Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի CSS-ի սահմանափակ աջակցություն: Լավագույն արդյունքի հասնելու համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել ձեր դիտարկիչի ավելի նոր տարբերակը (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչ այդ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը ցուցադրում ենք առանց ոճավորման կամ JavaScript-ի:
Պրոպիոնաթթուն (ՊԱԹ) օգտագործվում է նյարդա-զարգացման խանգարումների, ինչպիսին է աուտիզմի սպեկտրի խանգարումը, մեջ միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի դերը ուսումնասիրելու համար: Հայտնի է, որ ՊԱԹ-ն խաթարում է միտոքոնդրիալ կենսագենեզը, նյութափոխանակությունը և շրջանառությունը: Այնուամենայնիվ, ՊԱԹ-ի ազդեցությունը միտոքոնդրիալ դինամիկայի, ճեղքման և միաձուլման վրա մնում է խնդրահարույց՝ այս մեխանիզմների բարդ ժամանակային բնույթի պատճառով: Այստեղ մենք օգտագործում ենք լրացուցիչ քանակական պատկերման մեթոդներ՝ ուսումնասիրելու համար, թե ինչպես է ՊԱԹ-ն ազդում միտոքոնդրիալ ուլտրակառուցվածքի, ձևաբանության և դինամիկայի վրա նեյրոնանման SH-SY5Y բջիջներում: ՊԱԹ-ն (5 մՄ) առաջացրել է միտոքոնդրիալ մակերեսի (p < 0.01), Ֆերետի տրամագծի և շրջագծի (p < 0.05) և մակերես 2-ի (p < 0.01) զգալի նվազում: Միտոքոնդրիալ իրադարձությունների լոկատորի վերլուծությունը ցույց է տվել ճեղքման և միաձուլման իրադարձությունների զգալի աճ (p < 0.05), այդպիսով պահպանելով միտոքոնդրիալ ցանցի ամբողջականությունը սթրեսային պայմաններում: Բացի այդ, cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) և OPA1 (p < 0.05) mRNA արտահայտությունը զգալիորեն նվազել է։ (01): Սա ցույց է տալիս միտոքոնդրիալ ձևաբանության, կենսագենեզի և դինամիկայի վերակառուցումը՝ սթրեսի պայմաններում գործառույթը պահպանելու համար: Մեր տվյալները նոր պատկերացում են տալիս PPA-ի միտոքոնդրիալ դինամիկայի վրա ազդեցության մասին և ընդգծում են պատկերագրական տեխնիկայի օգտակարությունը միտոքոնդրիալ սթրեսային արձագանքներում ներգրավված բարդ կարգավորիչ մեխանիզմներն ուսումնասիրելու համար:
Միտոքոնդրիաները էներգիայի արտադրության և կենսասինթեզի իրենց բնորոշ դերերից զատ, բազմաթիվ բջջային գործառույթների անբաժանելի մասն են կազմում: Միտոքոնդրիալ նյութափոխանակությունը կալցիումի ազդանշանային, նյութափոխանակության և օքսիդա-վերականգնման հոմեոստազի, բորբոքային ազդանշանային, էպիգենետիկ փոփոխությունների, բջիջների բազմացման, դիֆերենցիացիայի և ծրագրավորված բջջային մահվան հիմնական կարգավորիչն է1: Մասնավորապես, միտոքոնդրիալ նյութափոխանակությունը կարևոր է նեյրոնների զարգացման, գոյատևման և գործառույթի համար և լայնորեն ներգրավված է նյարդապաթոլոգիայի տարբեր դրսևորումներում2,3,4:
Վերջին տասնամյակի ընթացքում նյութափոխանակության վիճակը դարձել է նեյրոգենեզի, դիֆերենցիացիայի, հասունացման և պլաստիկության կենտրոնական կարգավորիչ5,6: Վերջերս միտոքոնդրիալ ձևաբանությունն ու դինամիկան դարձել են միտոզի, որը դինամիկ գործընթաց է, որը պահպանում է առողջ միտոքոնդրիաների պաշար բջիջների ներսում, հատկապես կարևոր բաղադրիչներ: Միտոքոնդրիալ դինամիկան կարգավորվում է բարդ փոխկախված ուղիներով՝ սկսած միտոքոնդրիալ կենսագենեզից և կենսաէներգետիկայից մինչև միտոքոնդրիալ բաժանում, միաձուլում, տեղափոխում և մաքրում7,8: Այս ինտեգրատիվ մեխանիզմներից որևէ մեկի խափանումը խաթարում է առողջ միտոքոնդրիալ ցանցերի պահպանումը և խորը ֆունկցիոնալ հետևանքներ ունի նյարդային զարգացման համար9,10: Իրոք, միտոքոնդրիալ դինամիկայի դիսռեգուլյացիան նկատվում է բազմաթիվ հոգեբուժական, նեյրոդեգեներատիվ և նեյրոզարգացման խանգարումների, այդ թվում՝ աուտիզմի սպեկտրի խանգարումների (ԱՍԽ) դեպքում11,12:
ԱՍԽ-ն տարասեռ նյարդա-զարգացման խանգարում է՝ բարդ գենետիկական և էպիգենետիկ ճարտարապետությամբ։ ԱՍԽ-ի ժառանգականությունը անվիճելի է, սակայն հիմքում ընկած մոլեկուլային պատճառաբանությունը մնում է վատ հասկացված։ Նախակլինիկական մոդելներից, կլինիկական ուսումնասիրություններից և բազմակի մոլեկուլային տվյալների հավաքածուներից կուտակվող տվյալները ԱՍԽ-ի դեպքում միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի ավելի ու ավելի շատ ապացույցներ են տրամադրում13,14։ Մենք նախկինում ԱՍԽ-ով հիվանդների խմբի մոտ անցկացրել ենք գենոմի լայնածավալ ԴՆԹ մեթիլացման սկրինինգ և հայտնաբերել ենք միտոքոնդրիալ նյութափոխանակության ուղիների երկայնքով խմբավորված տարբերակված մեթիլացված գեներ15։ Հետագայում մենք հաղորդել ենք միտոքոնդրիալ կենսագենեզի և դինամիկայի կենտրոնական կարգավորիչների տարբերակված մեթիլացման մասին, որը կապված էր միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի պատճենների քանակի աճի և ԱՍԽ-ի դեպքում միզուղիների նյութափոխանակության պրոֆիլի փոփոխության հետ16։ Մեր տվյալները ավելի ու ավելի շատ ապացույցներ են տրամադրում, որ միտոքոնդրիալ դինամիկան և հոմեոստազը կենտրոնական դեր են խաղում ԱՍԽ-ի պաթոֆիզիոլոգիայում։ Հետևաբար, միտոքոնդրիալ դինամիկայի, ձևաբանության և ֆունկցիայի միջև փոխհարաբերության մեխանիստական ​​​​հասկացողության բարելավումը երկրորդային միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայով բնութագրվող նյարդաբանական հիվանդությունների շարունակական հետազոտությունների հիմնական նպատակն է։
Մոլեկուլային մեթոդները հաճախ օգտագործվում են միտոքոնդրիալ սթրեսային արձագանքներում որոշակի գեների դերը ուսումնասիրելու համար: Այնուամենայնիվ, այս մոտեցումը կարող է սահմանափակվել միտոտիկ կառավարման մեխանիզմների բազմակողմանի և ժամանակային բնույթով: Ավելին, միտոքոնդրիալ գեների դիֆերենցիալ արտահայտությունը ֆունկցիոնալ փոփոխությունների անուղղակի ցուցիչ է, հատկապես այն պատճառով, որ սովորաբար վերլուծվում է միայն սահմանափակ թվով գեների: Հետևաբար, առաջարկվել են միտոքոնդրիալ ֆունկցիայի և կենսաէներգետիկայի ուսումնասիրության ավելի ուղղակի մեթոդներ17: Միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը սերտորեն կապված է միտոքոնդրիալ դինամիկայի հետ: Միտոքոնդրիալ ձևը, կապակցվածությունը և կառուցվածքը կարևոր են էներգիայի արտադրության, միտոքոնդրիալների և բջիջների գոյատևման համար5,18: Ավելին, միտոզի տարբեր բաղադրիչները կենտրոնանում են միտոքոնդրիալ ձևաբանության փոփոխությունների վրա, որոնք կարող են ծառայել որպես միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի օգտակար վերջնակետեր և հիմք հանդիսանալ հետագա մեխանիստական ​​ուսումնասիրությունների համար:
Միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը կարող է անմիջականորեն դիտարկվել փոխանցման էլեկտրոնային մանրադիտակի (TEM) միջոցով, որը թույլ է տալիս մանրամասն ուսումնասիրել բջջային ուլտրակառուցվածքը: TEM-ը անմիջականորեն պատկերացնում է միտոքոնդրիալ կրիստաների ձևաբանությունը, ձևը և կառուցվածքը առանձին միտոքոնդրիաների լուծաչափով, այլ ոչ թե միայն հույսը դնում գեների տրանսկրիպցիայի, սպիտակուցի արտահայտման կամ բջջային պոպուլյացիաներում միտոքոնդրիալ ֆունկցիոնալ պարամետրերի վրա17,19,20: Բացի այդ, TEM-ը նպաստում է միտոքոնդրիաների և այլ օրգանոիդների, ինչպիսիք են էնդոպլազմային ցանցը և աուտոֆագոսոմները, միջև փոխազդեցությունների ուսումնասիրությանը, որոնք կարևոր դեր են խաղում միտոքոնդրիալ ֆունկցիայի և հոմեոստազի մեջ21,22: Այսպիսով, սա TEM-ը դարձնում է լավ մեկնարկային կետ միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան ուսումնասիրելու համար, նախքան որոշակի ուղիների կամ գեների վրա կենտրոնանալը: Քանի որ միտոքոնդրիալ ֆունկցիան ավելի ու ավելի է կարևորվում նյարդապաթոլոգիայի համար, կա հստակ անհրաժեշտություն՝ կարողանալու անմիջականորեն և քանակապես ուսումնասիրել միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը և դինամիկան in vitro նեյրոնային մոդելներում:
Այս հոդվածում մենք ուսումնասիրում ենք միտոքոնդրիալ դինամիկան աուտիզմի սպեկտրի խանգարման դեպքում միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի նեյրոնային մոդելում: Մենք նախկինում հաղորդել ենք պրոպիոնիլ-CoA կարբօքսիլազ բետայի (PCCB) դիֆերենցիալ մեթիլացման մասին ASD15-ում, որը միտոքոնդրիալ պրոպիոնիլ-CoA կարբօքսիլազ ֆերմենտի PCC ենթամիավոր է: PCC-ի դիսռեգուլյացիան հայտնի է պրոպիոնիլ ածանցյալների, այդ թվում՝ պրոպիոնաթթվի (PPA) թունավոր կուտակման պատճառ դառնալով23,24,25: PPA-ն, ինչպես ցույց է տրվել, խաթարում է նեյրոնային նյութափոխանակությունը և փոխում վարքագիծը in vivo և հանդիսանում է հաստատված կենդանական մոդել ASD-ի հետ կապված նյարդազարգացման մեխանիզմների ուսումնասիրման համար26,27,28: Բացի այդ, PPA-ն, ինչպես հաղորդվել է, խաթարում է միտոքոնդրիալ թաղանթային պոտենցիալը, կենսագենեզը և շնչառությունը in vitro պայմաններում և լայնորեն օգտագործվել է նեյրոններում միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան մոդելավորելու համար29,30: Այնուամենայնիվ, PPA-ի առաջացրած միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի ազդեցությունը միտոքոնդրիալ ձևաբանության և դինամիկայի վրա դեռևս լավ հասկանալի չէ:
Այս ուսումնասիրությունը օգտագործում է լրացուցիչ պատկերագրման մեթոդներ՝ SH-SY5Y բջիջներում միտոքոնդրիալ ձևաբանության, դինամիկայի և ֆունկցիայի վրա PPA-ի ազդեցությունը քանակականացնելու համար: Նախ, մենք մշակեցինք TEM մեթոդ՝ միտոքոնդրիալ ձևաբանության և ուլտրակառուցվածքի փոփոխությունները պատկերելու համար17,31,32: Հաշվի առնելով միտոքոնդրիաների դինամիկ բնույթը33, մենք նաև օգտագործեցինք միտոքոնդրիալ իրադարձությունների տեղորոշիչի (MEL) վերլուծություն՝ PPA սթրեսի տակ ճեղքման և միաձուլման իրադարձությունների, միտոքոնդրիալների քանակի և ծավալի միջև հավասարակշռության փոփոխությունները քանակականացնելու համար: Վերջապես, մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը և դինամիկան կապված են կենսագենեզի, ճեղքման և միաձուլման մեջ ներգրավված գեների արտահայտման փոփոխությունների հետ: Միասին վերցրած, մեր տվյալները ցույց են տալիս միտոքոնդրիալ դինամիկան կարգավորող մեխանիզմների բարդությունը պարզաբանելու մարտահրավերը: Մենք ընդգծում ենք TEM-ի օգտակարությունը միտոքոնդրիալ ձևաբանության ուսումնասիրության մեջ՝ որպես SH-SY5Y բջիջներում միտոզի չափելի կոնվերգենտ վերջնակետ: Բացի այդ, մենք ընդգծում ենք, որ TEM տվյալները ամենահարուստ տեղեկատվությունն են տրամադրում պատկերագրման տեխնիկաների հետ համատեղ, որոնք նաև գրանցում են դինամիկ իրադարձությունները՝ ի պատասխան նյութափոխանակության սթրեսի: Նեյրոնային բջիջների միտոզը սատարող մոլեկուլային կարգավորիչ մեխանիզմների հետագա բնութագրումը կարող է կարևոր պատկերացում տալ նյարդային համակարգի միտոքոնդրիալ բաղադրիչի և նեյրոդեգեներատիվ հիվանդությունների վերաբերյալ։
Միտոքոնդրիալ սթրես առաջացնելու համար SH-SY5Y բջիջները մշակվել են PPA-ով՝ օգտագործելով 3 մՄ և 5 մՄ նատրիումի պրոպիոնատ (NaP): TEM-ից առաջ նմուշները ենթարկվել են կրիոգեն նմուշի պատրաստման՝ օգտագործելով բարձր ճնշման սառեցում և սառեցում (Նկար 1ա): Մենք մշակել ենք միտոքոնդրիալ պատկերի վերլուծության ավտոմատացված խողովակաշար՝ միտոքոնդրիալ պոպուլյացիաների ութ ձևաբանական պարամետրերը չափելու համար երեք կենսաբանական կրկնօրինակների միջոցով: Մենք պարզել ենք, որ PPA մշակումը զգալիորեն փոխել է չորս պարամետրեր՝ մակերես 2, մակերես, պարագիծ և Ֆերեի տրամագիծ (Նկար 1բ-ե): Մակերես 2-ը զգալիորեն նվազել է ինչպես 3 մՄ, այնպես էլ 5 մՄ PPA մշակման դեպքում (համապատասխանաբար p = 0.0183 և p = 0.002) (Նկար 1բ), մինչդեռ մակերեսը (p = 0.003), պարագիծը (p = 0.0106) և Ֆերեի տրամագիծը բոլորը զգալիորեն նվազել են: 5 մՄ մշակման խմբում նշանակալի նվազում է գրանցվել (p = 0.0172)՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ (Նկար 1գ-ե): Մակերեսի և շրջագծի զգալի կրճատումները ցույց տվեցին, որ 5 մՄ PPA-ով մշակված բջիջներն ունեին ավելի փոքր, ավելի կլոր միտոքոնդրիաներ, և որ այդ միտոքոնդրիաները պակաս երկարացված էին, քան վերահսկիչ բջիջներում: Սա նաև համապատասխանում է Ֆերեի տրամագծի զգալի նվազմանը, որը անկախ պարամետր է, որը ցույց է տալիս մասնիկների եզրերի միջև ամենամեծ հեռավորության նվազումը: Նկատվել են կրիստաների ուլտրակառուցվածքի փոփոխություններ. կրիստաները դարձել են ավելի քիչ արտահայտված PPA լարվածության ազդեցության տակ (Նկար 1ա, վահանակ B): Այնուամենայնիվ, ոչ բոլոր պատկերներն են հստակ արտացոլում կրիստաների ուլտրակառուցվածքը, ուստի այս փոփոխությունների քանակական վերլուծություն չի իրականացվել: Այս TEM տվյալները կարող են արտացոլել երեք հնարավոր սցենար. (1) PPA-ն ուժեղացնում է բաժանումը կամ կանխում է միաձուլումը՝ առաջացնելով առկա միտոքոնդրիաների չափի փոքրացում. (2) ուժեղացված կենսագենեզը ստեղծում է նոր, ավելի փոքր միտոքոնդրիաներ կամ (3) միաժամանակ առաջացնում է երկու մեխանիզմները: Չնայած այս պայմանները չեն կարող տարբերակվել TEM-ով, նշանակալի ձևաբանական փոփոխությունները ցույց են տալիս միտոքոնդրիալ հոմեոստազի և դինամիկայի փոփոխություններ PPA լարվածության տակ: Հետագայում մենք ուսումնասիրեցինք լրացուցիչ պարամետրեր՝ այս դինամիկան և դրանց հիմքում ընկած պոտենցիալ մեխանիզմները ավելի մանրամասն բնութագրելու համար:
Պրոպիոնաթթուն (PPA) վերակառուցում է միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը: (ա) Ներկայացուցչական փոխանցման էլեկտրոնային մանրադիտակի (TEM) պատկերներ, որոնք ցույց են տալիս, որ միտոքոնդրիալների չափը նվազում է, և միտոքոնդրիաները դառնում են ավելի փոքր և կլոր՝ PPA-ի մշակման ավելացման հետ մեկտեղ. համապատասխանաբար 0 մՄ (չմշակված), 3 մՄ և 5 մՄ: Կարմիր նետերը ցույց են տալիս միտոքոնդրիաները: (բ–ե) PPA-ով 24 ժամ մշակված SH-SY5Y բջիջները պատրաստվել են TEM-ի համար, և արդյունքները վերլուծվել են Fiji/ImageJ-ի միջոցով: Ութ պարամետրերից չորսը ցույց են տվել նշանակալի տարբերություններ վերահսկիչ (չմշակված, 0 մՄ PPA) և մշակված (3 մՄ և 5 մՄ PPA) բջիջների միջև: (բ) Շրջան 2, (գ) Մակերես, (դ) Պարագիծ, (ե) Ֆերետի տրամագիծ: Տարբերությունների միակողմանի վերլուծությունը (վերահսկիչ vs բուժում) և Դաննեթի բազմակի համեմատական ​​թեստը օգտագործվել են նշանակալի տարբերությունները որոշելու համար (p < 0.05): Տվյալների կետերը ներկայացնում են յուրաքանչյուր առանձին բջջի միջին միտոքոնդրիալ արժեքը, իսկ սխալի սյուները՝ միջին ± SEM: Ներկայացված տվյալները ներկայացնում են n = 3, առնվազն 24 բջիջ մեկ կրկնօրինակում: Ընդհանուր առմամբ վերլուծվել է 266 պատկեր. * նշանակում է p < 0.05, ** նշանակում է p < 0.01:
