Ներկայիս *Ընթացիկ հասցե՝ Քյոլն 50931, Գերմանիա, Քյոլնի գերազանցության կլաստերային հետազոտություն՝ ծերացման հետ կապված հիվանդությունների դեպքում բջջային սթրեսային արձագանքի վերաբերյալ (CECAD):
Միտոքոնդրիալ հիվանդությունների նեյրոդեգեներացիան համարվում է անդառնալի, քանի որ նեյրոնների նյութափոխանակության պլաստիկությունը սահմանափակ է, սակայն միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի ազդեցությունը օրգանիզմում նեյրոնային նյութափոխանակության բջջային ինքնավարության վրա վատ է հասկացված։ Այստեղ մենք ներկայացնում ենք Պուրկինյեի նեյրոնների բջջային-սպեցիֆիկ պրոտեոմը՝ միտոքոնդրիալ միաձուլման դինամիկայի խանգարման պատճառով առաջացած OXPHOS պրոգրեսիվող անբավարարությամբ։ Մենք պարզեցինք, որ միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան առաջացրել է պրոտեոմիկայի ոլորտում խորը փոփոխություն, որն, ի վերջո, հանգեցրել է բջջային մահից առաջ ճշգրիտ նյութափոխանակության ծրագրերի հաջորդական ակտիվացմանը։ Անսպասելիորեն մենք որոշեցինք պիրուվատ կարբօքսիլազի (PCx) և այլ ծերացման դեմ պայքարի ֆերմենտների ակնհայտ ինդուկցիան, որոնք լրացնում են TCA ցիկլի միջանկյալ նյութերը։ PCx-ի արգելակումը սրել է օքսիդատիվ սթրեսը և նեյրոդեգեներացիան, ինչը ցույց է տալիս, որ աթերոսկլերոզը պաշտպանիչ ազդեցություն ունի OXPHOS չունեցող նեյրոնների վրա։ Վերջնական դեգեներացված նեյրոններում միտոքոնդրիալ միաձուլման վերականգնումը ամբողջությամբ վերացնում է այս նյութափոխանակության բնութագրերը՝ այդպիսով կանխելով բջջային մահը։ Մեր արդյունքները բացահայտում են նախկինում անհայտ ուղիներ, որոնք դիմադրողականություն են հաղորդում միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիային և ցույց են տալիս, որ նեյրոդեգեներացիան կարող է վերացվել նույնիսկ հիվանդության ուշ փուլերում։
Միտոքոնդրիաների կենտրոնական դերը նեյրոնային էներգիայի նյութափոխանակության պահպանման գործում ընդգծվում է մարդու միտոքոնդրիալ հիվանդությունների հետ կապված լայնածավալ նյարդաբանական ախտանիշներով: Այս հիվանդությունների մեծ մասը առաջանում է միտոքոնդրիալ գեների արտահայտությունը կարգավորող գեների մուտացիաներից (1, 2) կամ միտոքոնդրիալ դինամիկայի հետ կապված գեների քայքայումից, որոնք անուղղակիորեն ազդում են միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի (մտԴՆԹ) կայունության վրա (3, 4): Կենդանիների մոդելների վրա կատարված աշխատանքը ցույց է տվել, որ շրջակա հյուսվածքներում միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի դեպքում կարող են ակտիվանալ պահպանողական նյութափոխանակության ուղիներ (5-7), ինչը կարևոր տեղեկատվություն է տրամադրում այս բարդ հիվանդությունների պաթոգենեզի խորը ըմբռնման համար: Ի տարբերություն դրա, ուղեղի միտոքոնդրիալ ադենոզին տրիֆոսֆատի (ԱՏՖ) արտադրության ընդհանուր անսարքության պատճառով որոշակի բջջային տեսակների նյութափոխանակության փոփոխությունների մեր ըմբռնումը հիմնարար է (8), որը շեշտում է հիվանդությունները կանխելու կամ կանխարգելելու համար օգտագործվող թերապևտիկ թիրախները