունն (%) ուներ լոբու բույսերի վրա (համապատասխանաբար՝ 24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 և 76.7 ± 3.1՝ վարակվելուց 7, 14 և 21 օր անց, նկար 1F):
Առավել ինվազիվ S. sclerotiorum #3 իզոլյատի նույնականացումը հետագայում հաստատվեց ներքին տրանսկրիպցիայի միջոցով (ITS) հաջորդականության միջոցով (Նկար 1I): 3 իզոլյատի և 20 հղման իզոլյատների/շտամների միջև ֆիլոգենետիկ վերլուծությունը ցույց տվեց դրանց միջև բարձր նմանություն (>99%): Հարկ է նշել, որ S. sclerotiorum #3 իզոլյատը (533 զույգ հիմք) մեծ նմանություն ունի չոր ոլոռի սերմերից իզոլացված ամերիկյան S. sclerotiorum իզոլյատ LPM36-ի (GenBank մուտքի համար MK896659.1; 540 զույգ հիմք) և չինական S. sclerotiorum իզոլյատ YKY211-ի (GenBank մուտքի համար OR206374.1; 548 զույգ հիմք) հետ, որն առաջացնում է մանուշակագույն (Matthiola incana) ցողունային փտում, որոնցից բոլորն էլ առանձին խմբավորված են դենդրոգրամի վերևում (Նկար 1I): Նոր հաջորդականությունը տեղադրվել է NCBI տվյալների բազայում և անվանվել է «Sclerotinia sclerotiorum – իզոլյատ YN-25» (GenBank մուտքագրման համարը՝ PV202792): Կարելի է տեսնել, որ իզոլյատ 3-ը ամենաինվազիվ իզոլյատն է. հետևաբար, այս իզոլյատը ընտրվել է բոլոր հետագա փորձերի ուսումնասիրության համար:
Դիամին L-օրնիթինի (Sigma-Aldrich, Դարմշտադտ, Գերմանիա) հակաբակտերիալ ակտիվությունը տարբեր կոնցենտրացիաներում (12.5, 25, 50, 75, 100 և 125 մգ/լ) S. sclerotiorum իզոլյատ 3-ի դեմ ուսումնասիրվել է in vitro պայմաններում: Հատկանշական է, որ L-օրնիթինը ցուցաբերել է հակաբակտերիալ ազդեցություն և աստիճանաբար արգելակել է S. sclerotiorum հիֆերի ճառագայթային աճը՝ դեղաչափից կախված եղանակով (Նկար 2A, B): Փորձարկված ամենաբարձր կոնցենտրացիայի դեպքում (125 մգ/լ) L-օրնիթինը ցուցաբերել է միցելիումի աճի արգելակման ամենաբարձր մակարդակը (99.62 ± 0.27%; Նկար 2B), որը համարժեք էր առևտրային ֆունգիցիդ Rizolex-T-ին (արգելակման մակարդակը՝ 99.45 ± 0.39%; Նկար 2C) փորձարկված ամենաբարձր կոնցենտրացիայի դեպքում (10 մգ/լ), ինչը վկայում է նմանատիպ արդյունավետության մասին:
Նկար 2. L-օրնիթինի in vitro հակաբակտերիալ ակտիվությունը Sclerotinia sclerotiorum-ի դեմ: (A) L-օրնիթինի տարբեր կոնցենտրացիաների հակաբակտերիալ ակտիվության համեմատություն S. sclerotiorum-ի դեմ՝ առևտրային ֆունգիցիդ Rizolex-T-ի (10 մգ/լ) հետ: (B, C) S. sclerotiorum-ի միցելիումի աճի արգելակման մակարդակը (%)՝ համապատասխանաբար L-օրնիթինի տարբեր կոնցենտրացիաներով (12.5, 25, 50, 75, 100 և 125 մգ/լ) կամ Rizolex-T-ի (2, 4, 6, 8 և 10 մգ/լ) մշակումից հետո: Արժեքները ներկայացնում են հինգ կենսաբանական կրկնօրինակների միջին ± ստանդարտ շեղումը (n = 5): Տարբեր տառերը նշանակում են մշակումների միջև վիճակագրական տարբերությունները (p < 0.05): (D, E) L-օրնիթինի և առևտրային ֆունգիցիդ Rizolex-T-ի Probit մոդելի ռեգրեսիոն վերլուծություն, համապատասխանաբար: Պրոբիտ մոդելի ռեգրեսիոն գիծը ցույց է տրված որպես կապույտ ամբողջական գիծ, ​​իսկ վստահության միջակայքը (95%)՝ որպես կարմիր ընդհատ գիծ։