Միտոքոնդրիալ դինամիկայի PPA-ին արձագանքի ավելի մանրամասն բնութագրման համար մենք միտոքոնդրիաները ներկեցինք տետրամեթիլռոդամինի էթիլ էսթերով (TMRE) և օգտագործեցինք ժամանակի լապսային մանրադիտակ և MEL վերլուծություն՝ 3 և 5 մՄ PPA-ով 24 ժամ անց միտոքոնդրիաները տեղայնացնելու և քանակականացնելու համար: Բեկման և միաձուլման իրադարձությունների մշակում: (Նկար 2ա): MEL վերլուծությունից հետո միտոքոնդրիաները հետագայում վերլուծվեցին՝ միտոքոնդրիալ կառուցվածքների քանակը և դրանց միջին ծավալը քանակականացնելու համար: Մենք նկատեցինք 3 մՄ-ի դեպքում տեղի ունեցող բաժանման իրադարձությունների քանակի փոքր, բայց նշանակալի աճ [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)]՝ համեմատած բաժանման [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] և միաձուլման [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] և միաձուլման [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] իրադարձությունների հետ, որոնք զգալիորեն ավելացել էին 5 մՄ-ի դեպքում՝ համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ (Նկար 3բ): Միտոքոնդրիաների քանակը զգալիորեն աճել է և՛ 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)], և՛ 5 մՄ [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] դեպքում (Նկար 3գ), մինչդեռ յուրաքանչյուր միտոքոնդրիալ կառուցվածքի միջին ծավալը մնացել է անփոփոխ (Նկար 3գ): 3դ): Ամփոփելով՝ սա ենթադրում է, որ միտոքոնդրիալ դինամիկայի վերակառուցումը ծառայում է որպես փոխհատուցող արձագանք, որը հաջողությամբ պահպանում է միտոքոնդրիալ ցանցի ամբողջականությունը: 3 մՄ PPA-ի դեպքում ճեղքման իրադարձությունների թվի աճը ենթադրում է, որ միտոքոնդրիալների թվի աճը մասամբ պայմանավորված է միտոքոնդրիալ ճեղքով, բայց հաշվի առնելով, որ միտոքոնդրիալների միջին ծավալը մնում է էապես անփոփոխ, կենսագենեզը չի կարող բացառվել որպես լրացուցիչ փոխհատուցող արձագանք: Այնուամենայնիվ, այս տվյալները համապատասխանում են TEM-ով դիտարկված ավելի փոքր, կլոր միտոքոնդրիալ կառուցվածքներին և նաև ցույց են տալիս PPA-ի կողմից առաջացած միտոքոնդրիալ դինամիկայի զգալի փոփոխություններ:
Պրոպիոնաթթուն (PPA) առաջացնում է դինամիկ միտոքոնդրիալ վերակառուցում՝ ցանցի ամբողջականությունը պահպանելու համար: SH-SY5Y բջիջները կուլտիվացվել են, մշակվել 3 և 5 մՄ PPA-ով 24 ժամ և ներկվել TMRE-ով և Hoechst 33342-ով, որին հաջորդել է MEL վերլուծությունը: (ա) Ներկայացուցչական ժամանակային լապսային մանրադիտակի պատկերներ, որոնք պատկերում են գունավոր և երկուականացված առավելագույն ինտենսիվության պրոյեկցիաներ 2-րդ ժամանակում (t2) յուրաքանչյուր պայմանի համար: Յուրաքանչյուր երկուական պատկերում նշված ընտրված շրջանները բարելավված են և ցուցադրվում են 3D-ով երեք տարբեր ժամանակային շրջանակներում (t1-t3)՝ ժամանակի ընթացքում դինամիկան պատկերելու համար. միաձուլման իրադարձությունները ընդգծված են կանաչով. ճեղքման իրադարձությունները ընդգծված են կանաչով: Ցուցադրվում է կարմիրով: (բ) Դինամիկ իրադարձությունների միջին քանակը մեկ պայմանի համար: (գ) Միտոքոնդրիալ կառուցվածքների միջին քանակը մեկ բջջի համար: (դ) Յուրաքանչյուր միտոքոնդրիալ կառուցվածքի միջին ծավալը (μm3) մեկ բջջի համար: Ներկայացված տվյալները ներկայացնում են n = 15 բջիջ մեկ բուժման խմբի համար: Ներկայացված սխալի սյուները ներկայացնում են միջին ± SEM, սանդղակի սյուն = 10 μm, * p < 0.05:
Պրոպիոնիկ թթուն (PPA) առաջացնում է միտոքոնդրիալ դինամիկայի հետ կապված գեների տրանսկրիպցիոն ճնշում: SH-SY5Y բջիջները մշակվել են 3 և 5 մՄ PPA-ով 24 ժամ: Հարաբերական գեների քանակական որոշումը կատարվել է RT-qPCR-ի միջոցով և նորմալացվել է B2M-ի: Միտոքոնդրիալ կենսագենեզի գեներ (ա) cMYC, (բ) TFAM, (գ) NRF1 և (դ) NFE2L2: Միտոքոնդրիալ միաձուլման և բաժանման գեներ (ե) STOML2, (զ) OPA1, (գ) MFN1, (ը) MFN2 և (թ) DRP1: Նշանակալի տարբերությունները (p < 0.05) ստուգվել են միակողմանի ANOVA-ի (վերահսկողություն ընդդեմ բուժման) և Դաննեթի բազմակի համեմատության թեստի միջոցով. * ​​նշանակում է p < 0.05, ** նշանակում է p < 0.01, իսկ **** նշանակում է p < 0.0001: Սյուները ներկայացնում են միջին էքսպրեսիան ± SEM: Ներկայացված տվյալները ներկայացնում են n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) և n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) կենսաբանական կրկնօրինակներ։
TEM և MEL վերլուծությունների տվյալները միասին ցույց են տալիս, որ PPA-ն փոխում է միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը և դինամիկան: Այնուամենայնիվ, այս պատկերագրական մեթոդները չեն տալիս պատկերացում այս գործընթացները խթանող հիմքում ընկած մեխանիզմների մասին: Հետևաբար, մենք ուսումնասիրեցինք միտոքոնդրիալ դինամիկայի, կենսագենեզի և միտոզի ինը հիմնական կարգավորիչների mRNA արտահայտությունը PPA-ով բուժմանը ի պատասխան: Մենք քանակականացրեցինք բջջային միելոմայի օնկոգենը (cMYC), միջուկային շնչառական գործոնը (NRF1), միտոքոնդրիալ տրանսկրիպցիոն գործոն 1-ը (TFAM), NFE2-անման տրանսկրիպցիոն գործոն BZIP-ը (NFE2L2), գաստրինանման սպիտակուց 2-ը (STOML2), տեսողական նյարդի ատրոֆիա 1-ը (OPA1), միտոֆուսին 1-ը (MFN1), միտոֆուսին 2-ը (MFN2) և դինամին-կապված սպիտակուց 1-ը (DRP1) 3 մՄ և 5 մՄ PPA-ով 24 ժամվա բուժումից հետո: Մենք դիտարկել ենք PPA-ով բուժման 3 մՄ (p = 0.0053, p = 0.0415 և p < 0.0001, համապատասխանաբար) և 5 մՄ (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) ցուցանիշներ (Նկար 3ա-գ): mRNA-ի արտահայտման նվազումը դեղաչափից կախված էր. cMYC-ի, NRF1-ի և TFAM-ի արտահայտումը նվազել է համապատասխանաբար 5.7, 2.6 և 1.9 անգամ 3 մՄ-ի դեպքում, և 11.2, 3 և 2.2 անգամ 5 մՄ-ի դեպքում: Ի տարբերություն դրա, կենտրոնական օքսիդա-վերականգնման կենսագենեզի NFE2L2 գենը չի փոփոխվել PPA-ի որևէ կոնցենտրացիայի դեպքում, չնայած դիտվել է արտահայտման նվազման նմանատիպ դեղաչափից կախված միտում (Նկար 3դ):