բացահայտելու անհրաժեշտությունը: Կանխել նեյրոդեգեներացիան (9): Տեղեկատվության պակասը կայանում է նրանում, որ նյարդային բջիջները լայնորեն համարվում են շատ սահմանափակ նյութափոխանակության ճկունություն ունեցողներ՝ համեմատած շրջակա հյուսվածքների բջջային տեսակների հետ (10): Հաշվի առնելով, որ այս բջիջները կենտրոնական դեր են խաղում նեյրոններին մետաբոլիտների մատակարարման համակարգման գործում՝ սինապսային փոխանցումը խթանելու և վնասվածքներին ու հիվանդություններին արձագանքելու համար, բջջային նյութափոխանակությունը ուղեղի հյուսվածքի դժվարին պայմաններին հարմարեցնելու ունակությունը գրեթե սահմանափակվում է գլիալ բջիջներով (11-14): Բացի այդ, ուղեղի հյուսվածքի բնածին բջջային տարասեռությունը մեծապես խոչընդոտում է որոշակի նեյրոնային ենթախմբերում տեղի ունեցող նյութափոխանակության փոփոխությունների ուսումնասիրությանը: Արդյունքում, քիչ բան է հայտնի նեյրոններում միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի բջջային և նյութափոխանակության ճշգրիտ հետևանքների մասին:
Միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի նյութափոխանակության հետևանքները հասկանալու համար մենք առանձնացրինք Պուրկինյեի նեյրոններ (ՊՆ) միտոքոնդրիալ արտաքին թաղանթի միաձուլման քայքայման (Mfn2) հետևանքով առաջացած նեյրոդեգեներացիայի տարբեր փուլերում: Չնայած մարդկանց մոտ Mfn2 մուտացիաները կապված են ժառանգական շարժիչ զգայական նեյրոպաթիայի մի ձևի հետ, որը հայտնի է որպես Շարկո-Մարի-Թութի 2A տիպ (15), մկների մոտ Mfn2-ի պայմանական քայքայումը օքսիդացման ֆոսֆորիլացման ինդուկցիայի (OXPHOS) դիսֆունկցիայի լավ ճանաչված մեթոդ է: Տարբեր նեյրոնային ենթատիպերը (16-19) և դրանց արդյունքում առաջացած նեյրոդեգեներատիվ ֆենոտիպը ուղեկցվում են նյարդաբանական պրոգրեսիվ ախտանիշներով, ինչպիսիք են շարժման խանգարումները (18, 19) կամ ուղեղիկի ատաքսիան (16): Օգտագործելով պիտակազուրկ քանակական (LFQ) պրոտեոմիկայի, մետաբոլոմիկայի, պատկերագրման և վիրուսաբանական մեթոդների համադրություն, մենք ցույց ենք տալիս, որ առաջընթաց նեյրոդեգեներացիան ուժեղորեն ինդուկցում է ՊՆ-ների արթերիոսկլերոզի մեջ ներգրավված այլ գործոններ in vivo: Այս հայտնագործության արդիականությունը ստուգելու համար մենք հատուկ նվազեցրինք PCx-ի արտահայտությունը Mfn2-ի դեֆիցիտով պունտներում և պարզեցինք, որ այս գործողությունը սրում է օքսիդատիվ սթրեսը և արագացնում նեյրոդեգեներացիան՝ այդպիսով ապացուցելով, որ ազոոսպերմիան նպաստում է բջջային մահվանը։ Մետաբոլիկ հարմարվողականություն։ MFN2-ի ծանր արտահայտությունը կարող է լիովին փրկել տերմինալ դեգեներացիայի պունտը՝ OXPHOS-ի ծանր անբավարարությամբ, միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի զանգվածային սպառմամբ և ակնհայտորեն խզված միտոքոնդրիալ ցանցով, ինչը լրացուցիչ ընդգծում է, որ նեյրոդեգեներացիայի այս ձևը կարող է վերականգնվել նույնիսկ հիվանդության առաջադեմ փուլում՝ բջջային մահից առաջ։
