Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակը սահմանափակ աջակցություն ունի CSS-ի համար: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Բարձր բեռնվածության պարունակությամբ ինսուլինային նանոմասնիկները (ՆՆ) գտել են տարբեր կիրառություններ տարբեր դեղաչափային ձևերով: Այս աշխատանքի նպատակն է գնահատել սառեցման-չորացման և ցողման-չորացման գործընթացների ազդեցությունը ինսուլինով լցված քիտոզան նանոմասնիկների կառուցվածքի վրա՝ մանիտոլով կամ առանց դրա որպես կրիոպաշտպանիչ: Մենք նաև գնահատել ենք այս նանոմասնիկների որակը՝ դրանք վերլուծելով: Ջրազրկումից առաջ քիտոզան/նատրիումի տրիպոլիֆոսֆատ/ինսուլին խաչաձև կապված նանոմասնիկների մասնիկի չափը օպտիմալացվել էր 318 նմ-ի, PDI-ն՝ 0.18, պարկուճացման արդյունավետությունը՝ 99.4%, իսկ բեռնվածությունը՝ 25.01%: Վերականգնումից հետո բոլոր նանոմասնիկները, բացառությամբ մանիտոլի օգտագործման չօգտագործմամբ սառեցման-չորացման մեթոդով ստացվածների, պահպանել են իրենց գնդաձև մասնիկային կառուցվածքը: Համեմատած երկու ցողմամբ ջրազրկված մանիտոլ պարունակող նանոմասնիկների հետ, մանիտոլից զերծ ցողման-չորացրած նանոմասնիկները նույնպես ցույց են տվել ամենափոքր միջին մասնիկի չափը (376 նմ) և ամենաբարձր բեռնվածության պարունակությունը: (25.02%)՝ նմանատիպ պարկուճացման արագությամբ (98.7%) և PDI-ով (0.20)՝ չորացման կամ սառեցման-չորացման տեխնիկայի միջոցով: Մանիտոլ չպարունակող ցողացիրային չորացման միջոցով չորացված նանոմասնիկները նաև հանգեցրել են ինսուլինի ամենաարագ արտազատմանը և բջջային կլանման ամենաբարձր արդյունավետությանը: Այս աշխատանքը ցույց է տալիս, որ ցողացիրային չորացումը կարող է ջրազրկել ինսուլինի նանոմասնիկները՝ առանց կրիոպաշտպանիչների անհրաժեշտության՝ համեմատած ավանդական սառեցման-չորացման մեթոդների հետ, ստեղծելով ավելի մեծ բեռնման հզորություն, ավելի ցածր հավելումների պահանջներ և շահագործման ծախսերի զգալի առավելություն:
1922-ին իր հայտնաբերումից ի վեր՝ 1,2,3, ինսուլինը և դրա դեղագործական պատրաստուկները փրկել են 1-ին տիպի շաքարախտով (T1DM) և 2-րդ տիպի շաքարախտով (T1DM) հիվանդների կյանքը։ Սակայն, բարձր մոլեկուլային քաշ ունեցող սպիտակուց լինելու իր հատկությունների շնորհիվ, ինսուլինը հեշտությամբ ագրեգացվում է, քայքայվում պրոտեոլիտիկ ֆերմենտներով և արտազատվում առաջին անցման էֆեկտով։ 1-ին տիպի շաքարախտով ախտորոշված ​​մարդիկ ինսուլինի ներարկումների կարիք ունեն իրենց կյանքի մնացած մասի համար։ Սկզբնապես 2-րդ տիպի շաքարախտով ախտորոշված ​​շատ հիվանդներ նույնպես երկարատև ինսուլինի ներարկումների կարիք ունեն։ Ամենօրյա ինսուլինի ներարկումները ամենօրյա ցավի և անհարմարության լուրջ աղբյուր են այս անհատների համար, ինչը բացասաբար է անդրադառնում հոգեկան առողջության վրա։ Արդյունքում, ինսուլինի կիրառման այլ ձևեր, որոնք ավելի քիչ անհարմարություն են առաջացնում, ինչպիսիք են բանավոր ինսուլինի կիրառումը, լայնորեն ուսումնասիրվում են5, քանի որ դրանք ունեն ամբողջ աշխարհում շաքարախտով տառապող մոտ 5 միլիարդ մարդու կյանքի որակը վերականգնելու ներուժ։
Նանոմասնիկների տեխնոլոգիան զգալի առաջընթաց է ապահովել բանավոր ինսուլին ընդունելու փորձերում4,6,7: Ինսուլինն արդյունավետորեն պարկուճավորվում և պաշտպանվում է քայքայումից՝ մարմնի որոշակի հատվածներ թիրախային առաքման համար: Այնուամենայնիվ, նանոմասնիկների բանաձևերի օգտագործումն ունի մի շարք սահմանափակումներ, որոնք հիմնականում պայմանավորված են մասնիկների կախույթների կայունության հետ կապված խնդիրներով: Պահպանման ընթացքում կարող է առաջանալ որոշակի ագրեգացիա, ինչը նվազեցնում է ինսուլինով լցված նանոմասնիկների կենսամատչելիությունը8: Բացի այդ, նանոմասնիկների և ինսուլինի պոլիմերային մատրիցայի քիմիական կայունությունը նույնպես պետք է հաշվի առնվի՝ ինսուլինային նանոմասնիկների (ՆՆ) կայունությունն ապահովելու համար: Ներկայումս սառեցման-չորացման տեխնոլոգիան ոսկե ստանդարտ է կայուն ՆՆ-ներ ստեղծելու և պահպանման ընթացքում անցանկալի փոփոխությունները կանխելու համար9:
Այնուամենայնիվ, սառեցմամբ չորացումը պահանջում է կրիոպաշտպանիչների ավելացում՝ նանոմասնիկների գնդաձև կառուցվածքի վրա սառցե բյուրեղների մեխանիկական լարվածության ազդեցությունը կանխելու համար: Սա զգալիորեն նվազեցնում է ինսուլինի նանոմասնիկների բեռնվածությունը լիոֆիլիզացումից հետո, քանի որ կրիոպաշտպանիչը զբաղեցնում է քաշային հարաբերակցության մեծ մասը: Հետևաբար, արտադրված ինսուլինային նանոմասնիկները հաճախ համարվում են անպիտան չոր փոշու բանաձևերի, ինչպիսիք են բանավոր դեղահաբերը և բանավոր թաղանթները, արտադրության համար՝ ինսուլինի թերապևտիկ պատուհանին հասնելու համար չոր նանոմասնիկների մեծ քանակության անհրաժեշտության պատճառով:
Ցողարկիչով չորացումը դեղագործական արդյունաբերության մեջ հեղուկ փուլերից չոր փոշիներ ստանալու հայտնի և էժան արդյունաբերական մասշտաբի գործընթաց է10,11: Մասնիկների ձևավորման գործընթացի վերահսկողությունը թույլ է տալիս մի քանի կենսաակտիվ միացությունների պատշաճ կերպով պատիճավորել 12, 13: Ավելին, այն դարձել է արդյունավետ տեխնիկա բանավոր ընդունման համար պատիճավորված սպիտակուցներ պատրաստելու համար: Ցողարկիչով չորացման ընթացքում ջուրը շատ արագ գոլորշիանում է, ինչը օգնում է մասնիկի միջուկի ջերմաստիճանը ցածր պահել 11,14, հնարավորություն տալով դրա կիրառմանը ջերմազգայուն բաղադրիչները պատիճավորելու համար: Ցողարկիչով չորացումից առաջ ծածկույթի նյութը պետք է մանրակրկիտ համասեռացվի պատիճավորված բաղադրիչները պարունակող լուծույթով 11,14: Ի տարբերություն սառեցնող չորացման, ցողարկիչով չորացման ժամանակ պատիճավորումից առաջ համասեռացումը բարելավում է պատիճավորման արդյունավետությունը ջրազրկման ընթացքում: Քանի որ ցողարկիչով չորացման պատիճավորման գործընթացը չի պահանջում կրիոպաշտպանիչներ, ցողարկիչով չորացումը կարող է օգտագործվել բարձր բեռնվածության պարունակությամբ չորացրած նանոմասնիկներ ստանալու համար:
Այս ուսումնասիրությունը ներկայացնում է ինսուլինով լցված նանոմասնիկների արտադրությունը՝ քիտոզանի և նատրիումի տրիպոլիֆոսֆատի խաչաձև կապակցման միջոցով՝ օգտագործելով իոնային գելի մեթոդը: Իոնային գելացումը պատրաստման մեթոդ է, որը թույլ է տալիս նանոմասնիկներ ստանալ երկու կամ ավելի իոնային տեսակների միջև էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունների միջոցով՝ որոշակի պայմաններում: Քիտոզանի/նատրիումի տրիպոլիֆոսֆատի/ինսուլինի խաչաձև կապակցված նանոմասնիկների ջրազրկման համար օգտագործվել են ինչպես սառեցման-չորացման, այնպես էլ ցողման-չորացման տեխնիկաները: Ջրազրկումից հետո դրանց ձևաբանությունը վերլուծվել է Սկանավորման էլեկտրոնային մանրադիտակի (SEM) միջոցով: Դրանց վերակոմբինացման ունակությունը գնահատվել է՝ չափելով դրանց չափերի բաշխումը, մակերեսային լիցքը, PDI-ը, պարկուճացման արդյունավետությունը և բեռնման պարունակությունը: Տարբեր ջրազրկման մեթոդներով ստացված վերլուծված նանոմասնիկների որակը նույնպես գնահատվել է՝ համեմատելով դրանց ինսուլինային պաշտպանությունը, արտազատման վարքագիծը և բջջային կլանման արդյունավետությունը:
Խառը լուծույթի pH-ը և քիտոզանի ու ինսուլինի հարաբերակցությունը երկու հիմնական գործոններ են, որոնք ազդում են վերջնական նանոմասնիկների մասնիկների չափի և պարկուճացման արդյունավետության (EE) վրա, քանի որ դրանք անմիջականորեն ազդում են իոնոտրոպ գելացման գործընթացի վրա: Խառը լուծույթի pH-ը ցույց է տվել, որ խիստ կապված է մասնիկների չափի և պարկուճացման արդյունավետության հետ (Նկար 1ա): Ինչպես ցույց է տրված Նկար 1ա-ում, երբ pH-ը բարձրանում էր 4.0-ից մինչև 6.0, միջին մասնիկի չափը (նմ) նվազում էր, և EE-ն զգալիորեն աճում էր, մինչդեռ երբ pH-ը բարձրանում էր մինչև 6.5, միջին մասնիկի չափը սկսում էր մեծանալ, և EE-ն մնում էր անփոփոխ: Երբ քիտոզանի և ինսուլինի հարաբերակցությունը մեծանում էր, միջին մասնիկի չափը նույնպես մեծանում էր: Ավելին, EE-ի փոփոխություն չի նկատվել, երբ նանոմասնիկները պատրաստվել են քիտոզան/ինսուլինի 2.5:1-ից բարձր զանգվածային հարաբերակցությամբ (w/w) (Նկար 1բ): Հետևաբար, այս ուսումնասիրության մեջ օպտիմալ պատրաստման պայմանները (pH 6.0, քիտոզան/ինսուլինի զանգվածային հարաբերակցություն 2.5:1) օգտագործվել են ինսուլինով լցված նանոմասնիկներ պատրաստելու համար՝ հետագա ուսումնասիրությունների համար: Այս նախապատրաստման պայմաններում ինսուլինային նանոմասնիկների միջին մասնիկի չափը օպտիմալացվել է 318 նմ-ի (Նկար 1գ), PDI-ն՝ 0.18, ներդրման արդյունավետությունը՝ 99.4%, զետա պոտենցիալը՝ 9.8 մվ, իսկ ինսուլինային բեռնվածությունը՝ 25.01% (մ/մ2): Էլեկտրոնային փոխանցման մանրադիտակի (TEM) արդյունքների հիման վրա օպտիմալացված նանոմասնիկները մոտավորապես գնդաձև և դիսկրետ էին՝ համեմատաբար միատարր չափսերով (Նկար 1դ):
Ինսուլինային նանոմասնիկների պարամետրերի օպտիմալացում. (ա) pH-ի ազդեցությունը ինսուլինային նանոմասնիկների միջին տրամագծի և պարկուճացման արդյունավետության (EE) վրա (պատրաստված քիտոզանի և ինսուլինի 5:1 զանգվածային հարաբերակցությամբ). (բ) քիտոզան և ինսուլինի զանգվածային հարաբերակցության ազդեցությունը ինսուլինային նանոմասնիկների միջին տրամագծի և պարկուճացման արդյունավետության (EE) վրա (պատրաստված pH 6-ով). (գ) օպտիմիզացված ինսուլինային նանոմասնիկների մասնիկների չափերի բաշխումը. (դ) օպտիմիզացված ինսուլինային նանոմասնիկների TEM միկրոֆոտո։
Հայտնի է, որ քիտոզանը թույլ պոլիէլեկտրոլիտ է՝ 6.5 pKa-ով։ Այն դրական լիցքավորված է թթվային միջավայրում, քանի որ դրա հիմնական ամինո խումբը պրոտոնացված է ջրածնի իոններով15։ Հետևաբար, այն հաճախ օգտագործվում է որպես կրող՝ բացասական լիցքավորված մակրոմոլեկուլները պարկուճավորելու համար։ Այս ուսումնասիրության մեջ քիտոզանն օգտագործվել է 5.3 իզոէլեկտրական կետով ինսուլինը պարկուճավորելու համար։ Քանի որ քիտոզանն օգտագործվում է որպես ծածկույթի նյութ, դրա համամասնության մեծացման հետ մեկտեղ նանոմասնիկների արտաքին շերտի հաստությունը համապատասխանաբար մեծանում է, ինչը հանգեցնում է մասնիկների միջին չափի մեծացմանը։ Բացի այդ, քիտոզանի ավելի բարձր մակարդակները կարող են պարկուճավորել ավելի շատ ինսուլին։ Մեր դեպքում EE-ն ամենաբարձրն էր, երբ քիտոզանի և ինսուլինի հարաբերակցությունը հասնում էր 2.5:1-ի, և EE-ի էական փոփոխություն չի եղել, երբ հարաբերակցությունը շարունակում էր աճել։