Բացի այդ, իրականացվել է պրոբիտային ռեգրեսիոն վերլուծություն, և համապատասխան գրաֆիկները ներկայացված են աղյուսակ 1-ում և նկարներ 2D,E-ում: Հակիրճ ասած, L-օրնիթինի ընդունելի թեքության արժեքը (y = 2.92x − 4.67) և դրան կից նշանակալի վիճակագրությունը (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 և p < 0.0001; նկար 2D) ցույց են տվել S. sclerotiorum-ի դեմ հակասնկային ակտիվության բարձրացում՝ համեմատած առևտրային ֆունգիցիդ Rizolex-T-ի հետ (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 և p < 0.0001) (աղյուսակ 1):
Աղյուսակ 1. S. sclerotiorum-ի դեմ L-օրնիթինի և առևտրային ֆունգիցիդ «Ռիզոլեքս-T»-ի կիսաառավելագույն արգելակող կոնցենտրացիայի (IC50) և IC99 (մգ/լ) արժեքները:
Ընդհանուր առմամբ, L-օրնիթինը (250 մգ/լ) զգալիորեն նվազեցրել է սպիտակ բորբոսի զարգացումը և ծանրությունը մշակված սովորական լոբու բույսերի վրա՝ համեմատած չմշակված S. sclerotiorum-ով վարակված բույսերի հետ (վերահսկիչ խումբ, նկար 3Ա): Հակիրճ ասած, չնայած չմշակված վարակված վերահսկիչ բույսերի հիվանդության ծանրությունը աստիճանաբար աճել է (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 և 92.33 ± 3.06%), L-օրնիթինը զգալիորեն նվազեցրել է հիվանդության ծանրությունը (%) ողջ փորձի ընթացքում (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00 և 26.36 ± 3.07) համապատասխանաբար մշակումից 7, 14 և 21 օր հետո (dpt) (Նկար 3Ա): Նմանապես, երբ S. sclerotiorum-ով վարակված լոբու բույսերը մշակվեցին 250 մգ/լ L-օրնիտինով, հիվանդության զարգացման կորի տակ գտնվող մակերեսը (AUDPC) չմշակված վերահսկիչ խմբի 1274.33 ± 33.13-ից նվազեց մինչև 281.03 ± 7.95, որը մի փոքր ցածր էր, քան դրական վերահսկիչ 50 մգ/լ Rizolex-T ֆունգիցիդի (183.61 ± 7.71; Նկ. 3Բ) ցուցանիշը: Նույն միտումը դիտվեց նաև երկրորդ փորձի ժամանակ:
Նկ. 3. L-օրնիթինի էկզոգեն կիրառման ազդեցությունը սովորական լոբու սպիտակ փտման զարգացման վրա, որն առաջացել է Sclerotinia sclerotiorum-ի կողմից ջերմոցային պայմաններում: (A) Սովորական լոբու սպիտակ բորբոսի հիվանդության զարգացման կորը 250 մգ/լ L-օրնիթինի կիրառումից հետո: (B) Սովորական լոբու սպիտակ բորբոսի հիվանդության զարգացման կորի տակ գտնվող մակերեսը (AUDPC) L-օրնիթինի կիրառումից հետո: Արժեքները ներկայացնում են հինգ կենսաբանական կրկնօրինակների (n = 5) միջին ± ստանդարտ շեղումը: Տարբեր տառերը նշանակում են բուժումների միջև վիճակագրորեն նշանակալի տարբերություններ (p < 0.05):
250 մգ/լ L-օրնիթինի էկզոգեն կիրառումը 42 օր անց աստիճանաբար մեծացրեց բույսի բարձրությունը (Նկար 4Ա), ճյուղերի քանակը մեկ բույսի վրա (Նկար 4Բ) և տերևների քանակը մեկ բույսի վրա (Նկար 4Գ): Մինչդեռ առևտրային ֆունգիցիդ Rizolex-T-ն (50 մգ/Լ) ամենամեծ ազդեցությունն ունեցավ ուսումնասիրված բոլոր սննդային պարամետրերի վրա, 250 մգ/լ L-օրնիթինի էկզոգեն կիրառումը երկրորդ ամենամեծ ազդեցությունն ունեցավ չմշակված վերահսկիչ խմբի համեմատ (Նկար 4Ա-Գ): Մյուս կողմից, L-օրնիթինի կիրառումը էական ազդեցություն չունեցավ ֆոտոսինթետիկ գունանյութերի՝ քլորոֆիլ a-ի (Նկար 4Դ) և քլորոֆիլ b-ի (Նկար 4Ե) պարունակության վրա, բայց փոքր-ինչ մեծացրեց կարոտինոիդների ընդհանուր պարունակությունը (0.56 ± 0.03 մգ/գ քաշային հարաբերակցությամբ)՝ համեմատած բացասական վերահսկիչ խմբի (0.44 ± 0.02 մգ/գ քաշային հարաբերակցությամբ) և դրական վերահսկիչ խմբի (0.46 ± 0.02 մգ/գ քաշային հարաբերակցությամբ, Նկար 4Զ) համեմատ: Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ L-օրնիթինը ֆիտոտոքսիկ չէ մշակված լոբազգիների համար և նույնիսկ կարող է խթանել դրանց աճը։