Mfn2 նոկաուտի ենթարկված ՊՆ-ներում միտոքոնդրիաները պատկերացնելու համար մենք օգտագործեցինք մկան շտամ, որը թույլ է տալիս Cre-կախյալ միտոքոնդրիաներին թիրախավորել դեղին ֆլուորեսցենտ սպիտակուցի (YFP) (mtYFP) (20) Cre արտահայտությունը և ստուգեցինք միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը in vivo: Մենք պարզեցինք, որ ՊՆ-ներում Mfn2 գենի ոչնչացումը կհանգեցնի միտոքոնդրիալ ցանցի աստիճանական բաժանմանը (Նկար S1A), և ամենավաղ փոփոխությունը հայտնաբերվել է 3 շաբաթական հասակում: Ի տարբերություն դրա, ՊՆ բջջային շերտի էական դեգեներացիան, ինչպես վկայում է Կալբինդինի իմունային ներկման կորուստը, չի սկսվել մինչև 12 շաբաթական հասակը (Նկար 1, A և B): Միտոքոնդրիալ ձևաբանության ամենավաղ փոփոխությունների և նեյրոնային մահվան տեսանելի սկզբի միջև ժամանակային անհամապատասխանությունը մեզ դրդեց հետազոտել բջջային մահից առաջ միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի հետևանքով առաջացած նյութափոխանակության փոփոխությունները: Մենք մշակել ենք ֆլուորեսցենցիայի ակտիվացված բջիջների տեսակավորման (FACS) վրա հիմնված ռազմավարություն՝ YFP (YFP+) արտահայտող PN-ը մեկուսացնելու համար (Նկար 1C) և վերահսկիչ մկների մոտ (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), այսուհետ՝ CTRL (Նկար S1B): YFP ազդանշանի հարաբերական ինտենսիվության վրա հիմնված դարպասային ռազմավարության օպտիմալացումը թույլ է տալիս մաքրել PN-ների YFP+ մարմինը (YFPhigh) ոչ PN-ներից (YFPneg) (Նկար S1B) կամ ենթադրյալ ֆլուորեսցենտ աքսոն/դենդրիտային բեկորներից (YFPlow; Նկար S1D, ձախ), ինչը հաստատվել է կոնֆոկալ մանրադիտակով (Նկար S1D, աջ): Դասակարգված պոպուլյացիայի ինքնությունը ստուգելու համար մենք անցկացրել ենք LFQ պրոտեոմիկա, ապա՝ գլխավոր բաղադրիչների վերլուծություն և պարզել, որ YFPhigh և YFPneg բջիջների միջև կա հստակ տարանջատում (Նկար S1C): YFPhigh բջիջները ցույց տվեցին հայտնի PNs մարկերների (այսինքն՝ Calb1, Pcp2, Grid2 և Itpr3) զուտ հարստացում (21, 22), բայց ոչ նեյրոններում կամ այլ բջջային տեսակներում սովորաբար արտահայտվող սպիտակուցների հարստացում (Նկար 1D): Անկախ փորձերով հավաքված դասակարգված YFPhigh բջիջների նմուշների միջև համեմատությունը ցույց տվեց > 0.9 կոռելյացիայի գործակից, որը ցույց է տալիս կենսաբանական կրկնօրինակների միջև լավ վերարտադրելիություն (Նկար S1E): Ամփոփելով՝ այս տվյալները հաստատեցին մեր պլանը հնարավոր PN-ի սուր և սպեցիֆիկ մեկուսացման համար: Քանի որ օգտագործված L7-cre դրայվեր համակարգը ծննդաբերությունից հետո առաջին շաբաթվա ընթացքում առաջացնում է մոզաիկ ռեկոմբինացիա (23), մենք սկսեցինք մկների սպանդ CTRL-ից և պայմանական (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) հավաքածուից: Ռեկոմբինացիայի ավարտից հետո այն կոչվում է Mfn2cKO 4 շաբաթական հասակում: Որպես վերջնական կետ մենք ընտրեցինք 8 շաբաթական տարիքը, երբ ՊՆ շերտը ամբողջական էր՝ չնայած ակնհայտ միտոքոնդրիալ մասնատմանը (Նկար 1B և Նկար S1A): Ընդհանուր առմամբ, մենք քանակապես որոշեցինք ընդհանուր առմամբ 3013 սպիտակուց, որոնցից մոտ 22%-ը հիմնված էին MitoCarta 2.0 ծանոթագրությունների վրա՝ հիմնված