Բացի քիտոզանի և ինսուլինի հարաբերակցությունից, pH-ը նույնպես կարևոր դեր է խաղացել նանոմասնիկների պատրաստման գործում: Գանը և այլք17 ուսումնասիրել են pH-ի ազդեցությունը քիտոզանի նանոմասնիկների մասնիկների չափի վրա: Նրանք հայտնաբերել են մասնիկների չափի անընդհատ նվազում մինչև pH-ի 6.0-ի հասնելը, և մասնիկների չափի զգալի աճ է նկատվել pH > 6.0-ի դեպքում, ինչը համապատասխանում է մեր դիտարկումներին: Այս երևույթը պայմանավորված է նրանով, որ pH-ի բարձրացման հետ մեկտեղ ինսուլինի մոլեկուլը ձեռք է բերում բացասական մակերեսային լիցք, այդպիսով նպաստելով քիտոզան/նատրիումի տրիպոլիֆոսֆատ (TPP) համալիրի հետ էլեկտրաստատիկ փոխազդեցություններին, ինչը հանգեցնում է մասնիկների փոքր չափի և բարձր EE-ի: Այնուամենայնիվ, երբ pH-ը կարգավորվեց մինչև 6.5, քիտոզանի վրա ամինո խմբերը ապապրոտոնացվեցին, ինչը հանգեցրեց քիտոզանի ծալմանը: Այսպիսով, բարձր pH-ը հանգեցնում է ամինաթթուների ավելի քիչ ազդեցությանը TPP-ի և ինսուլինի նկատմամբ, ինչը հանգեցնում է ավելի ցածր խաչաձև կապի, ավելի մեծ վերջնական միջին մասնիկի չափի և ավելի ցածր EE-ի:
Սառեցմամբ չորացրած և ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկների ձևաբանական հատկությունների վերլուծությունը կարող է ուղղորդել ավելի լավ ջրազրկման և փոշու առաջացման տեխնիկայի ընտրությանը: Նախընտրելի մեթոդը պետք է ապահովի դեղամիջոցի կայունություն, միատարր մասնիկի ձև, դեղամիջոցի բարձր բեռնվածություն և լավ լուծելիություն սկզբնական լուծույթում: Այս ուսումնասիրության մեջ, երկու տեխնիկաները ավելի լավ համեմատելու համար, ջրազրկման ընթացքում օգտագործվել են ինսուլինային նանոմասնիկներ՝ 1% մանիտոլով կամ առանց դրա: Մանիտոլն օգտագործվում է որպես լցանյութ կամ կրիոպաշտպանիչ տարբեր չոր փոշու բանաձևերում՝ սառեցմամբ չորացման և ցողացիրով չորացման համար: Մանիտոլ չպարունակող լիոֆիլիզացված ինսուլինային նանոմասնիկների համար, ինչպես ցույց է տրված նկար 2ա-ում, սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի (SEM) տակ դիտվել է բարձր ծակոտկեն փոշու կառուցվածք՝ մեծ, անկանոն և կոպիտ մակերեսներով: Ջրազրկումից հետո փոշու մեջ հայտնաբերվել են քիչ դիսկրետ մասնիկներ (Նկար 2ե): Այս արդյունքները ցույց են տվել, որ նանոմասնիկների մեծ մասը քայքայվել է սառեցմամբ չորացման ընթացքում՝ առանց որևէ կրիոպաշտպանիչի: 1% մանիտոլ պարունակող սառեցմամբ չորացրած և ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկների համար դիտվել են հարթ մակերեսներով գնդաձև նանոմասնիկներ (Նկար 2ե): 2բ,դ,ֆ,հ)։ Առանց մանիտոլի ցողացիրով չորացրած ինսուլինի նանոմասնիկները մնացին գնդաձև, բայց մակերեսին կնճռոտվեցին (Նկար 2գ)։ Գնդաձև և կնճռոտ մակերեսները ավելի մանրամասն քննարկվում են ստորև ներկայացված արտազատման վարքագծի և բջջային կլանման թեստերում։ Չորացրած նանոմասնիկների տեսանելի տեսքի հիման վրա, ինչպես մանիտոլ չպարունակող ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկները, այնպես էլ մանիտոլով սառեցված և ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկները տվեցին նուրբ նանոմասնիկների փոշիներ (Նկար 2ֆ,գ,հ)։ Որքան մեծ է մասնիկների մակերեսների միջև մակերեսը, այնքան բարձր է լուծելիությունը և, հետևաբար, այնքան բարձր է արտազատման արագությունը։
Տարբեր ջրազրկված ինսուլինային նանոմասնիկների մորֆոլոգիան՝ (ա) մանիտոլ չպարունակող լիոֆիլիզացված ինսուլինային նանոմասնիկների SEM պատկեր; (բ) մանիտոլով լիոֆիլիզացված ինսուլինային նանոմասնիկների SEM պատկեր; (գ) մանիտոլ չպարունակող ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկներ -ի SEM պատկեր; (դ) մանիտոլով ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկների SEM պատկեր; (ե) մանիտոլ չպարունակող լիոֆիլիզացված ինսուլինային նանոմասնիկների փոշու պատկեր; (զ) մանիտոլով լիոֆիլիզացված ինսուլինային նանոմասնիկների պատկեր; (է) մանիտոլ չպարունակող ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկների փոշու պատկեր; (ը) մանիտոլով ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկների փոշու պատկեր։
Սառեցման-չորացման ընթացքում մանիտոլը գործում է որպես կրիոպաշտպանիչ՝ պահպանելով նանոմասնիկները ամորֆ վիճակում և կանխելով սառցե բյուրեղների վնասումը19: Ի տարբերություն դրա, ցողիչ չորացման ժամանակ սառեցման փուլ չկա: Հետևաբար, այս մեթոդում մանիտոլը պարտադիր չէ: Փաստորեն, մանիտոլ չպարունակող ցողիչով չորացրած նանոմասնիկները տվել են ավելի նուրբ նանոմասնիկներ, ինչպես նախկինում նկարագրվել է: Այնուամենայնիվ, մանիտոլը դեռևս կարող է գործել որպես լցոնիչ ցողիչով չորացման գործընթացում՝ նանոմասնիկներին տալով ավելի գնդաձև կառուցվածք20 (Նկար 2դ), ինչը նպաստում է նման պատիճավորված նանոմասնիկների միատարր արտազատման վարքագծին: Բացի այդ, պարզ է, որ որոշ խոշոր մասնիկներ կարող են հայտնաբերվել ինչպես սառեցված, այնպես էլ ցողիչով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկներում, որոնք պարունակում են մանիտոլ (Նկար 2բ,դ), ինչը կարող է պայմանավորված լինել մասնիկի միջուկում մանիտոլի կուտակմամբ՝ պատիճավորված ինսուլինի հետ միասին: Քիտոզանի շերտ։ Հարկ է նշել, որ այս ուսումնասիրության մեջ, ջրազրկումից հետո գնդաձև կառուցվածքի անփոփոխ մնալն ապահովելու համար, մանիտոլի և քիտոզանի հարաբերակցությունը պահպանվում է 5:1-ի վրա, որպեսզի լցանյութի մեծ քանակը նույնպես կարողանա մեծացնել չորացրած նանոմասնիկների մասնիկների չափը։
Ֆուրիեի ձևափոխության ինֆրակարմիր թուլացված լրիվ անդրադարձման (FTIR-ATR) սպեկտրոսկոպիան բնութագրել է ազատ ինսուլինի, խիտոզանի, խիտոզանի, TPP-ի և ինսուլինի ֆիզիկական խառնուրդը: Բոլոր ջրազրկված նանոմասնիկները բնութագրվել են FTIR-ATR սպեկտրոսկոպիայի միջոցով: Նշենք, որ մանիտոլով սառեցված-չորացրած նանոմասնիկներում և մանիտոլով և առանց դրա ցողման-չորացրած նանոմասնիկներում (Նկար 3) նկատվել են 1641, 1543 և 1412 սմ-1 գոտիների ինտենսիվություններ: Ինչպես նախկինում նշվել է, ուժի այս աճը կապված էր խիտոզանի, TPP-ի և ինսուլինի միջև խաչաձև կապի հետ: Խիտոզանի և ինսուլինի փոխազդեցության հետազոտությունը ցույց է տվել, որ ինսուլինով լցված խիտոզանի նանոմասնիկների FTIR սպեկտրներում խիտոզանի գոտին համընկնում էր ինսուլինի գոտու հետ՝ մեծացնելով կարբոնիլային ինտենսիվությունը (1641 սմ-1) և ամինային (1543 սմ-1) գոտին: TPP-ի եռապոլիֆոսֆատային խմբերը կապված են խիտոզանի ամոնիումային խմբերի հետ՝ ձևավորելով գոտին 1412 սմ-1-ում։