Մենք նաև ուսումնասիրեցինք բաժանման և միաձուլման կարգավորմանը մասնակցող դասական գեների արտահայտությունը: Ենթադրվում է, որ STOML2-ը մասնակցում է միաձուլմանը, միտոֆագիային և կենսագենեզին, և դրա արտահայտությունը զգալիորեն նվազել է (p < 0.0001)՝ 3 մՄ (2.4 անգամ փոփոխություն) և 5 մՄ (2.8 անգամ փոփոխություն) PPA-ով (Նկար 1): 3դ): Նմանապես, OPA1 միաձուլման գենի արտահայտությունը նվազել է 3 մՄ (1.6 անգամ փոփոխություն) և 5 մՄ (1.9 անգամ փոփոխություն) PPA-ով (համապատասխանաբար p = 0.006 և p = 0.0024) (Նկար 3զ): Այնուամենայնիվ, մենք նշանակալի տարբերություններ չհայտնաբերեցինք MFN1, MFN2 կամ բաժանման գեն DRP1 միաձուլման գեների 24-ժամյա PPA սթրեսի տակ արտահայտման մեջ (Նկար 3գ-ի): Բացի այդ, մենք պարզեցինք, որ չորս միաձուլման և բաժանման սպիտակուցների (OPA1, MFN1, MFN2 և DRP1) մակարդակները չեն փոխվել նույն պայմաններում (Նկար 4ա-դ): Կարևոր է նշել, որ այս տվյալները արտացոլում են ժամանակի մեկ կետ և կարող են չարտացոլել սպիտակուցի արտահայտման կամ ակտիվության մակարդակի փոփոխությունները PPA սթրեսի վաղ փուլերում: Այնուամենայնիվ, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 և OPA1 արտահայտման զգալի նվազումները վկայում են միտոքոնդրիալ նյութափոխանակության, կենսագենեզի և դինամիկայի զգալի տրանսկրիպցիոն դիսռեգուլյացիայի մասին: Բացի այդ, այս տվյալները ընդգծում են պատկերագրական տեխնիկայի օգտակարությունը միտոքոնդրիալ ֆունկցիայի վերջնական վիճակի փոփոխությունները անմիջականորեն ուսումնասիրելու համար:
Պրոպիոնաթթվով (PPA) մշակումից հետո միաձուլման և բաժանման գործոնի սպիտակուցի մակարդակները չեն փոխվել: SH-SY5Y բջիջները մշակվել են 3 և 5 մՄ PPA-ով 24 ժամ: Սպիտակուցի մակարդակները քանակականացվել են Western blot վերլուծության միջոցով, և արտահայտման մակարդակները նորմալացվել են ընդհանուր սպիտակուցի նկատմամբ: Ներկայացված են սպիտակուցի միջին արտահայտումը և թիրախային և ընդհանուր սպիտակուցի ներկայացուցչական Western blots-երը: a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1: Սյուները ներկայացնում են միջին ± SEM, և ներկայացված տվյալները ներկայացնում են n = 3 կենսաբանական կրկնօրինակները: Բազմակի համեմատություններ (p < 0.05) կատարվել են միակողմանի դիսպերսիայի վերլուծության և Դաննետի թեստի միջոցով: Սկզբնական գելը և բլոտը ներկայացված են նկար S1-ում:
Միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան կապված է բազմահամակարգային հիվանդությունների հետ՝ սկսած նյութափոխանակության, սրտանոթային և մկանային հիվանդություններից մինչև նյարդաբանական հիվանդություններ1,10: Շատ նեյրոդեգեներատիվ և նեյրոդեգեներատիվ հիվանդություններ կապված են միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի հետ, ինչը ընդգծում է այս օրգանոիդների կարևորությունը ուղեղի ողջ կյանքի ընթացքում: Այս հիվանդությունների թվում են Պարկինսոնի հիվանդությունը, Ալցհայմերի հիվանդությունը և ԱՍԽ-ն3,4,18: Այնուամենայնիվ, այս հիվանդությունները ուսումնասիրելու համար ուղեղի հյուսվածքին հասանելիությունը դժվար է, հատկապես մեխանիստական ​​մակարդակում, ինչը բջջային մոդելային համակարգերը դարձնում է անհրաժեշտ այլընտրանք: Այս ուսումնասիրության մեջ մենք օգտագործում ենք PPA-ով մշակված SH-SY5Y բջիջներ օգտագործող բջջային մոդելային համակարգ՝ նեյրոնային հիվանդությունների, մասնավորապես՝ աուտիզմի սպեկտրի խանգարումների դեպքում դիտարկվող միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան ամփոփելու համար: Այս PPA մոդելի օգտագործումը նեյրոններում միտոքոնդրիալ դինամիկան ուսումնասիրելու համար կարող է պատկերացում տալ ԱՍԽ-ի պատճառաբանության մասին:
Մենք ուսումնասիրեցինք միտոքոնդրիալ ձևաբանության փոփոխությունները դիտարկելու համար TEM-ի օգտագործման հնարավորությունը: Կարևոր է նշել, որ TEM-ը պետք է ճիշտ օգտագործվի՝ դրա արդյունավետությունը մեծացնելու համար: Կրիո-նմուշների պատրաստումը թույլ է տալիս ավելի լավ պահպանել նեյրոնային կառուցվածքները՝ միաժամանակ ֆիքսելով բջջային բաղադրիչները և նվազեցնելով արտեֆակտների առաջացումը34: Համապատասխանաբար, մենք նկատեցինք, որ նեյրոնանման SH-SY5Y բջիջներն ունեին ամբողջական ենթաբջջային օրգանոիդներ և երկարացված միտոքոնդրիաներ (Նկար 1ա): Սա ընդգծում է կրիոգեն պատրաստման տեխնիկայի օգտակարությունը նեյրոնային բջջային մոդելներում միտոքոնդրիալ ձևաբանության ուսումնասիրման համար: Չնայած քանակական չափումները կարևոր են TEM տվյալների օբյեկտիվ վերլուծության համար, դեռևս չկա կոնսենսուս այն մասին, թե որ կոնկրետ պարամետրերը պետք է չափվեն միտոքոնդրիալ ձևաբանական փոփոխությունները հաստատելու համար: Հիմնվելով միտոքոնդրիալ ձևաբանության քանակական ուսումնասիրության բազմաթիվ ուսումնասիրությունների վրա17,31,32, մենք մշակեցինք միտոքոնդրիալ պատկերի վերլուծության ավտոմատացված խողովակաշար, որը չափում է ութ ձևաբանական պարամետրեր, մասնավորապես՝ մակերես, մակերես2, ասպեկտի հարաբերակցություն, պարագիծ, շրջանաձևություն, աստիճան, Ֆերեի տրամագիծ և կլորություն:
Դրանց թվում, PPA-ն զգալիորեն նվազեցրել է մակերեսը 2, մակերեսը, պարագիծը և Ֆերեի տրամագիծը (Նկ. 1բ-ե): Սա ցույց է տվել, որ միտոքոնդրիաները դարձել են ավելի փոքր և ավելի կլոր, ինչը համապատասխանում է նախորդ ուսումնասիրություններին, որոնք ցույց են տվել միտոքոնդրիալ մակերեսի նվազում PPA30-ի կողմից առաջացած միտոքոնդրիալ սթրեսից 72 ժամ հետո: Այս ձևաբանական առանձնահատկությունները կարող են վկայել միտոքոնդրիալ ճեղքման մասին, որը անհրաժեշտ գործընթաց է միտոքոնդրիալ ցանցից վնասված բաղադրիչները առանձնացնելու և դրանց քայքայումը խթանելու համար միտոֆագիայի միջոցով35,36,37: Մյուս կողմից, միտոքոնդրիալ միջին չափի նվազումը կարող է կապված լինել կենսագենեզի աճի հետ, ինչը հանգեցնում է փոքր նորաստեղծ միտոքոնդրիաների ձևավորմանը: Ճեղքման կամ կենսագենեզի աճը ներկայացնում է փոխհատուցող արձագանք՝ միտոքոնդրիալ սթրեսի դեմ միտոզը պահպանելու համար: Այնուամենայնիվ, միտոքոնդրիալ աճի նվազումը, միաձուլման խանգարումը կամ այլ պայմաններ չեն կարող բացառվել:
Չնայած TEM-ի միջոցով ստեղծված բարձր թույլտվությամբ պատկերները թույլ են տալիս որոշել ձևաբանական բնութագրերը առանձին միտոքոնդրիաների մակարդակում, այս մեթոդը ստեղծում է երկչափ լուսանկարներ ժամանակի մեկ կետում: Մետաբոլիկ սթրեսի նկատմամբ դինամիկ արձագանքները ուսումնասիրելու համար մենք ներկեցինք միտոքոնդրիաները TMRE-ով և օգտագործեցինք ժամանակի լապսային մանրադիտակ MEL վերլուծությամբ, որը թույլ է տալիս ժամանակի ընթացքում միտոքոնդրիալ ցանցի փոփոխությունների բարձր թողունակությամբ 3D վիզուալիզացիա 33,38: Մենք դիտարկեցինք միտոքոնդրիալ դինամիկայի աննշան, բայց նշանակալի փոփոխություններ PPA սթրեսի տակ (Նկար 2): 3 մՄ-ի դեպքում ճեղքման իրադարձությունների քանակը զգալիորեն աճեց, մինչդեռ միաձուլման իրադարձությունները մնացին նույնը, ինչ վերահսկիչում: 5 մՄ PPA-ի դեպքում դիտվեց ինչպես ճեղքման, այնպես էլ միաձուլման իրադարձությունների քանակի աճ, բայց այդ փոփոխությունները մոտավորապես համամասնական էին, ինչը ենթադրում է, որ ճեղքման և միաձուլման կինետիկան հավասարակշռության է հասնում ավելի բարձր կոնցենտրացիաներում (Նկար 2բ): Միտոքոնդրիալ միջին ծավալը մնաց անփոփոխ ինչպես 3, այնպես էլ 5 մՄ PPA-ի դեպքում, ինչը ցույց է տալիս, որ միտոքոնդրիալ ցանցի ամբողջականությունը պահպանվել է (Նկար 2դ): Սա արտացոլում է դինամիկ միտոքոնդրիալ ցանցերի ունակությունը՝ արձագանքելու թույլ նյութափոխանակության սթրեսին՝ արդյունավետորեն պահպանելով հոմեոստազը՝ առանց ցանցի մասնատման պատճառ դառնալու: 3 մՄ PPA-ի դեպքում ճեղքման աճը բավարար է նոր հավասարակշռության անցումը խթանելու համար, սակայն PPA-ի ավելի բարձր կոնցենտրացիաներից առաջացած սթրեսին ի պատասխան անհրաժեշտ է ավելի խորը կինետիկ վերակառուցում:
Միտոքոնդրիաների քանակը մեծացել է PPA-ի երկու սթրեսային կոնցենտրացիաների դեպքում, սակայն միտոքոնդրիալ միջին ծավալը զգալիորեն չի փոխվել (Նկար 2c): Սա կարող է պայմանավորված լինել կենսագենեզի աճով կամ բաժանման աճով. սակայն, միջին միտոքոնդրիալ ծավալի զգալի նվազման բացակայության դեպքում, ավելի հավանական է, որ կենսասինթեզը մեծանա: Այնուամենայնիվ, Նկար 2-ում ներկայացված տվյալները հաստատում են երկու փոխհատուցող մեխանիզմների գոյությունը՝ միտոքոնդրիալ ճեղքման ակտիվացմանը համապատասխանող ճեղքման իրադարձությունների քանակի աճ և միտոքոնդրիալ կենսագենեզին համապատասխանող իրադարձությունների քանակի աճ: Վերջնական արդյունքում, թույլ սթրեսի դինամիկ փոխհատուցումը կարող է բաղկացած լինել ճեղքման, միաձուլման, կենսագենեզի և միտոֆագիայի հետ կապված միաժամանակյա գործընթացներից: Չնայած նախորդ հեղինակները ցույց են տվել, որ PPA-ն ուժեղացնում է միտոզը30,39 և միտոֆագիան29, մենք ապացույցներ ենք տրամադրում միտոքոնդրիալ ճեղքման և միաձուլման դինամիկայի վերակառուցման վերաբերյալ՝ ի պատասխան PPA-ի: Այս տվյալները հաստատում են TEM-ի կողմից դիտարկվող ձևաբանական փոփոխությունները և լրացուցիչ պատկերացում են տալիս PPA-ի առաջացրած միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի հետ կապված մեխանիզմների մասին:
Քանի որ ո՛չ TEM, ո՛չ էլ MEL վերլուծությունը չեն տրամադրել դիտարկված ձևաբանական փոփոխությունների հիմքում ընկած գեների կարգավորման մեխանիզմների ուղղակի ապացույց, մենք ուսումնասիրել ենք միտոքոնդրիալ նյութափոխանակության, կենսագենեզի և դինամիկայի մեջ ներգրավված գեների ՌՆԹ արտահայտությունը: cMYC պրոտո-ուռուցքածինը տրանսկրիպցիոն գործոն է, որը մասնակցում է միտոքոնդրիաների, գլիկոլիզի, ամինաթթուների և ճարպաթթուների նյութափոխանակության կարգավորմանը40: Բացի այդ, հայտնի է, որ cMYC-ն կարգավորում է միտոքոնդրիալ տրանսկրիպցիայի, թարգմանության և համալիրների հավաքման մեջ ներգրավված մոտ 600 միտոքոնդրիալ գեների արտահայտությունը, այդ թվում՝ NRF1-ը և TFAM41-ը: NRF1-ը և TFAM-ը միտոզի երկու կենտրոնական կարգավորիչներ են, որոնք գործում են PGC-1α-ից ներքև՝ mtDNA վերարտադրությունը ակտիվացնելու համար: Այս ուղին ակտիվանում է cAMP և AMPK ազդանշանային ուղով և զգայուն է էներգիայի ծախսի և նյութափոխանակության սթրեսի նկատմամբ: Մենք նաև ուսումնասիրել ենք NFE2L2-ը՝ միտոքոնդրիալ կենսագենեզի օքսիդա-վերականգնման կարգավորիչը, որպեսզի որոշենք, թե արդյոք PPA-ի ազդեցությունը կարող է միջնորդվել օքսիդատիվ սթրեսով:
Չնայած NFE2L2 արտահայտությունը մնաց անփոփոխ, մենք հայտնաբերեցինք cMYC, NRF1 և TFAM արտահայտությունը 24 ժամվա ընթացքում 3 մՄ և 5 մՄ PPA-ով բուժումից հետո (Նկար 3ա-գ): cMYC արտահայտման նվազումը նախկինում հաղորդվել է որպես միտոքոնդրիալ սթրեսի արձագանք42, և հակառակը, cMYC արտահայտման նվազումը կարող է առաջացնել միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիա՝ վերակառուցելով միտոքոնդրիալ նյութափոխանակությունը, ցանցային կապը և թաղանթային բևեռացումը43: Հետաքրքիր է, որ cMYC-ն նաև մասնակցում է միտոքոնդրիալ ճեղքման և միաձուլման կարգավորմանը42,43 և հայտնի է, որ այն մեծացնում է DRP1 ֆոսֆորիլացումը և միտոքոնդրիալ տեղայնացումը բջջային բաժանման ընթացքում44, ինչպես նաև միջնորդում է միտոքոնդրիալ ձևաբանական վերակառուցումը նեյրոնային ցողունային բջիջներում45: Իրոք, cMYC-ի դեֆիցիտով ֆիբրոբլաստները ցուցաբերում են միտոքոնդրիալ չափի նվազում, որը համապատասխանում է PPA43 սթրեսի հետևանքով առաջացած փոփոխություններին: Այս տվյալները ցույց են տալիս cMYC-ի և միտոքոնդրիալ դինամիկայի միջև հետաքրքիր, բայց դեռևս անհասկանալի կապը, ինչը հետաքրքիր թիրախ է PPA սթրեսի հետևանքով վերակառուցման ապագա ուսումնասիրությունների համար:
NRF1-ի և TFAM-ի նվազումը համապատասխանում է cMYC-ի դերին՝ որպես կարևոր տրանսկրիպցիոն ակտիվատորի: Այս տվյալները համապատասխանում են նաև մարդու հաստ աղիքի քաղցկեղի բջիջների վրա կատարված նախորդ ուսումնասիրություններին, որոնք ցույց են տվել, որ PPA-ն նվազեցրել է NRF1 mRNA-ի արտահայտությունը 22 ժամվա ընթացքում, ինչը կապված էր ATP-ի սպառման և ROS46-ի աճի հետ: Այս հեղինակները նաև հայտնել են, որ TFAM-ի արտահայտությունը աճել է 8.5 ժամվա ընթացքում, բայց վերադարձել է սկզբնական մակարդակին 22 ժամվա ընթացքում: Ի տարբերություն դրա, Քիմը և այլք (2019) ցույց են տվել, որ TFAM mRNA-ի արտահայտությունը զգալիորեն նվազել է SH-SY5Y բջիջներում PPA սթրեսի 4 ժամից հետո. սակայն, 72 ժամ անց TFAM սպիտակուցի արտահայտությունը զգալիորեն աճել է, և mtDNA-ի պատճենների քանակը զգալիորեն աճել է: Այսպիսով, միտոքոնդրիալ կենսագենեզի գեների քանակի նվազումը, որը մենք դիտարկել ենք 24 ժամ անց, չի բացառում այն ​​հնարավորությունը, որ միտոքոնդրիաների քանակի աճը կապված է կենսագենեզի ակտիվացման հետ ավելի վաղ ժամանակային կետերում: Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ PPA-ն զգալիորեն բարձրացնում է PGC-1α mRNA-ի և սպիտակուցի ակտիվությունը SH-SY5Y բջիջներում 4 ժամ 30 րոպեում, մինչդեռ պրոպիոնաթթուն ուժեղացնում է միտոքոնդրիալ կենսագենեզը հորթի հեպատոցիտներում PGC-1α-ի միջոցով 12 ժամ 39 րոպեում: Հետաքրքիր է, որ PGC-1α-ն ոչ միայն NRF1-ի և TFAM-ի ուղղակի տրանսկրիպցիոն կարգավորիչ է, այլև ցույց է տրվել, որ կարգավորում է MFN2-ի և DRP1-ի ակտիվությունը՝ կարգավորելով բաժանումը և միաձուլումը47: Ամփոփելով՝ սա ընդգծում է PPA-ի կողմից առաջացած միտոքոնդրիալ փոխհատուցող արձագանքները կարգավորող մեխանիզմների սերտ կապը: Ավելին, մեր տվյալները արտացոլում են կենսագենեզի և նյութափոխանակության տրանսկրիպցիոն կարգավորման զգալի դիսռեգուլյացիան PPA սթրեսի տակ:
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 և DRP1 գեները միտոքոնդրիալ ճեղքման, միաձուլման և դինամիկայի կենտրոնական կարգավորիչներից են37,48,49: Միտոքոնդրիալ դինամիկայում ներգրավված են բազմաթիվ այլ գեներ, սակայն նախկինում պարզվել է, որ STOML2-ը, OPA1-ը և MFN2-ը տարբերակված մեթիլացված են ASD կոհորտներում,16 և մի քանի անկախ ուսումնասիրություններ հաղորդել են այս տրանսկրիպցիոն գործոնների փոփոխությունների մասին՝ ի պատասխան միտոքոնդրիալ սթրեսի50,51:52. OPA1-ի և STOML2-ի արտահայտությունը զգալիորեն նվազել է 3 մՄ և 5 մՄ PPA մշակմամբ (Նկար 3ե, զ): OPA1-ը միտոքոնդրիալ միաձուլման դասական կարգավորիչներից մեկն է՝ MFN1-ի և 2-ի հետ անմիջական փոխազդեցության միջոցով, և դեր է խաղում կրիստաների վերակառուցման և միտոքոնդրիալ ձևաբանության մեջ53: STOML2-ի ճշգրիտ դերը միտոքոնդրիալ դինամիկայում մնում է անհասկանալի, բայց ապացույցները ցույց են տալիս, որ այն դեր է խաղում միտոքոնդրիալ միաձուլման, կենսագենեզի և միտոֆագիայի մեջ:
STOML2-ը ներգրավված է միտոքոնդրիալ շնչառական կապի պահպանման և շնչառական շղթայի համալիրների ձևավորման մեջ54,55 և ցույց է տրվել, որ խորապես փոխում է քաղցկեղի բջիջների նյութափոխանակության բնութագրերը56: Ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ STOML2-ը խթանում է միտոքոնդրիալ թաղանթային պոտենցիալը և կենսագենեզը՝ BAN-ի և կարդիոլիպինի հետ փոխազդեցության միջոցով55, 57, 58: Բացի այդ, անկախ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ STOML2-ի և PINK1-ի միջև փոխազդեցությունը կարգավորում է միտոֆագիան59,60: Հատկանշական է, որ STOML2-ը, ըստ հաղորդումների, անմիջականորեն փոխազդում է MFN2-ի հետ և կայունացնում այն, ինչպես նաև կարևոր դեր է խաղում երկար OPA1 իզոֆորմների կայունացման գործում՝ արգելակելով OPA1 քայքայման համար պատասխանատու պրոտեազը53,61,62: PPA ռեակցիաներում դիտարկվող STOML2 արտահայտման նվազումը կարող է այս միաձուլված սպիտակուցները ավելի զգայուն դարձնել քայքայման նկատմամբ՝ ուբիկվիտինից և պրոտեասոմից կախված ուղիներով48: Չնայած STOML2-ի և OPA1-ի ճշգրիտ դերը PPA-ի նկատմամբ դինամիկ արձագանքում պարզ չէ, այս միաձուլման գեների արտահայտման նվազումը (Նկար 3) կարող է խախտել բաժանման և միաձուլման միջև հավասարակշռությունը և հանգեցնել միտոքոնդրիալ չափի նվազմանը (Նկար 3): 1):
Մյուս կողմից, OPA1 սպիտակուցի արտահայտությունը մնացել է անփոփոխ 24 ժամ անց, մինչդեռ MFN1, MFN2 կամ DRP1-ի mRNA-ի և սպիտակուցի մակարդակները PPA-ով մշակումից հետո էականորեն չեն փոխվել (Նկար 3g-i, Նկար 4): Սա կարող է ցույց տալ, որ միտոքոնդրիալ միաձուլման և բաժանման մեջ ներգրավված այս գործոնների կարգավորման մեջ փոփոխություններ չկան: Այնուամենայնիվ, հարկ է նշել, որ այս չորս գեներից յուրաքանչյուրը կարգավորվում է նաև սպիտակուցային ակտիվությունը վերահսկող հետտրանսկրիպցիոն մոդիֆիկացիաներով (PTM): OPA1-ն ունի ութ այլընտրանքային սփլայս տարբերակներ, որոնք պրոտեոլիտիկորեն բաժանվում են միտոքոնդրիաներում՝ առաջացնելով երկու տարբեր իզոֆորմներ 63: Երկար և կարճ իզոֆորմների միջև հավասարակշռությունը, ի վերջո, որոշում է OPA1-ի դերը միտոքոնդրիալ միաձուլման և միտոքոնդրիալ ցանցի պահպանման մեջ 64: DRP1 ակտիվությունը կարգավորվում է կալցիում/կալմոդուլին-կախյալ սպիտակուցային կինազ II (CaMKII) ֆոսֆորիլացմամբ, մինչդեռ DRP1 քայքայումը կարգավորվում է ուբիկվիտինացմամբ և SUMOիլացմամբ 65: Վերջապես, և՛ DRP1-ը, և՛ MFN1/2-ը GTPազներ են, ուստի ակտիվությունը կարող է ազդվել միտոքոնդրիաներում GTP արտադրության արագությունից 66: Հետևաբար, չնայած այս սպիտակուցների էքսպրեսիան մնում է անփոփոխ, սա կարող է չարտացոլել սպիտակուցի անփոփոխ ակտիվությունը կամ տեղայնացումը 67,68: Իրոք, առկա PTM սպիտակուցային ռեպերտուարները հաճախ ծառայում են որպես պաշտպանության առաջին գիծ, ​​որը պատասխանատու է սուր սթրեսային արձագանքների միջնորդության համար: Մեր մոդելում չափավոր նյութափոխանակության սթրեսի առկայության դեպքում, հավանական է, որ PTM-ն նպաստում է միաձուլման և բաժանման սպիտակուցների ակտիվության աճին՝ միտոքոնդրիալ ամբողջականությունը բավարար կերպով վերականգնելու համար՝ առանց այդ գեների լրացուցիչ ակտիվացման անհրաժեշտության mRNA-ի կամ սպիտակուցի մակարդակում:
Վերոնշյալ տվյալները միասին ընդգծում են միտոքոնդրիալ ձևաբանության բարդ և ժամանակից կախված կարգավորումը և այդ մեխանիզմները պարզաբանելու դժվարությունները: Գեների արտահայտությունը ուսումնասիրելու համար նախ անհրաժեշտ է նույնականացնել ուղու որոշակի թիրախային գեները: Այնուամենայնիվ, մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ նույն ուղու գեները նույն կերպ չեն արձագանքում նույն սթրեսին: Փաստորեն, նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ նույն ուղու տարբեր գեները կարող են ցուցաբերել տարբեր ժամանակային արձագանքի պրոֆիլներ30,46: Բացի այդ, կան բարդ հետտրանսկրիպցիոն մեխանիզմներ, որոնք խաթարում են տրանսկրիպցիայի և գեների ֆունկցիայի միջև կապը: Պրոտեոմիկ ուսումնասիրությունները կարող են պատկերացում տալ PTM-ների և սպիտակուցի ֆունկցիայի ազդեցության մասին, բայց դրանք նաև մարտահրավերներ են առաջացնում, ներառյալ ցածր թողունակության մեթոդները, ազդանշան-աղմուկ բարձր հարաբերակցությունը և վատ լուծաչափը:
Այս համատեքստում, միտոքոնդրիալ ձևաբանության ուսումնասիրությունը՝ օգտագործելով TEM և MEL, մեծ ներուժ ունի միտոքոնդրիալ դինամիկայի և ֆունկցիայի միջև եղած փոխհարաբերության և դրա հիվանդության վրա ազդեցության վերաբերյալ հիմնարար հարցերին պատասխանելու համար: Ամենակարևորը, TEM-ը տրամադրում է միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը որպես միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի և դինամիկայի համընկնող վերջնակետ չափելու ուղղակի մեթոդ51: MEL-ը նաև տրամադրում է բաժանման և միաձուլման իրադարձությունները եռաչափ բջջային միջավայրում պատկերացնելու ուղղակի մեթոդ՝ թույլ տալով քանակականացնել դինամիկ միտոքոնդրիալ վերակառուցումը նույնիսկ գեների արտահայտման փոփոխությունների բացակայության դեպքում33: Այստեղ մենք ընդգծում ենք միտոքոնդրիալ պատկերման տեխնիկայի օգտակարությունը երկրորդային միտոքոնդրիալ հիվանդությունների դեպքում: Այս հիվանդությունները սովորաբար բնութագրվում են քրոնիկ մեղմ նյութափոխանակության սթրեսով, որը բնութագրվում է միտոքոնդրիալ ցանցերի նուրբ վերակառուցմամբ, այլ ոչ թե սուր միտոքոնդրիալ վնասվածքով: Այնուամենայնիվ, քրոնիկ սթրեսի պայմաններում միտոզը պահպանելու համար անհրաժեշտ միտոքոնդրիալ փոխհատուցումը խորը ֆունկցիոնալ հետևանքներ ունի: Նյարդաբանության համատեքստում այս փոխհատուցող մեխանիզմների ավելի լավ ըմբռնումը կարող է կարևոր տեղեկատվություն տրամադրել միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի հետ կապված պլեյոտրոպ նյարդապաթոլոգիայի մասին:
Վերջնական արդյունքում, մեր տվյալները ընդգծում են պատկերագրական տեխնիկաների օգտակարությունը՝ գեների արտահայտման, սպիտակուցային մոդիֆիկացիաների և նեյրոնային միտոքոնդրիալ դինամիկան կարգավորող սպիտակուցային ակտիվության միջև բարդ փոխազդեցությունների ֆունկցիոնալ հետևանքները հասկանալու համար: Մենք օգտագործեցինք PPA-ն՝ նեյրոնային բջջային մոդելում միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան մոդելավորելու համար՝ ASD-ի միտոքոնդրիալ բաղադրիչի մասին պատկերացում կազմելու համար: PPA-ով մշակված SH-SY5Y բջիջները ցույց տվեցին միտոքոնդրիալ ձևաբանության փոփոխություններ. միտոքոնդրիաները դարձան փոքր և կլոր, իսկ կրիստաները վատ էին սահմանված TEM-ով դիտարկելիս: MEL վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ այս փոփոխությունները տեղի են ունենում միաժամանակ բաժանման և միաձուլման իրադարձությունների աճի հետ՝ միտոքոնդրիալ ցանցը պահպանելու համար՝ ի պատասխան թույլ նյութափոխանակության սթրեսի: Ավելին, PPA-ն զգալիորեն խաթարում է միտոքոնդրիալ նյութափոխանակության և հոմեոստազի տրանսկրիպցիոն կարգավորումը: Մենք cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 և OPA1-ը նույնականացրեցինք որպես PPA սթրեսի հետևանքով խաթարված հիմնական միտոքոնդրիալ կարգավորիչներ և կարող են դեր ունենալ PPA-ի կողմից առաջացած միտոքոնդրիալ ձևաբանության և ֆունկցիայի փոփոխությունների միջնորդման գործում: Հետագա ուսումնասիրություններ անհրաժեշտ են՝ PPA-ի կողմից առաջացած գեների արտահայտման և սպիտակուցային ակտիվության, տեղայնացման և հետտրանսլյացիոն փոփոխությունների ժամանակային փոփոխությունները ավելի լավ բնութագրելու համար: Մեր տվյալները ընդգծում են միտոքոնդրիալ սթրեսային արձագանքը միջնորդող կարգավորիչ մեխանիզմների բարդությունն ու փոխկախվածությունը և ցույց են տալիս TEM-ի և այլ պատկերագրական տեխնիկաների օգտակարությունը ավելի նպատակային մեխանիստական ​​ուսումնասիրությունների համար։