միտոքոնդրիալ պրոտեոմի վրա որպես միտոքոնդրիա (Նկար 1E) (Նկար 1E) (24): 8-րդ շաբաթում կատարված դիֆերենցիալ գեների արտահայտման վերլուծությունը ցույց տվեց, որ բոլոր սպիտակուցների միայն 10.5%-ն ուներ նշանակալի փոփոխություններ (Նկար 1F և Նկար S1F), որոնցից 195 սպիտակուցների ակտիվությունը նվազել էր, իսկ 120 սպիտակուցների ակտիվությունը բարձրացել էր (Նկար 1F): Հարկ է նշել, որ այս տվյալների հավաքածուի «նորարարական ուղիների վերլուծությունը» ցույց է տալիս, որ տարբերակված արտահայտված գեները հիմնականում պատկանում են որոշակի նյութափոխանակության ուղիների սահմանափակ հավաքածուի (Նկար 1G): Հետաքրքիր է, որ չնայած OXPHOS-ի և կալցիումի ազդանշանային ուղիների թուլացումը հաստատում է միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի ինդուկցիան միաձուլման դեֆիցիտով պունտներում, այլ կատեգորիաները, որոնք հիմնականում ներառում են ամինաթթուների նյութափոխանակությունը, զգալիորեն բարձրացված են, ինչը համապատասխանում է միտոքոնդրիալ պունտներում տեղի ունեցող նյութափոխանակությանը: Վերահղումը հետևողական է:
(A) CTRL և Mfn2cKO մկների ուղեղիկի հատվածների ներկայացուցչական կոնֆոկալ լուսանկարներ, որոնք ցույց են տալիս ՊՆ-ների (կալբինդին, մոխրագույն) առաջադեմ կորուստը. կորիզները հականերկված են DAPI-ով։ (B) (A)-ի քանակականացում (վարիացիայի միակողմանի վերլուծություն, ***P<0.001; n = 4-ից 6 շրջան երեք մկներից)։ (C) Փորձարարական աշխատանքային հոսք։ (D) Պուրկինյեի (վերև) և այլ բջջային տեսակների (միջին) բնորոշ մարկերների ջերմային քարտեզի բաշխումը։ (E) Վեննի դիագրամ, որը ցույց է տալիս դասակարգված ՊՆ-ում նույնականացված միտոքոնդրիալ սպիտակուցների քանակը։ (F) Mfn2cKO նեյրոններում 8 շաբաթում տարբերակված արտահայտված սպիտակուցների հրաբխային գրաֆիկ (նշանակալիության սահմանային արժեքը՝ 1.3)։ (G) Ստեղծագործական ուղու վերլուծությունը ցույց է տալիս Mfn2cKO ՊՆ-ում 8 շաբաթ դասակարգված հինգ ամենակարևոր վերընթաց (կարմիր) և իջեցնող (կապույտ) ուղիները։ Ցուցադրված է յուրաքանչյուր հայտնաբերված սպիտակուցի միջին արտահայտման մակարդակը։ Մոխրագույնի երանգի ջերմային քարտեզ. ճշգրտված P արժեք։ ns, կարևոր չէ։
Պրոտեոմիկայի տվյալները ցույց տվեցին, որ I, III և IV համալիրների սպիտակուցային էքսպրեսիան աստիճանաբար նվազել է: I, III և IV համալիրները բոլորը պարունակում էին էական mtDNA-ով կոդավորված ենթամիավորներ, մինչդեռ II համալիրը, որը միայն միջուկային կոդավորված էր, գործնականում անփոփոխ էր (Նկար 2A և Նկար S2A): Պրոտեոմիկայի արդյունքներին համապատասխան, ուղեղիկի հյուսվածքների հատվածների իմունահյուսվածքաքիմիան ցույց տվեց, որ PN-ում IV համալիրի MTCO1 (միտոքոնդրիալ ցիտոքրոմ C օքսիդազի ենթամիավոր 1) ենթամիավորի մակարդակը աստիճանաբար նվազել է (Նկար 2B): mtDNA-ով կոդավորված Mtatp8 ենթամիավորը զգալիորեն նվազել է (Նկար S2A), մինչդեռ միջուկային կոդավորված ATP սինթազի ենթամիավորի կայուն վիճակի մակարդակը մնացել է անփոփոխ, ինչը համապատասխանում է հայտնի կայուն ATP սինթազի F1 ենթահամակարգին, երբ mtDNA էքսպրեսիան