Ազատ ինսուլինի, խիտոզանի, խիտոզանի/TPP/ինսուլինի ֆիզիկական խառնուրդների և տարբեր մեթոդներով ջրազրկված նանոմասնիկների FTIR-ATR սպեկտրները։
Ավելին, այս արդյունքները համապատասխանում են ՍԷՄ-ում ներկայացված արդյունքներին, որոնք ցույց են տվել, որ պատիճավորված նանոմասնիկները մնացել են անփոփոխ՝ թե՛ մանիտոլով ցողելիս, թե՛ սառեցված չորացնելիս, սակայն մանիտոլի բացակայության դեպքում միայն ցողմամբ չորացումն է առաջացրել պատիճավորված մասնիկներ։ Ի տարբերություն դրա, առանց մանիտոլի սառեցված չորացրած նանոմասնիկների FTIR-ATR սպեկտրալ արդյունքները շատ նման էին քիտոզանի, TPP-ի և ինսուլինի ֆիզիկական խառնուրդին։ Այս արդյունքը ցույց է տալիս, որ քիտոզանի, TPP-ի և ինսուլինի միջև խաչաձև կապերը այլևս բացակայում են առանց մանիտոլի սառեցված չորացրած նանոմասնիկներում։ Նանոմասնիկների կառուցվածքը ոչնչացվել է սառեցված չորացման ընթացքում՝ առանց կրիոպաշտպանիչի, ինչը կարելի է տեսնել SEM արդյունքներում (Նկար 2ա)։ Ջրազրկված ինսուլինային նանոմասնիկների ձևաբանության և FTIR արդյունքների հիման վրա, վերականգնման փորձերի համար օգտագործվել են միայն լիոֆիլիզացված, ցողմամբ չորացրած և մանիտոլից զերծ նանոմասնիկներ, իսկ ջրազրկման ընթացքում մանիտոլից զերծ նանոմասնիկների քայքայման պատճառով՝ մանիտոլից զերծ նանոմասնիկների քայքայման պատճառով։ Քննարկել։
Ջրազրկումն օգտագործվում է երկարատև պահպանման և այլ բանաձևերի վերամշակման համար: Չոր նանոմասնիկների պահպանումից հետո վերականգնվելու ունակությունը կարևոր է տարբեր բանաձևերում, ինչպիսիք են դեղահաբերը և թաղանթները, օգտագործելու համար: Մենք նկատեցինք, որ մանիտոլի բացակայության դեպքում ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկների միջին մասնիկի չափը վերականգնումից հետո միայն փոքր-ինչ մեծացել է: Մյուս կողմից, մանիտոլով ցողացիրով չորացրած և սառեցված ինսուլինային նանոմասնիկների մասնիկի չափը զգալիորեն մեծացել է (աղյուսակ 1): PDI-ն և EE-ն զգալիորեն չեն փոխվել (p > 0.05) այս ուսումնասիրության մեջ բոլոր նանոմասնիկների վերամիավորումից հետո (աղյուսակ 1): Այս արդյունքը ցույց է տալիս, որ մասնիկների մեծ մասը մնացել է անփոփոխ վերլուծությունից հետո: Այնուամենայնիվ, մանիտոլի ավելացումը հանգեցրել է լիոֆիլիզացված և ցողացիրով չորացրած մանիտոլային նանոմասնիկների ինսուլինային բեռնվածության զգալի նվազմանը (աղյուսակ 1): Ի տարբերություն դրա, մանիտոլով ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկների ինսուլինային բեռնվածության պարունակությունը մնացել է նույնը, ինչ նախկինում (աղյուսակ 1):
Հայտնի է, որ նանոմասնիկների բեռնումը կարևոր է դեղերի առաքման նպատակներով օգտագործելիս: Ցածր բեռնվածությամբ նանոմասնիկների համար թերապևտիկ շեմին հասնելու համար անհրաժեշտ է շատ մեծ քանակությամբ նյութ: Այնուամենայնիվ, նման բարձր կոնցենտրացիաների բարձր մածուցիկությունը հանգեցնում է անհարմարության և դժվարության համապատասխանաբար բանավոր ընդունման և ներարկային բանաձևերի դեպքում22: Բացի այդ, ինսուլինային նանոմասնիկները կարող են օգտագործվել նաև դեղահաբեր և մածուցիկ բիոթաղանթներ պատրաստելու համար23, 24, ինչը պահանջում է նանոմասնիկների մեծ քանակությամբ օգտագործում ցածր բեռնվածության մակարդակներում, ինչը հանգեցնում է մեծ դեղահաբերի և հաստ բիոթաղանթների, որոնք հարմար չեն բանավոր կիրառման համար: Հետևաբար, ջրազրկված նանոմասնիկները՝ բարձր ինսուլինային բեռնվածությամբ, խիստ ցանկալի են: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ մանիտոլ չպարունակող ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկների բարձր ինսուլինային բեռնվածությունը կարող է բազմաթիվ գրավիչ առավելություններ առաջարկել այս այլընտրանքային առաքման մեթոդների համար:
Բոլոր ջրազրկված նանոմասնիկները պահվել են սառնարանում երեք ամիս։ Սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակի (SEM) արդյունքները ցույց են տվել, որ բոլոր ջրազրկված նանոմասնիկների ձևաբանությունը էականորեն չի փոխվել երեք ամսվա պահպանման ընթացքում (Նկար 4): Ջրում վերականգնելուց հետո բոլոր նանոմասնիկների մոտ նկատվել է EE-ի աննշան նվազում և երեք ամսվա պահպանման ընթացքում արտազատվել է մոտավորապես փոքր քանակությամբ (~5%) ինսուլին (աղյուսակ 2): Այնուամենայնիվ, բոլոր նանոմասնիկների միջին մասնիկի չափը մեծացել է: Մանիտոլ չպարունակող ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկների մասնիկի չափը մեծացել է մինչև 525 նմ, մինչդեռ մանիտոլով ցողացիրով չորացրած և սառեցված չորացրած նանոմասնիկների չափը համապատասխանաբար աճել է մինչև 872 և 921 նմ (աղյուսակ 2):
Երեք ամիս պահված տարբեր ջրազրկված ինսուլինային նանոմասնիկների մորֆոլոգիան՝ (ա) մանիտոլով լիոֆիլիզացված ինսուլինային նանոմասնիկների SEM պատկեր, (բ) առանց մանիտոլի ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկների SEM պատկեր, (գ) առանց մանիտոլի ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկների SEM պատկերներ։