SH-SY5Y բջջային գիծը (ECACC, 94030304-1VL) ձեռք է բերվել Sigma-Aldrich-ից: SH-SY5Y բջիջները աճեցվել են Dulbecco-ի կողմից մոդիֆիկացված Eagle-ի միջավայրի/F-12 սննդարար խառնուրդի (DMEM/F-12) և L-գլուտամինի (SC09411, ScienCell) մեջ 25 սմ2 տարողությամբ սրվակներում՝ լրացված 20% պտղի խոշոր եղջերավոր անասունի շիճուկով (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) և 1% պենիցիլին-ստրեպտոմիցինով (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) 37°C ջերմաստիճանում, 5% CO2 պարունակությամբ: Բջիջները ենթամշակվել են մինչև 80% միաձուլում՝ օգտագործելով 0.05% տրիպսին-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), ցենտրիֆուգացվել են 300 գ-ով և տեղադրվել են մոտավորապես 7 × 105 բջիջ/մլ խտությամբ: Բոլոր փորձերը կատարվել են չդիֆերենցված SH-SY5Y բջիջների վրա՝ 19-22 անցուղիների միջև։ PPA-ն ներարկվում է որպես NaP։ NaP փոշին (CAS համար 137-40-6, քիմիական բանաձև՝ C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) լուծեք տաք MilliQ ջրի մեջ մինչև 1 Մ կոնցենտրացիա և պահեք 4°C ջերմաստիճանում։ Մշակման օրը այս լուծույթը նոսրացրեք 1 Մ PPA-ով մինչև 3 մՄ և 5 մՄ PPA՝ շիճուկազուրկ միջավայրում (DMEM/F-12՝ L-գլուտամինով)։ Բոլոր փորձերի մշակման կոնցենտրացիաները եղել են՝ առանց PPA (0 մՄ, վերահսկիչ), 3 մՄ և 5 մՄ PPA։ Փորձերը կատարվել են առնվազն երեք կենսաբանական կրկնօրինակներով։
SH-SY5Y բջիջները ցանվել են 25 սմ5 տարողությամբ սրվակների մեջ 5.5 × 105 բջիջ/մլ արագությամբ և աճեցվել 24 ժամ: PPA մշակումը ավելացվել է սրվակի մեջ ինկուբացիայից 24 ժամ առաջ: Հավաքեք բջջային գնդիկները՝ հետևելով կաթնասունների հյուսվածքների ենթամշակման սովորական պրոտոկոլներին (նկարագրված է վերևում): Վերլուծեք բջջային գնդիկը 100 մկլ 2.5% գլուտարալդեհիդի, 1× PBS լուծույթի մեջ և պահեք 4°C ջերմաստիճանում մինչև մշակումը: SH-SY5Y բջիջները կարճ ժամանակով ցենտրիֆուգացվել են՝ բջիջները գնդիկավորելու և 2.5% գլուտարալդեհիդի, 1× PBS լուծույթը հեռացնելու համար: Վերլուծեք նստվածքը թորած ջրում պատրաստված 4% ագարոզային գելի մեջ (ագարոզի և նստվածքի ծավալի հարաբերակցությունը 1:1 է): Ագարոզի կտորները տեղադրվել են ցանցերի վրա՝ հարթ թիթեղների վրա, և պատվել 1-հեքսադեցենով՝ բարձր ճնշման սառեցումից առաջ: Նմուշները սառեցվել են 100% չոր ացետոնում -90°C ջերմաստիճանում 24 ժամ: Այնուհետև ջերմաստիճանը բարձրացվել է մինչև -80°C և ավելացվել է 1% օսմիումի տետրօքսիդի և 0.1% գլուտարալդեհիդի լուծույթ։ Նմուշները պահվել են -80°C ջերմաստիճանում 24 ժամ։ Դրանից հետո ջերմաստիճանը աստիճանաբար բարձրացվել է մինչև սենյակային ջերմաստիճան մի քանի օրվա ընթացքում՝ -80°C-ից մինչև -50°C՝ 24 ժամ, մինչև -30°C՝ 24 ժամ, մինչև -10°C՝ 24 ժամ և վերջապես՝ մինչև սենյակային ջերմաստիճան։
Կրիոգենային պատրաստումից հետո նմուշները ներծծվել են խեժով, և գերբարակ հատվածներ (∼100 նմ) ​​պատրաստվել են Leica Reichert UltracutS ուլտրամիկրոտոմի (Leica Microsystems) միջոցով: Կտրվածքները ներկվել են 2% ուրանիլցետատով և կապարի ցիտրատով: Նմուշները դիտարկվել են FEI Tecnai 20 թափանցող էլեկտրոնային մանրադիտակի (ThermoFisher (նախկինում FEI), Էյնդհովեն, Նիդեռլանդներ) միջոցով, որը գործում է 200 կՎ լարման վրա (Lab6 հաղորդիչ) և Gatan CCD տեսախցիկի (Gatan, Մեծ Բրիտանիա) միջոցով, որը հագեցած է Tridiem էներգետիկ ֆիլտրով:
Յուրաքանչյուր տեխնիկական կրկնօրինակման ժամանակ ստացվել է առնվազն 24 միաբջիջ պատկեր՝ ընդհանուր առմամբ 266 պատկեր։ Բոլոր պատկերները վերլուծվել են հետաքրքրության շրջանի (ROI) և միտոքոնդրիում մակրոյի միջոցով։ Միտոքոնդրիումային մակրոն հիմնված է հրապարակված մեթոդների17,31,32 վրա և թույլ է տալիս Ֆիջիում/ImageJ69-ում TEM պատկերների կիսաավտոմատ խմբաքանակային մշակում։ Հակիրճ ասած՝ պատկերը շրջվել և շրջվել է՝ օգտագործելով գլորվող գնդակի ֆոնի հանում (60 պիքսելային շառավղով) և FFT արգելակային ֆիլտր (համապատասխանաբար օգտագործելով 60 և 8 պիքսելային վերին և ստորին սահմաններ) և ուղղահայաց գծերի ճնշում՝ 5% կողմնորոշման հանդուրժողականությամբ։ Մշակված պատկերը ավտոմատ կերպով սահմանվում է շեմային սահմանով՝ օգտագործելով առավելագույն էնտրոպիայի ալգորիթմ, և ստեղծվում է երկուական դիմակ։ TEM հում պատկերներում ձեռքով ընտրված ROI-ների հետ կապված պատկերի շրջանները արդյունահանվել են՝ բնութագրելով միտոքոնդրիաները և բացառելով պլազմային թաղանթը և այլ բարձր կոնտրաստային շրջանները։ Յուրաքանչյուր արդյունահանված ROI-ի համար վերլուծվել են 600 պիքսելից մեծ երկուական մասնիկներ, և մասնիկի մակերեսը, պարագիծը, մեծ և փոքր առանցքները, Ֆերետի տրամագիծը, կլորությունը և շրջանաձևությունը չափվել են Fiji/ImageJ-ի ներկառուցված չափման ֆունկցիաների միջոցով: Merrill, Flippo և Strack (2017)-ի համաձայն՝ այս տվյալներից հաշվարկվել են մակերես 2-ը, մասնիկի ասպեկտի հարաբերակցությունը (մեծ և փոքր առանցքների հարաբերակցությունը) և ձևի գործակիցը (FF), որտեղ FF = պարագիծ 2/4pi x մակերես: Պարամետրիկ բանաձևի սահմանումը կարելի է գտնել Merrill, Flippo և Strack (2017)-ում: Նշված մակրոները հասանելի են GitHub-ում (տե՛ս տվյալների հասանելիության մասին հայտարարությունը): Միջին հաշվով, PPA մշակման յուրաքանչյուր մշակման համար վերլուծվել է մոտավորապես 5,600 մասնիկ, ընդհանուր առմամբ՝ մոտավորապես 17,000 մասնիկ (տվյալները չեն ներկայացված):
SH-SH5Y բջիջները տեղադրվել են 8-խցիկային մշակութային ամանների մեջ (ThermoFisher, #155411)՝ գիշերը կպչունությունը ապահովելու համար, ապա ինկուբացվել են TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) և Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) ներկմամբ: Պատկերները ստացվել են 405 նմ և 561 նմ լազերներով 10 րոպեանոց միջավայրում, իսկ հում պատկերները ստացվել են որպես z-stacks, որոնք պարունակում են 10 պատկերի միկրոլուսանկարներ՝ 0.2 մկմ az քայլով պատկերի կադրերի միջև՝ 12 հաջորդական ժամանակային կետերում: Պատկերները հավաքվել են Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 գերլուծաչափով հարթակի (Carl Zeiss, Oberkochen, Գերմանիա) միջոցով՝ օգտագործելով LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 օբյեկտիվ: Պատկերները վերլուծվել են ImageJ-ում՝ օգտագործելով նախկինում նկարագրված խողովակաշարը և ImageJ հավելվածը՝ միաձուլման և բաժանման իրադարձությունները, միտոքոնդրիալ կառուցվածքների միջին քանակը և բջջի միջին միտոքոնդրիալ ծավալը չափելու համար33: MEL մակրոները հասանելի են GitHub-ում (տե՛ս տվյալների հասանելիության մասին հայտարարությունը):
SH-SY5Y բջիջները աճեցվել են վեց խոռոչ ունեցող թիթեղներում՝ 0.3 × 106 բջիջ/մլ խտությամբ, մշակումից 24 ժամ առաջ: ՌՆԹ-ն արդյունահանվել է Quick-RNA™ Miniprep արձանագրության միջոցով (ZR R1055, Zymo Research)՝ աննշան փոփոխություններով. յուրաքանչյուր խոռոչին ավելացնել 300 մկլ ՌՆԹ լիզիսի բուֆեր՝ հեռացնելուց առաջ, և յուրաքանչյուր նմուշը լիզել որպես վերջնական քայլ՝ 30 մկլ DNase/RNase էլյուցիայով: -ազատ ջրով: Բոլոր նմուշները ստուգվել են քանակի և որակի համար՝ օգտագործելով NanoDrop ND-1000 UV-Vis սպեկտրոֆոտոմետր: Բջջային լիզատներից ընդհանուր սպիտակուցը ստացվել է 200 մկլ RIPA լիզիսի բուֆերի միջոցով, և սպիտակուցի կոնցենտրացիան քանակապես որոշվել է Bradford սպիտակուցային անալիզի միջոցով70:
cDNA սինթեզը կատարվել է Tetro™ cDNA Synthesis Kit-ի (BIO-65043, Meridian Bioscience) միջոցով՝ համաձայն արտադրողի հրահանգների՝ որոշ փոփոխություններով։ cDNA-ն սինթեզվել է 20 մկլ ռեակցիաներում՝ օգտագործելով 0.7-ից մինչև 1 մկգ ընդհանուր ՌՆԹ։ Պրայմերները ընտրվել են նախկինում հրապարակված հոդվածներից՝ 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (աղյուսակ S1), իսկ ուղեկցող զոնդերը նախագծվել են Integrated DNA Technologies-ի PrimerQuest գործիքի միջոցով։ Բոլոր հետաքրքրող գեները նորմալացվել են միջուկային B2M գենի նկատմամբ։ STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC և OPA1 գեների արտահայտությունը չափվել է RT-qPCR-ի միջոցով։ Գլխավոր խառնուրդը ներառում էր LUNA Taq պոլիմերազ (M3003L, New England Biolabs), 10 μM ուղիղ և հակադարձ պրայմերներ, cDNA և PCR կարգի ջուր՝ յուրաքանչյուր ռեակցիայի համար 10 մկլ վերջնական ծավալ ստանալու համար: Բաժանման և ճեղքման գեների (DRP1, MFN1/2) արտահայտությունը չափվել է TaqMan մուլտիպլեքսային փորձարկումների միջոցով: Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs)-ը օգտագործվել է արտադրողի հրահանգների համաձայն՝ աննշան փոփոխություններով: Մուլտիպլեքս RT-qPCR գլխավոր խառնուրդը ներառում է 1X LUNA Taq պոլիմերազ, 10 μM ուղիղ և հակադարձ պրայմերներ, 10 μM զոնդ, cDNA և PCR կարգի ջուր՝ յուրաքանչյուր ռեակցիայի համար 20 մկլ վերջնական ծավալ ստանալու համար: RT-qPCR-ը կատարվել է Rotor-Gene Q 6-plex-ի միջոցով (QIAGEN RG—սերիական համար՝ R0618110): Ցիկլիկ պայմանները ներկայացված են S1 աղյուսակում: Բոլոր կԴՆԹ նմուշները եռակի ամպլիֆիկացվել են, և ստանդարտ կորը ստեղծվել է տասնապատիկ նոսրացումների շարքի միջոցով: Ցիկլի շեմային ստանդարտ շեղումով (Ct) >0.5 եռակի նմուշներում արտառոց արժեքները հեռացվել են վերլուծությունից՝ տվյալների վերարտադրելիությունն ապահովելու համար30,72: Հարաբերական գենի էքսպրեսիան հաշվարկվել է 2-ΔΔCt79 մեթոդով:
Սպիտակուցի նմուշները (60 մկգ) խառնվել են Laemmli բեռնման բուֆերի հետ 2:1 հարաբերակցությամբ և փորձարկվել են 12% անգույն սպիտակուցային գելի վրա (Bio-Rad #1610184): Սպիտակուցները տեղափոխվել են PVDF (պոլիվինիլիդենֆտորիդ) թաղանթի (#170-84156, Bio-Rad) մեջ՝ օգտագործելով Trans-Blot Turbo համակարգը (#170-4155, Bio-Rad): Թաղանթը բլոկավորվել և ինկուբացվել է համապատասխան առաջնային հակամարմիններով (OPA1, MFN1, MFN2 և DRP1) (նոսրացված 1:1000) 48 ժամ, որին հաջորդել է երկրորդային հակամարմիններով (1:10,000) 1 ժամ ինկուբացիա: Այնուհետև թաղանթները պատկերվել են Clarity Western ECL Substrate-ի (#170-5061, Bio-Rad) միջոցով և գրանցվել Bio-Rad ChemiDoc MP համակարգի միջոցով: Western blot վերլուծության համար օգտագործվել է ImageLab 6.1 տարբերակը: Սկզբնական գելը և բլոտը ներկայացված են նկար S1-ում: Հակամարմինների մասին տեղեկատվությունը տրամադրված է աղյուսակ S2-ում:
Տվյալների հավաքածուները ներկայացված են որպես առնվազն երեք անկախ նմուշների միջին արժեքի միջին և ստանդարտ սխալ (SEM): Տվյալների հավաքածուները ստուգվել են նորմալության համար՝ օգտագործելով Շապիրո-Վիլքսի թեստը (եթե այլ բան նշված չէ), նախքան Գաուսյան բաշխումը և հավասար ստանդարտ շեղումները ենթադրելը և վերլուծությունները շարունակելը: Բացի տվյալների հավաքածուի վերլուծությունից՝ օգտագործելով Ֆիշերի MEL LSD (p < 0.05), միակողմանի ANOVA (բուժման և վերահսկողության միջին) և Դաննետի բազմակի համեմատության թեստը՝ նշանակալիությունը որոշելու համար (p < 0.05): Նշանակալի p արժեքները գրաֆիկում ներկայացված են որպես *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001: Բոլոր վիճակագրական վերլուծություններն ու գրաֆիկները կատարվել և ստեղծվել են GraphPad Prism 9.4.0-ի միջոցով:
TEM պատկերի վերլուծության Fiji/ImageJ մակրոները հրապարակայնորեն հասանելի են GitHub-ում՝ https://github.com/caaja/TEMMitoMacro: Միտոքոնդրիալ իրադարձությունների տեղորոշիչ (MEL) մակրոն հրապարակայնորեն հասանելի է GitHub-ում՝ https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin:
Մեյլիանա Ա., Դևի Ն.Մ. և Վիջայա Ա. Միտոքոնդրիաներ. նյութափոխանակության, հոմեոստազի, սթրեսի, ծերացման և էպիգենետիկայի գլխավոր կարգավորիչներ: Ինդոնեզերեն: Կենսաբժշկական գիտություն: J. 13, 221–241 (2021):
Բեն-Շաքար, Դ. Բազմակողմանի միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան շիզոֆրենիայի դեպքում, I կոմպլեքսը որպես հնարավոր պաթոլոգիական թիրախ: Շիզոֆրենիա: ռեսուրս: 187, 3–10 (2017):
Բոուզ, Ա. և Բիլ, Մ.Ֆ. Միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան Պարկինսոնի հիվանդության ժամանակ: J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016):
Շարմա Վ.Կ., Սինգհ Թ.Գ. և Մեհտա Վ. Սթրեսի ենթարկված միտոքոնդրիաներ. Ալցհայմերի հիվանդության ներխուժման թիրախներ: Mitochondria 59, 48–57 (2021):
Բելենգուեր Պ., Դուարտե Ջ.Մ.Ն., Շուկ Պ.Ֆ. և Ֆերեյրա Գ.Կ. Միտոքոնդրիաներ և ուղեղ. կենսաէներգետիկա և այլն։ Նեյրոտոքսիններ։ resource. 36, 219–238 (2019)։
Ռանգարաջու, Վ. և այլք։ Պլեոտրոպ միտոքոնդրիաներ. միտոքոնդրիաների ազդեցությունը նեյրոնների զարգացման և հիվանդությունների վրա։ J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019)։
Կարդանյո-Ռամոս, Ս. և Մորայս, Վ.Ա. Միտոքոնդրիալ կենսագենեզը նեյրոններում. ինչպես և որտեղ։ Միջազգայինություն։ Ջ. Մոր։ Գիտություն։ 22, 13059 (2021)։
Յու, Ռ., Լենդալ, Ու., Նիստեր, Մ. և Չժաո, Ջ. Կաթնասունների միտոքոնդրիալ դինամիկայի կարգավորումը. հնարավորություններ և մարտահրավերներ: ճակատ: էնդոկրին: (Լոզան) 11, 374 (2020):
Խաչո, Մ. և Սլեք, Ռ.Ս. Միտոքոնդրիալ դինամիկան նեյրոգենեզի կարգավորման մեջ. զարգացողից մինչև չափահաս ուղեղ։ զարգացման դինամիկա։ 247, 47–53 (2018)։