կայուն է: Ձևավորումը կայուն է: Ընդհատում (7): Տեսակավորված Mfn2cKO PN-ներում միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի մակարդակի գնահատումը իրական ժամանակի պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (qPCR) միջոցով հաստատեց միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի պատճենների քանակի աստիճանական նվազումը: Համեմատած վերահսկիչ խմբի հետ, 8 շաբաթական հասակում պահպանվել է միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի մակարդակի միայն մոտ 20%-ը (Նկար 2C): Այս արդյունքներին համապատասխան, Mfn2cKO PN-ների կոնֆոկալ մանրադիտակային ներկումը օգտագործվել է ԴՆԹ-ն հայտնաբերելու համար, որը ցույց է տվել միտոքոնդրիալ նուկլեոտիդների ժամանակից կախված սպառումը (Նկար 2D): Մենք պարզեցինք, որ միտոքոնդրիալ սպիտակուցների քայքայմանը և սթրեսային արձագանքին մասնակցող միայն որոշ թեկնածուներ են բարձրացել, այդ թվում՝ Lonp1, Afg3l2 և Clpx, ինչպես նաև OXPHOS համալիրի հավաքման գործոնները: Ապոպտոզին մասնակցող սպիտակուցների մակարդակներում նշանակալի փոփոխություններ չեն հայտնաբերվել (Նկար S2B): Նմանապես, մենք պարզեցինք, որ կալցիումի տեղափոխմանը մասնակցող միտոքոնդրիաները և էնդոպլազմային ցանցի ալիքները ունեն միայն աննշան փոփոխություններ (Նկար S2C): Բացի այդ, աուտոֆագիայի հետ կապված սպիտակուցների գնահատումը չի հայտնաբերել էական փոփոխություններ, ինչը համապատասխանում է իմունահյուսվածքաքիմիայի և էլեկտրոնային մանրադիտակի միջոցով in vivo դիտարկված աուտոֆագոսոմների տեսանելի ինդուկցիային (Նկար S3): Այնուամենայնիվ, ՊՆ-ներում OXPHOS-ի պրոգրեսիվող դիսֆունկցիան ուղեկցվում է ակնհայտ ուլտրակառուցվածքային միտոքոնդրիալ փոփոխություններով: Միտոքոնդրիալ կլաստերները կարելի է տեսնել 5 և 8 շաբաթական Mfn2cKO ՊՆ-ների բջջային մարմիններում և դենդրիտային ծառերում, և ներքին թաղանթի կառուցվածքը ենթարկվել է խորը փոփոխությունների (Նկար S4, A և B): Այս ուլտրակառուցվածքային փոփոխություններին և mtDNA-ի զգալի նվազմանը համապատասխան, սուր ուղեղային ուղեղիկի շերտերի վերլուծությունը տետրամեթիլռոդամինի մեթիլ էսթերով (TMRM) ցույց տվեց, որ Mfn2cKO ՊՆ-ների միտոքոնդրիալ թաղանթային պոտենցիալը զգալիորեն նվազել է (Նկար S4C):
(Ա) OXPHOS համալիրի արտահայտման մակարդակի ժամանակային ընթացքի վերլուծություն: Դիտարկեք միայն P<0.05 ունեցող սպիտակուցները 8 շաբաթում (երկկողմանի ANOVA): Կետավոր գիծ. CTRL-ի համեմատ ճշգրտում չկա: (Բ) Ձախ. MTCO1 հակամարմինով նշագրված ուղեղիկի հատվածի օրինակ (մասշտաբի գիծ, ​​20 մկմ): Պուրկինյեի բջջային մարմիններով զբաղեցված տարածքը ծածկված է դեղին գույնով: Աջ. MTCO1 մակարդակների քանակական որոշում (վարիացիայի միակողմանի վերլուծություն. n = 7-ից 20 բջիջ, վերլուծված երեք մկներից): (Գ) mtDNA պատճենների քանակի qPCR վերլուծություն տեսակավորված PN-ում (վարիացիայի միակողմանի վերլուծություն. n = 3-ից 7 մկներ): (Դ) Ձախ. ԴՆԹ հակամարմինով նշագրված ուղեղիկի հատվածի օրինակ (մասշտաբի գիծ, ​​20 մկմ): Պուրկինյեի բջջային մարմիններով զբաղեցված տարածքը