Ավելին, մանիտոլով ցողացիրով չորացրած և սառեցված վիճակում չորացրած վերականգնված ինսուլինի նանոմասնիկներում նկատվել են նստվածքներ (Նկ. S2): Սա կարող է պայմանավորված լինել ջրում ճիշտ չկախված խոշոր մասնիկներով: Վերոնշյալ բոլոր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ցողացիրով չորացման տեխնիկան կարող է պաշտպանել ինսուլինի նանոմասնիկները ջրազրկումից, և որ ինսուլինի նանոմասնիկների բարձր բեռնվածություն կարելի է ստանալ առանց որևէ լցոնիչի կամ կրիոպաշտպանիչի:
Ինսուլինի պահպանումը ստուգվել է pH = 2.5 միջավայրում՝ պեպսինով, տրիպսինով և α-քիմոտրիպսինով՝ ջրազրկումից հետո նանոմասնիկների ֆերմենտատիվ մարսողության դեմ պաշտպանիչ ունակությունը ցույց տալու համար: Ջրազրկված նանոմասնիկների ինսուլինի պահպանումը համեմատվել է թարմ պատրաստված նանոմասնիկների հետ, և որպես բացասական վերահսկողություն օգտագործվել է ազատ ինսուլինը: Այս ուսումնասիրության մեջ ազատ ինսուլինը ցույց է տվել ինսուլինի արագ վերացում 4 ժամվա ընթացքում բոլոր երեք ֆերմենտատիվ մշակումներում (Նկար 5ա-գ): Ի տարբերություն դրա, մանիտոլով սառեցված չորացրած նանոմասնիկների և մանիտոլով կամ առանց դրա ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկների ինսուլինի վերացման փորձարկումը ցույց է տվել այս նանոմասնիկների զգալիորեն ավելի բարձր պաշտպանություն ֆերմենտատիվ մարսողության դեմ, որը նման էր թարմ պատրաստված ինսուլինային նանոմասնիկների պաշտպանությանը (նկար 1):5ա-գ): Պեպսինում, տրիպսինում և α-քիմոտրիպսինում նանոմասնիկների օգնությամբ ինսուլինի ավելի քան 50%, 60% և 75%-ը կարողացել են պաշտպանվել համապատասխանաբար 4 ժամվա ընթացքում (Նկար 5ա-գ): Այս ինսուլին-պաշտպանիչ ունակությունը կարող է մեծացնել ինսուլինի ավելի բարձր կլանման հավանականությունը: արյան մեջ25: Այս արդյունքները ենթադրում են, որ մանիտոլով կամ առանց դրա ցողացիրային չորացումը և մանիտոլով սառեցնող չորացումը կարող են պահպանել նանոմասնիկների ինսուլինապաշտպանիչ ունակությունը ջրազրկումից հետո:
Ջրազրկված ինսուլինային նանոմասնիկների պաշտպանությունը և արտազատման վարքագիծը. (ա) ինսուլինի պաշտպանությունը պեպսինի լուծույթում, (բ) ինսուլինի պաշտպանությունը տրիպսինի լուծույթում, (գ) ինսուլինի պաշտպանությունը α-քիմոտրիպսինի լուծույթով, (դ) Ջրազրկված նանոմասնիկների արտազատման վարքագիծը pH = 2.5 լուծույթում, (ե) Ջրազրկված նանոմասնիկների արտազատման վարքագիծը pH = 6.6 լուծույթում, (զ) Ջրազրկված նանոմասնիկների արտազատման վարքագիծը pH = 7.0 լուծույթում։
Ինսուլինի ազդեցությունը ինսուլինային դիմադրության վրա ուսումնասիրելու համար թարմ պատրաստված և վերականգնված չոր ինսուլինային նանոմասնիկները ինկուբացվել են տարբեր բուֆերներում (pH = 2.5, 6.6, 7.0) 37°C ջերմաստիճանում՝ սիմուլացնելով ստամոքսի, տասներկումատնյա աղիքի և վերին բարակ աղիքի pH միջավայրը։ Տարբեր միջավայրերում արտազատման վարքագիծ։ Ստամոքս-աղիքային տրակտի հատված։ pH = 2.5 դեպքում ինսուլինով լցված նանոմասնիկները և լուծված չոր ինսուլինային նանոմասնիկները ցույց տվեցին սկզբնական պայթյունային արտազատում առաջին մեկ ժամվա ընթացքում, որին հաջորդեց դանդաղ արտազատում հաջորդ 5 ժամվա ընթացքում (Նկար 5դ)։ Սկզբում այս արագ արտազատումը, ամենայն հավանականությամբ, մասնիկի ներքին կառուցվածքում լիովին անշարժացված չլինող սպիտակուցային մոլեկուլների արագ մակերեսային դեսորբցիայի արդյունք է։ pH = 6.5 դեպքում ինսուլինով լցված նանոմասնիկները և վերականգնված չոր ինսուլինային նանոմասնիկները ցույց տվեցին հարթ և դանդաղ արտազատում 6 ժամվա ընթացքում, քանի որ փորձարկման լուծույթի pH-ը նման էր նանոմասնիկներով պատրաստված լուծույթի pH-ին (Նկար 5ե)։ pH = 7 դեպքում նանոմասնիկները անկայուն էին և գրեթե ամբողջությամբ քայքայվեցին առաջին երկու ժամվա ընթացքում (Նկար 5զ)։ Դա պայմանավորված է նրանով, որ խիտոզանի դեպրոտոնացումը տեղի է ունենում ավելի բարձր pH-ի դեպքում, ինչը հանգեցնում է ավելի քիչ կոմպակտ պոլիմերային ցանցի և լցված ինսուլինի արտազատման։
Ավելին, առանց մանիտոլի ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկները ցույց տվեցին ավելի արագ արտազատման պրոֆիլ, քան մյուս ջրազրկված նանոմասնիկները (Նկ. 5դ-զ): Ինչպես նախկինում նկարագրվել է, առանց մանիտոլի չորացրած վերականգնված ինսուլինային նանոմասնիկները ցույց տվեցին մասնիկների ամենափոքր չափը: Փոքր մասնիկները ապահովում են ավելի մեծ մակերես, ուստի համապատասխան դեղամիջոցի մեծ մասը կլինի մասնիկի մակերեսին կամ դրան մոտ, ինչը հանգեցնում է դեղամիջոցի արագ արտազատման26:
Նանոմասնիկների ցիտոտոքսիկությունը հետազոտվել է MTT անալիզի միջոցով: Ինչպես ցույց է տրված նկար S4-ում, բոլոր ջրազրկված նանոմասնիկները 50-500 մկգ/մլ կոնցենտրացիաների դեպքում էական ազդեցություն չեն ունեցել բջիջների կենսունակության վրա, ինչը ենթադրում է, որ բոլոր ջրազրկված նանոմասնիկները կարող են անվտանգ կերպով օգտագործվել թերապևտիկ պատուհանին հասնելու համար:
Լյարդը հիմնական օրգանն է, որի միջոցով ինսուլինը կատարում է իր ֆիզիոլոգիական գործառույթները: HepG2 բջիջները մարդու հեպատոմայի բջջային գիծ են, որոնք լայնորեն օգտագործվում են որպես in vitro հեպատոցիտների կլանման մոդել: Այստեղ HepG2 բջիջները օգտագործվել են ջրազրկված նանոմասնիկների բջջային կլանումը գնահատելու համար՝ օգտագործելով սառեցման-չորացման և ցողման-չորացման մեթոդներ: Բջջային կլանումը կոնֆոկալ լազերային սկանավորման միջոցով՝ օգտագործելով հոսքային ցիտոմետրիա և տեսողություն, մի քանի ժամ ինկուբացիայից հետո՝ ազատ FITC ինսուլինով 25 մկգ/մլ կոնցենտրացիայով, թարմ պատրաստված FITC ինսուլինով լցված նանոմասնիկներով և ջրազրկված FITC ինսուլինով լցված նանոմասնիկներով՝ հավասար ինսուլինային կոնցենտրացիաներով: Կատարվել են քանակական մանրադիտակային (CLSM) դիտարկումներ: Առանց մանիտոլի լիոֆիլիզացված նանոմասնիկները ոչնչացվել են ջրազրկման ընթացքում և չեն գնահատվել այս փորձարկման մեջ: Թարմ պատրաստված ինսուլինով լցված նանոմասնիկների, մանիտոլով լիոֆիլիզացված նանոմասնիկների և մանիտոլով և առանց ցողման չորացրած նանոմասնիկների (Նկար 6ա) ներբջջային ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունները կազմել են 4.3, 2.6, 2.4 և 4.1 անգամ ավելի բարձր, քան ազատները։ FITC-ինսուլինի խումբ, համապատասխանաբար (Նկ. 6բ): Այս արդյունքները ենթադրում են, որ պատիճավորված ինսուլինն ավելի հզոր է բջջային կլանման մեջ, քան ազատ ինսուլինը, հիմնականում ուսումնասիրության ընթացքում առաջացած ինսուլինով լցված նանոմասնիկների փոքր չափի պատճառով:
HepG2 բջիջների կողմից կլանումը 4 ժամյա ինկուբացիայից հետո՝ թարմ պատրաստված նանոմասնիկներով և ջրազրկված նանոմասնիկներով. (ա) HepG2 բջիջների կողմից FITC-ինսուլինի կլանման բաշխումը։ (բ) Ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունների երկրաչափական միջինը՝ վերլուծված հոսքային ցիտոմետրիայով (n = 3), *P < 0.05՝ համեմատած ազատ ինսուլինի հետ։
Նմանապես, CLSM պատկերները ցույց տվեցին, որ թարմ պատրաստված FITC-ինսուլինով լցված նանոմասնիկների և FITC-ինսուլինով լցված ցողացիր-չորացրած նանոմասնիկների (առանց մանիտոլի) FITC ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունները շատ ավելի ուժեղ էին, քան մյուս նմուշներինը (Նկար 6ա): Ավելին, մանիտոլի ավելացման դեպքում լուծույթի ավելի բարձր մածուցիկությունը մեծացրեց բջջային կլանման դիմադրությունը, ինչը հանգեցրեց ինսուլինի բազմացման նվազմանը: Այս արդյունքները ենթադրում են, որ մանիտոլ չպարունակող ցողացիր-չորացրած նանոմասնիկները ցուցաբերեցին բջջային կլանման ամենաբարձր արդյունավետությունը, քանի որ դրանց մասնիկների չափը վերլուծությունից հետո փոքր էր, քան սառեցված-չորացրած նանոմասնիկներինը:
Քիտոզանը (միջին մոլեկուլային քաշը՝ 100 կԴա, 75–85% դեացետիլացված) ձեռք է բերվել Sigma-Aldrich-ից (Օքվիլ, Օնտարիո, Կանադա): Նատրիումի տրիպոլիֆոսֆատը (TPP) ձեռք է բերվել VWR-ից (Ռադնոր, Փենսիլվանիա, ԱՄՆ): Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործված ռեկոմբինանտ մարդկային ինսուլինը Fisher Scientific-ից է (Ուոլթհեմ, Մասաչուսեթս, ԱՄՆ): Ֆլուորեսցեինի իզոտիոցիանատով (FITC) նշագրված մարդկային ինսուլինը և 4',6-դիամիդինո-2-ֆենիլինդոլ դիհիդրոքլորիդը (DAPI) ձեռք են բերվել Sigma-Aldrich-ից (Օքվիլ, Օնտարիո, Կանադա): HepG2 բջջային գիծը ձեռք է բերվել ATCC-ից (Մանասաս, Վիրջինիա, ԱՄՆ): Բոլոր մյուս ռեակտիվները վերլուծական կամ քրոմատոգրաֆիկ որակի էին:
Պատրաստեք 1 մգ/մլ CS լուծույթ՝ այն լուծելով կրկնակի թորած ջրի (DD ջուր) մեջ, որը պարունակում է 0.1% քացախաթթու։ Պատրաստեք TPP-ի և ինսուլինի 1 մգ/մլ լուծույթներ՝ դրանք լուծելով համապատասխանաբար DD ջրի և 0.1% քացախաթթվի մեջ։ Նախնական էմուլսիան պատրաստվել է polytron PCU-2-110 բարձր արագությամբ հոմոգենիզատորով (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ԱՄՆ)։ Պատրաստման գործընթացը հետևյալն է. նախ, 2 մլ TPP լուծույթ ավելացվում է 4 մլ ինսուլինի լուծույթին, խառնուրդը խառնվում է 30 րոպե և լիովին խառնվում։ Այնուհետև խառը լուծույթը կաթիլ-կաթիլ ավելացվում է CS լուծույթին ներարկիչի միջոցով՝ բարձր արագությամբ խառնման (10,000 պտ/րոպե) տակ։ Խառնուրդները պահվում են բարձր արագությամբ խառնման (15,000 պտ/րոպե) տակ սառցե լոգարանում 30 րոպե, և դրանք կարգավորվում են որոշակի pH-ի՝ խաչաձև կապված ինսուլինային նանոմասնիկներ ստանալու համար։ Ինսուլինային նանոմասնիկների հետագա հոմոգենացման և մասնիկների չափը նվազեցնելու համար դրանք ուլտրաձայնային մշակման են ենթարկվում ևս 30 րոպե։ սառցե լոգարանում՝ օգտագործելով զոնդային տիպի սոնիկատոր (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Գերմանիա):
Ինսուլինային նանոմասնիկները ստուգվել են Z-միջին տրամագծի, պոլիդիսպերսիայի ինդեքսի (PDI) և զետա պոտենցիալի համար՝ օգտագործելով դինամիկ լույսի ցրման (DLS) չափումներ՝ օգտագործելով Litesizer 500 (Անտոն Պաար, Գրաց, Ավստրիա) սարքը՝ դրանք նոսրացնելով DD ջրում 25°C ջերմաստիճանում: Մորֆոլոգիան և չափերի բաշխումը բնութագրվել են Hitachi H7600 թափանցող էլեկտրոնային մանրադիտակով (TEM) (Hitachi, Տոկիո, Ճապոնիա), և պատկերները հետագայում վերլուծվել են Hitachi պատկերագրման ծրագրաշարի միջոցով (Hitachi, Տոկիո, Ճապոնիա): Ինսուլինային նանոմասնիկների ինկապսուլյացիայի արդյունավետությունը (EE) և բեռնման հզորությունը (LC) գնահատելու համար նանոմասնիկները պիպետավորվել են ուլտրաֆիլտրացիոն խողովակների մեջ՝ 100 կԴա մոլեկուլային քաշի սահմանային արժեքով և ցենտրիֆուգացվել են 500 xg-ով 30 րոպե: Ֆիլտրատում չինկապսուլացված ինսուլինը քանակականացվել է Agilent 1100 շարքի HPLC համակարգի (Agilent, Սանտա Կլարա, Կալիֆոռնիա, ԱՄՆ) միջոցով, որը բաղկացած է քառորդային պոմպից, ավտոնմուշառիչից, սյունակային տաքացուցիչից և DAD դետեկտոր։ Ինսուլինը վերլուծվել է C18 սյունակով (Zorbax, 3.5 մկմ, 4.6 մմ × 150 մմ, Agilent, ԱՄՆ) և հայտնաբերվել է 214 նմ-ում։ Շարժական փուլը ացետոնիտրիլ և ջուր էր, որը պարունակում էր 0.1% TFA, գրադիենտային հարաբերակցությունը՝ 10/90-ից մինչև 100/0, և աշխատեցվել է 10 րոպե։ Շարժական փուլը մղվել է 1.0 մլ/րոպե հոսքի արագությամբ։ Սյունակի ջերմաստիճանը սահմանվել է 20 °C։ Հաշվարկել EE-ի և LC-ի տոկոսները՝ օգտագործելով (1) հավասարումները և (2) հավասարումը։