Նկ. 4. Արտաքին L-օրնիթինի կիրառման ազդեցությունը Sclerotinia sclerotiorum-ով վարակված լոբու տերևների աճի բնութագրերի և ֆոտոսինթետիկ գունանյութերի վրա ջերմոցային պայմաններում: (A) Բույսի բարձրությունը (սմ), (B) Բույսի ճյուղերի քանակը, (C) Բույսի տերևների քանակը, (D) Քլորոֆիլի a պարունակությունը (մգ գ-1 ֆր քաշ), (E) Քլորոֆիլի b պարունակությունը (մգ գ-1 ֆր քաշ), (F) Կարոտինոիդների ընդհանուր պարունակությունը (մգ գ-1 ֆր քաշ): Արժեքները հինգ կենսաբանական կրկնօրինակների (n = 5) միջին ± ստանդարտ շեղումն են: Տարբեր տառերը ցույց են տալիս մշակումների միջև վիճակագրորեն նշանակալի տարբերությունները (p < 0.05):
Ռեակտիվ թթվածնային տեսակների (ROS; արտահայտված որպես ջրածնի պերօքսիդ [H2O2]) և ազատ ռադիկալների (արտահայտված որպես սուպերօքսիդային անիոններ [O2•−]) in situ հիստոքիմիական տեղայնացումը ցույց տվեց, որ L-օրնիթինի (250 մգ/լ) էկզոգեն կիրառումը զգալիորեն նվազեցրել է H2O2-ի (96.05 ± 5.33 նմոլ.գ−1 FW; Նկ. 5A) և O2•− (32.69 ± 8.56 նմոլ.գ−1 FW; Նկ. 5B) կուտակումը՝ համեմատած չմշակված վարակված բույսերի (համապատասխանաբար՝ 173.31 ± 12.06 և 149.35 ± 7.94 նմոլ.գ−1 FW) և 50 մգ/լ առևտրային Rizolex-T ֆունգիցիդով (համապատասխանաբար՝ 170.12 ± 9.50 և 157.00 ± 7.81 նմոլ.գ−1 ֆր քաշային) մշակված բույսերի կուտակման հետ 72 ժամվա ընթացքում։ H2O2-ի և O2•−-ի բարձր մակարդակներ են կուտակվել hpt-ի ազդեցության տակ (Նկար 5A, B): Նմանապես, TCA-ի վրա հիմնված մալոնդիալդեհիդի (MDA) անալիզը ցույց է տվել, որ S. sclerotiorum-ով վարակված լոբու բույսերը իրենց տերևներում կուտակել են MDA-ի ավելի բարձր մակարդակներ (113.48 ± 10.02 նմոլ.գ. քաշից) (Նկար 5C): Այնուամենայնիվ, L-օրնիթինի էկզոգեն կիրառումը զգալիորեն նվազեցրել է լիպիդների պերօքսիդացումը, ինչը վկայում է մշակված բույսերում MDA-ի պարունակության նվազումը (33.08 ± 4.00 նմոլ.գ. քաշից):
Նկ. 5. Արտաքին L-օրնիթինի կիրառման ազդեցությունը օքսիդատիվ սթրեսի և ոչ ֆերմենտային հակաօքսիդանտային պաշտպանության մեխանիզմների հիմնական մարկերների վրա S. sclerotiorum-ով վարակված լոբու տերևներում՝ վարակվելուց 72 ժամ անց, ջերմոցային պայմաններում: (A) Ջրածնի պերօքսիդ (H2O2; նմոլ գ−1 FW) 72 բենզինային պարբերության դեպքում, (B) սուպերօքսիդային անիոն (O2•−; նմոլ գ−1 FW) 72 բենզինային պարբերության դեպքում, (C) մալոնդիալդեհիդ (MDA; նմոլ գ−1 FW) 72 բենզինային պարբերության դեպքում, (D) ընդհանուր լուծվող ֆենոլներ (մգ GAE գ−1 FW) 72 բենզինային պարբերության դեպքում, (E) ընդհանուր լուծվող ֆլավոնոիդներ (մգ RE գ−1 FW) 72 բենզինային պարբերության դեպքում, (F) ընդհանուր ազատ ամինաթթուներ (մգ գ−1 FW) 72 բենզինային պարբերության դեպքում, և (G) պրոլինի պարունակություն (մգ գ−1 FW) 72 բենզինային պարբերության դեպքում: Արժեքները ներկայացնում են 5 կենսաբանական կրկնօրինակների (n = 5) միջին ± ստանդարտ շեղումը (միջին ± ստանդարտ շեղում): Տարբեր տառերը ցույց են տալիս բուժումների միջև վիճակագրորեն նշանակալի տարբերություններ (p < 0.05):