ծածկված է դեղին գույնով: Աջ. mtDNA վնասվածքների քանակական որոշում (վարիացիայի միակողմանի վերլուծություն. n = 5-ից 9 բջիջ երեք մկներից): (E) Ուղեղիկի սուր հատվածի օրինակ, որը ցույց է տալիս mitoYFP + Պուրկինյեի բջիջները (սլաք) ամբողջ բջջային կարկատանային սեղմիչի ձայնագրության մեջ: (F) IV կորի քանակականացում: (G) CTRL և Mfn2cKO Պուրկինյեի բջիջներում դեպոլարիզացնող հոսանքի ներարկման ներկայացուցչական ձայնագրություններ: Վերին հետագիծ. Առաջին իմպուլսը, որը ակտիվացրել է AP-ն: Ներքևի հետագիծ. Առավելագույն AP հաճախականությունը: (H) Հետսինապսային ինքնաբուխ մուտքերի (sPSP) քանակականացում: Ներկայացուցչական ձայնագրման հետագիծը և դրա մեծացման հարաբերակցությունը ներկայացված են (I)-ում: Վարիացիայի միակողմանի վերլուծությունը վերլուծել է երեք մկների n = 5-ից 20 բջիջ: Տվյալները արտահայտվում են որպես միջին ± SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001: (J) Ինքնաբուխ AP-ի ներկայացուցչական հետքեր, որոնք գրանցվել են պերֆորացված կարկատանային սեղմիչի ռեժիմով: Վերին հետագիծ. Առավելագույն AP հաճախականություն: Ներքևի հետագիծ. մեկ AP-ի մեծացում: (K) Քանակականացրեք միջին և առավելագույն AP հաճախականությունը՝ համաձայն (J): Մանն-Ուիթնիի թեստ. n = 5 բջիջներ վերլուծվել են չորս մկներից: Տվյալները արտահայտված են որպես միջին ± ՍՄՀ, կարևոր չէ։
8 շաբաթական Mfn2cKO PN-ի մոտ հայտնաբերվել է OXPHOS-ի ակնհայտ վնաս, ինչը ցույց է տալիս, որ նեյրոնների ֆիզիոլոգիական ֆունկցիան խիստ աննորմալ է: Հետևաբար, մենք վերլուծել ենք OXPHOS-ի պակասորդ ունեցող նեյրոնների պասիվ էլեկտրական բնութագրերը 4-5 և 7-8 շաբաթականում՝ կատարելով ամբողջական բջջային կպչուն ձայնագրություններ սուր ուղեղիկի կտրվածքներում (Նկար 2E): Անսպասելիորեն, Mfn2cKO նեյրոնների միջին հանգստի թաղանթային պոտենցիալը և մուտքային դիմադրությունը նման էին վերահսկիչ խմբին, չնայած բջիջների միջև կային նուրբ տարբերություններ (աղյուսակ 1): Նմանապես, 4-5 շաբաթական հասակում հոսանք-լարման հարաբերակցության (IV կոր) էական փոփոխություններ չեն հայտնաբերվել (Նկար 2F): Այնուամենայնիվ, 7-8 շաբաթական Mfn2cKO նեյրոններից ոչ մեկը չի գոյատևել IV ռեժիմից (հիպերպոլարացման փուլ), ինչը ցույց է տալիս, որ այս ուշ փուլում կա հիպերպոլարացման պոտենցիալի նկատմամբ հստակ զգայունություն: Ի տարբերություն դրա, Mfn2cKO նեյրոններում կրկնվող գործողության պոտենցիալի (AP) լիցքաթափումներ առաջացնող դեպոլարիզացնող հոսանքները լավ են հանդուրժվում, ինչը ցույց է տալիս, որ դրանց ընդհանուր լիցքաթափման օրինաչափությունները էականորեն չեն տարբերվում 8 շաբաթական վերահսկիչ նեյրոնների օրինաչափություններից (աղյուսակ 1 և նկար 2G): Նմանապես, ինքնաբուխ հետսինապսային հոսանքների (sPSC) հաճախականությունը և ամպլիտուդը համեմատելի էին վերահսկիչ խմբի օրինաչափությունների հետ, և իրադարձությունների հաճախականությունը աճել է 4 շաբաթից մինչև 5 շաբաթ, 7 շաբաթից մինչև 8 շաբաթ՝ նմանատիպ աճով (Նկար 2, H և I): Սինապսային հասունացման ժամանակահատվածը PN-ներում (25): Նմանատիպ արդյունքներ են ստացվել PN-ների պերֆորացված բծերից հետո: Այս կոնֆիգուրացիան կանխում է բջջային ATP արատների հնարավոր փոխհատուցումը, ինչպես կարող է տեղի ունենալ ամբողջ բջջային բծի սեղմակով գրանցման ժամանակ: Մասնավորապես, Mfn2cKO նեյրոնների հանգստի թաղանթային պոտենցիալը և ինքնաբուխ ակտիվացման հաճախականությունը չեն ազդվել (Նկար 2, J և K): Ամփոփելով՝ այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ OXPHOS-ի ակնհայտ դիսֆունկցիա ունեցող պոնային նյարդային համակարգը կարող է լավ հաղթահարել բարձր հաճախականության լիցքաթափման օրինաչափությունները, ինչը ցույց է տալիս, որ գոյություն ունի փոխհատուցման մեխանիզմ, որը թույլ է տալիս նրանց պահպանել գրեթե նորմալ էլեկտրաֆիզիոլոգիական արձագանքներ։
Տվյալները արտահայտվում են որպես միջին ± ՍՄՄ (վարիացիայի միակողմանի վերլուծություն, Հոլմ-Սիդակի բազմակի համեմատական ​​թեստ; *P<0.05): Միավորի համարը նշված է փակագծերով:
Մենք որոշեցինք ուսումնասիրել, թե արդյոք պրոտեոմիկայի տվյալների հավաքածուի որևէ կատեգորիա (Նկար 1G) ներառում է OXPHOS-ի ծանր անբավարարությանը հակազդող ուղիներ, այդպիսով բացատրելով, թե ինչու է ազդակիր ծայրամասային սննդակարգը կարող պահպանել գրեթե նորմալ էլեկտրոֆիզիոլոգիա (Նկար 2, E-ից K): Պրոտեոմիկայի վերլուծությունը ցույց տվեց, որ ճյուղավորված շղթայով ամինաթթուների (BCAA) կատաբոլիզմին մասնակցող ֆերմենտները զգալիորեն ակտիվացել են (Նկար 3A և Նկար S5A), և վերջնական արգասիքը՝ ացետիլ-CoA-ն (CoA) կամ սուկցինիլ CoA-ն, կարող են լրացնել տրիկարբոքսիլատները աթերոսկլերոզի թթվի (TCA) ցիկլում: Մենք պարզեցինք, որ BCAA տրանսամինազ 1-ի (BCAT1) և BCAT2-ի պարունակությունը երկուսն էլ աճել են: Դրանք կատալիզացնում են BCAA կատաբոլիզմի առաջին քայլը՝ α-կետոգլյուտարատից գլուտամատ առաջացնելով (26): Ճյուղավորված շղթայով կետո թթվային դեհիդրոգենազի (BCKD) համալիրը կազմող բոլոր ենթամիավորները ակտիվանում են (համալիրը կատալիզացնում է ստացված BCAA ածխածնային կմախքի հետագա և անդառնալի դեկարբօքսիլացումը) (Նկար 3A և Նկար S5A): Այնուամենայնիվ, տեսակավորված ՊՆ-ում BCAA-ի ակնհայտ փոփոխություններ չեն հայտնաբերվել, ինչը կարող է պայմանավորված լինել այս էական ամինաթթուների բջջային կլանման աճով կամ TCA ցիկլը լրացնելու համար այլ աղբյուրների (գլյուկոզ կամ կաթնաթթու) օգտագործմամբ (Նկար S5B): OXPHOS չունեցող ՊՆ-ները նաև ցույց են տվել գլուտամինի քայքայման և տրանսամինացիայի ակտիվության աճ 8 շաբաթականում, ինչը կարող է արտացոլվել միտոքոնդրիալ ֆերմենտների՝ գլուտամինազի (GLS) և գլուտամին պիրուվատ տրանսամինազ 2-ի (GPT2) ակտիվությամբ (Նկար 3, A և C): Հարկ է նշել, որ GLS-ի ակտիվացումը սահմանափակվում է սպլայսինգ իզոֆորմ գլուտամինազ C-ով (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL-ի փոփոխությունը մոտավորապես 4.5 անգամ է, P = 0.05), և դրա յուրահատուկ ակտիվացումը քաղցկեղի հյուսվածքներում կարող է աջակցել միտոքոնդրիալ կենսաէներգիային: (27):