Ինսուլինային նանոմասնիկների օպտիմալացման համար փորձարկվել են 2.0-ից մինչև 4.0 տարբեր CS/ինսուլին հարաբերակցություններ: Պատրաստման ընթացքում ավելացվել են CS լուծույթի տարբեր քանակություններ, մինչդեռ ինսուլին/TPP խառնուրդը պահպանվել է հաստատուն: Ինսուլինային նանոմասնիկները պատրաստվել են 4.0-ից մինչև 6.5 pH միջակայքում՝ բոլոր լուծույթները (ինսուլին, TPP և CS) ավելացնելուց հետո խառնուրդի pH-ը ուշադիր վերահսկելով: Ինսուլինային նանոմասնիկների EE-ն և մասնիկների չափը գնահատվել են տարբեր pH արժեքների և CS/ինսուլին զանգվածային հարաբերակցությունների դեպքում՝ ինսուլինային նանոմասնիկների ձևավորումը օպտիմալացնելու համար:
Օպտիմիզացված ինսուլինային նանոմասնիկները տեղադրվեցին ալյումինե տարայի վրա և ծածկվեցին ժապավենով ամրացված անձեռոցիկով։ Այնուհետև պտուտակված տարաները տեղադրվեցին Labconco FreeZone սառեցնող սարքի մեջ (Labconco, Կանզաս Սիթի, Միսսուրի, ԱՄՆ), որը հագեցած էր սկուտեղային չորացնող սարքով։ Չոր ինսուլինային նանոմասնիկներ ստանալու համար ջերմաստիճանը և վակուումային ճնշումը սահմանվեցին -10°C, առաջին 2 ժամվա ընթացքում՝ 0.350 Տոր, իսկ մնացած 22 ժամվա ընթացքում՝ 0°C և 0.120 Տոր։
Ինկապսուլացված ինսուլին ստանալու համար օգտագործվել է Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Ֆլավիլ, Շվեյցարիա) սարքը: Ընտրված չորացման պարամետրերն էին՝ 100 °C ջերմաստիճան, սնուցման հոսք՝ 3 լ/րոպե և գազի հոսք՝ 4 լ/րոպե:
Ինսուլինային նանոմասնիկները ջրազրկումից առաջ և հետո բնութագրվել են FTIR-ATR սպեկտրոսկոպիայի միջոցով: Ջրազրկված նանոմասնիկները, ինչպես նաև ազատ ինսուլինը և քիտոզանը վերլուծվել են Spectrum 100 FTIR սպեկտրոֆոտոմետրի (PerkinElmer, Ուոլթհեմ, Մասաչուսեթս, ԱՄՆ) միջոցով, որը հագեցած է ունիվերսալ ATR նմուշառման պարագաներով (PerkinElmer, Ուոլթհեմ, Մասաչուսեթս, ԱՄՆ): Սիգնալների միջին արժեքները ստացվել են 16 սկանավորումներից՝ 4 սմ2 լուծաչափով, 4000-600 սմ2 հաճախականության տիրույթում:
Չոր ինսուլինային նանոմասնիկների մորֆոլոգիան գնահատվել է Helios NanoLab 650 ֆոկուսացված իոնային փնջով սկանավորող էլեկտրոնային մանրադիտակով (FIB-SEM) ստացված սառեցված և ցողացիրով չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկների ՍԷՄ պատկերների միջոցով (ՍԷՄ): Օգտագործված հիմնական պարամետրը 5 կէՎ լարումն էր և 30 մԱ հոսանքը:
Բոլոր ջրազրկված ինսուլինային նանոմասնիկները վերլուծվել են ջրում։ Մասնիկների չափը, PDI-ն, EE-ն և LC-ն կրկին ստուգվել են նույն մեթոդով՝ ջրազրկումից հետո դրանց որակը գնահատելու համար։ Անհիդրոինսուլինային նանոմասնիկների կայունությունը չափվել է նաև նանոմասնիկների հատկությունները երկարատև պահպանումից հետո ստուգելով։ Այս ուսումնասիրության մեջ ջրազրկումից հետո բոլոր նանոմասնիկները պահվել են սառնարանում երեք ամիս։ Երեք ամիս պահպանումից հետո նանոմասնիկները ստուգվել են մասնիկների ձևաբանական չափի, PDI-ի, EE-ի և LC-ի համար։
Ջրազրկումից հետո նանոմասնիկները պաշտպանելու գործում ինսուլինի արդյունավետությունը գնահատելու համար 5 մլ վերականգնված նանոմասնիկներ լուծեք 45 մլ սիմուլացված ստամոքսային հեղուկի (pH 1.2, պարունակող 1% պեպսին), աղիքային հեղուկի (pH 6.8, պարունակող 1% տրիպսին) կամ քիմոտրիպսինի լուծույթի (100 գ/մլ, ֆոսֆատային բուֆերի մեջ, pH 7.8) մեջ։ Դրանք ինկուբացվել են 37°C ջերմաստիճանում՝ 100 պտ/րոպե խառնման արագությամբ։ Տարբեր ժամանակային կետերում հավաքվել է լուծույթի 500 մկլ, և ինսուլինի կոնցենտրացիան որոշվել է HPLC մեթոդով։
Թարմ պատրաստված և ջրազրկված ինսուլինային նանոմասնիկների in vitro արտազատման վարքագիծը ստուգվել է դիալիզի տոպրակի մեթոդով (մոլեկուլային քաշի սահմանային արժեք՝ 100 կԴա, Spectra Por Inc.): Թարմ պատրաստված և վերականգնված չոր նանոմասնիկները դիալիզացվել են հեղուկներում՝ pH 2.5, pH 6.6 և pH 7.0 արժեքներով (0.1 Մ ֆոսֆատային բուֆերային աղի, PBS)՝ համապատասխանաբար ստամոքսի, տասներկումատնյա աղիքի և վերին բարակ աղիքի pH միջավայրի մոդելավորման համար: Բոլոր նմուշները ինկուբացվել են 37°C ջերմաստիճանում՝ անընդհատ թափահարելով 200 պտ/րոպե: 5 մլ դիալիզի տոպրակից դուրս հեղուկը արտածծել հետևյալ ժամանակներում՝ 0.5, 1, 2, 3, 4 և 6 ժամ, և անմիջապես լրացնել ծավալը թարմ դիալիզատով: Հեղուկում ինսուլինի աղտոտումը վերլուծվել է HPLC մեթոդով, և նանոմասնիկներից ինսուլինի արտազատման արագությունը հաշվարկվել է ազատ ինսուլինի և նանոմասնիկներում պարկուճավորված ընդհանուր ինսուլինի հարաբերակցությունից (հավասարում 3):
Մարդու լյարդի բջջային քաղցկեղի բջջային գծի HepG2 բջիջները աճեցվել են 60 մմ տրամագծով ամանների մեջ՝ օգտագործելով Dulbecco-ի փոփոխված Eagle's Medium (DMEM), որը պարունակում էր 10% պտղի խոշոր եղջերավոր անասունի շիճուկ, 100 IU/մլ պենիցիլին և 100 μg/մլ ստրեպտոմիցին29: Մշակույթները պահպանվել են 37°C ջերմաստիճանում, 95% հարաբերական խոնավության պայմաններում և 5% CO2: Կլանման փորձարկումների համար HepG2 բջիջները ցանվել են 1 × 105 բջիջ/մլ կոնցենտրացիայով 8-խոռոչ Nunc Lab-Tek խցիկային սահիկ համակարգի վրա (Thermo Fisher, NY, ԱՄՆ): Ցիտոտոքսիկության փորձարկումների համար դրանք ցանվել են 96-խոռոչանոց ամանների մեջ (Corning, NY, ԱՄՆ) 5 × 104 բջիջ/մլ խտությամբ:
MTT թեստը կիրառվել է թարմ պատրաստված և ջրազրկված ինսուլինային նանոմասնիկների 30 ցիտոտոքսիկությունը գնահատելու համար: HepG2 բջիջները ցանվել են 96-փոսանի թիթեղների մեջ՝ 5 × 104 բջիջ/մլ խտությամբ և կուլտիվացվել են 7 օր՝ փորձարկումից առաջ: Ինսուլինային նանոմասնիկները նոսրացվել են տարբեր կոնցենտրացիաների (50-ից մինչև 500 մկգ/մլ) կուլտիվ միջավայրում, ապա ներարկվել բջիջներին: 24 ժամ ինկուբացիայից հետո բջիջները 3 անգամ լվացվել են PBS-ով և ինկուբացվել 0.5 մգ/մլ MTT պարունակող միջավայրում՝ ևս 4 ժամ: Ցիտոտոքսիկությունը գնահատվել է՝ չափելով դեղին տետրազոլիումի MTT-ի ֆերմենտատիվ վերականգնումը մանուշակագույն ֆորմազանի 570 նմ-ում Tecan infinite M200 pro սպեկտրոֆոտոմետրի թիթեղի ընթերցող սարքի (Tecan, Männedorf, Շվեյցարիա) միջոցով:
Նանոմասնիկների բջջային կլանման արդյունավետությունը ստուգվել է կոնֆոկալ լազերային սկանավորող մանրադիտակի և հոսքային ցիտոմետրիայի վերլուծության միջոցով: Nunc Lab-Tek խցիկի սահիկ համակարգի յուրաքանչյուր փոսիկ մշակվել է ազատ FITC-ինսուլինով, FITC-ինսուլինով լցված նանոմասնիկներով և վերականգնվել է 25 մկգ/մլ ջրազրկված FITC-ինսուլինային նանոմասնիկներով նույն կոնցենտրացիայով և ինկուբացվել է 4 ժամ: Բջիջները լվացվել են 3 անգամ PBS-ով և ֆիքսվել 4% պարաֆորմալդեհիդով: Միջուկները ներկվել են 4',6-դիամիդինո-2-ֆենիլինդոլով (DAPI): Ինսուլինի տեղայնացումը դիտարկվել է Olympus FV1000 լազերային սկանավորող/երկֆոտոնային կոնֆոկալ մանրադիտակի միջոցով (Olympus, Շինջուկու քաղաք, Տոկիո, Ճապոնիա): Հոսքային ցիտոմետրիայի վերլուծության համար ավելացվել են 10 մկգ/մլ ազատ FITC-ինսուլինի, FITC-ինսուլինով լցված նանոմասնիկների և վերլուծված ջրազրկված FITC-ինսուլինային նանոմասնիկների նույն կոնցենտրացիաները: 96-հոսքանոց թիթեղները ցանվել են HepG2 բջիջներով և ինկուբացվել 4 ժամ։ 4 ժամ ինկուբացիայից հետո բջիջները հեռացվել և լվացվել են 3 անգամ FBS-ով։ Յուրաքանչյուր նմուշում 5 × 104 բջիջները վերլուծվել են BD LSR II հոսքային ցիտոմետրով (BD, Ֆրանկլին Լեյքս, Նյու Ջերսի, ԱՄՆ):
Բոլոր արժեքները արտահայտված են որպես միջին ± ստանդարտ շեղում: Բոլոր խմբերի միջև համեմատությունները գնահատվել են միակողմանի ANOVA-ի կամ IBM SPSS Statistics 26 for Mac-ի (IBM, Endicott, Նյու Յորք, ԱՄՆ) t-թեստի միջոցով, և p < 0.05-ը համարվել է վիճակագրորեն նշանակալի:
Այս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս ցողացիրային չորացման ճկունությունն ու ունակությունը՝ խաչաձև կապված խիտոզան/TPP/ինսուլինի նանոմասնիկներ չորացնելու համար՝ ավելի լավ վերականգնմամբ՝ համեմատած ստանդարտ սառեցնող չորացման մեթոդների հետ՝ օգտագործելով ծավալային նյութեր կամ կրիոպաշտպանիչներ, հզորությամբ և ավելի բարձր բեռնման հզորությամբ: Օպտիմիզացված ինսուլինային նանոմասնիկները տվել են միջին 318 նմ մասնիկի չափ և 99.4% պարկուճացման արդյունավետություն: Ջրազրկումից հետո SEM և FTIR արդյունքները ցույց են տվել, որ գնդաձև կառուցվածքը պահպանվել է միայն ցողացիրային չորացրած նանոմասնիկներում՝ մանիտոլով և առանց դրա, և մանիտոլով լիոֆիլիզացված, սակայն մանիտոլ չպարունակող լիոֆիլիզացված նանոմասնիկները քայքայվել են ջրազրկման ընթացքում: Վերականգնման ունակության թեստում մանիտոլ չպարունակող ցողացիրային չորացրած ինսուլինային նանոմասնիկները ցույց են տվել ամենափոքր միջին մասնիկի չափը և ամենաբարձր բեռնվածությունը վերականգնման ժամանակ: Այս բոլոր ջրազրկված նանոմասնիկների արտազատման վարքագիծը ցույց է տվել, որ դրանք արագորեն արտազատվել են pH = 2.5 և pH = 7 լուծույթներում և շատ կայուն են pH = 6.5 լուծույթում: Համեմատած այլ վերլուծված ջրազրկված նանոմասնիկների հետ՝ Մանիտոլ չպարունակող ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկները ցույց տվեցին ամենաարագ արտազատումը։ Այս արդյունքը համապատասխանում է բջջային կլանման վերլուծության արդյունքում դիտարկված արդյունքին, քանի որ մանիտոլի բացակայության դեպքում ցողացիրով չորացրած նանոմասնիկները գրեթե ամբողջությամբ պահպանել են թարմ պատրաստված նանոմասնիկների բջջային կլանման արդյունավետությունը։ Այս արդյունքները ենթադրում են, որ մանիտոլ չպարունակող ցողացիրով չորացման միջոցով պատրաստված չոր ինսուլինի նանոմասնիկները առավել հարմար են այլ անջուր դեղաչափային ձևերի, ինչպիսիք են բանավոր դեղահաբերը կամ կենսակպչուն թաղանթները, հետագա մշակման համար։
Մտավոր սեփականության հետ կապված խնդիրների պատճառով, ընթացիկ ուսումնասիրության ընթացքում ստեղծված և/կամ վերլուծված տվյալների հավաքածուները հրապարակայնորեն մատչելի չեն, սակայն հասանելի են համապատասխան հեղինակներից՝ ողջամիտ պահանջի դեպքում։
Կագան, Ա. 2-րդ տիպի շաքարախտ. սոցիալական և գիտական ​​ծագում, բժշկական բարդություններ և հետևանքներ հիվանդների և ուրիշների համար (ՄաքՖարլեյն, 2009):
Սինգհ, Ա.Պ., Գուո, Յ., Սինգհ, Ա., Շիե, Վ. և Ջիանգ, Պ. Ինսուլինի պատիճավորման զարգացումը. հնարավո՞ր է արդյոք բերանացի ընդունումը հիմա: J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019):
Վոնգ, Ս.Յ., Ալ-Սալամի, Հ. և Դաս, Ս.Ռ. Շաքարային դիաբետի բուժման համար ինսուլինով լցված լիպոսոմային ներարկման համակարգերի վերջին նվաճումները: Interpretation.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018):