(Ա) Ջերմային քարտեզը ցույց է տալիս սպիտակուցի մակարդակի ծալքի փոփոխությունը նշված ուղու համար 8 շաբաթում։ (Բ) Հակա-PCx հակամարմինով նշագրված ուղեղիկի կտորի օրինակ (մասշտաբի գիծ, ​​20 մկմ)։ Դեղին նետը ցույց է տալիս Պուրկինյեի բջջային մարմինը։ (Գ) Ժամանակի ընթացքի սպիտակուցի արտահայտման վերլուծությունը նույնականացվել է որպես աթերոսկլերոզի կարևոր թեկնածու (բազմակի t-թեստ, *FDR <5%; n = 3-5 մկներ)։ (Դ) Վերևում՝ Սխեմատիկ դիագրամ, որը ցույց է տալիս [1-13C]պիրուվատի նշագրիչում պարունակվող նշագրված ածխածնի մուտքագրման տարբեր եղանակները (այսինքն՝ PDH-ով կամ տրանս-զարկերակային ուղով)։ Ներքևում՝ Ջութակի դիագրամը ցույց է տալիս միանշանակ նշագրված ածխածնի (M1) տոկոսը, որը վերածվել է ասպարգինաթթվի, կիտրոնաթթվի և խնձորաթթվի՝ սուր ուղեղիկի կտորները [1-13C]պիրուվատով նշագրելուց հետո (զույգավորված t-թեստ; ** P <0.01)։ (Ե) Նշված ուղու համապարփակ ժամանակի պատմության վերլուծություն։ Դիտարկեք միայն P<0.05 ունեցող սպիտակուցները 8 շաբաթում։ Կետագիծ՝ առանց ճշգրտման արժեքի (երկկողմանի վարիացիայի վերլուծություն; * P <0.05; *** P <0.001): Տվյալները արտահայտված են որպես միջին ± ՍՄՄ:
Մեր վերլուծության մեջ BCAA կատաբոլիզմը դարձել է վերընթաց կարգավորման հիմնական ուղիներից մեկը: Այս փաստը հստակորեն ենթադրում է, որ TCA ցիկլ մտնող օդափոխության ծավալը կարող է փոխվել OXPHOS-ից զուրկ PN-ում: Սա կարող է ներկայացնել նեյրոնային նյութափոխանակության վերահղման հիմնական ձև, որը կարող է անմիջական ազդեցություն ունենալ նեյրոնային ֆիզիոլոգիայի և գոյատևման վրա OXPHOS-ի ծանր դիսֆունկցիայի պահպանման ընթացքում: Այս վարկածին համապատասխան՝ մենք պարզեցինք, որ PCx-ի հիմնական հակաաթերոսկլերոտիկ ֆերմենտը վերընթաց է (Mfn2cKO/CTRL-ը փոխվում է մոտավորապես 1.5 անգամ, նկար 3Ա), որը կատալիզացնում է պիրուվատի օքսալոացետատի փոխակերպումը (28), որը, ենթադրաբար, գտնվում է ուղեղի հյուսվածքում: BCAA-ի արտահայտությունը սահմանափակվում է աստրոցիտներով (29, 30): Պրոտեոմիկայի արդյունքներին համապատասխան՝ կոնֆոկալ մանրադիտակը ցույց տվեց, որ PCx արտահայտությունը հատուկ և զգալիորեն աճել է OXPHOS-ի պակասորդ ունեցող PN-ներում, մինչդեռ PCx ռեակտիվությունը հիմնականում սահմանափակվել է վերահսկիչ խմբի հարակից Բերգմանի գլիալ բջիջներով (Նկար 3Բ): PCx-ի դիտարկված ակտիվացումը ֆունկցիոնալորեն ստուգելու համար մենք սուր ուղեղիկի կտորները մշակել ենք [1-13C]պիրուվատի ցուցիչով: Երբ պիրուվատը օքսիդացվել է պիրուվատ դեհիդրոգենազի (PDH) կողմից, դրա իզոտոպային պիտակը անհետացել է, But-ը ներառվում է TCA ցիկլի միջանկյալ նյութերի մեջ, երբ պիրուվատը նյութափոխանակվում է անոթային ռեակցիաների միջոցով (Նկար 3D): Մեր պրոտեոմիկայի տվյալների հաստատման համար մենք դիտարկել ենք այս ցուցիչից մեծ թվով մարկերներ Mfn2cKO կտորների ասպարգինաթթվում, մինչդեռ կիտրոնաթթուն և խնձորաթթուն նույնպես ունեցել են չափավոր միտում, չնայած ոչ նշանակալի (Նկար 3D):
ՄիտոՊարկ մկների դոֆամինային նեյրոններում, որոնք ունեին միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիա, որը պայմանավորված էր դոֆամինային նեյրոնների կողմից միտոքոնդրիալ տրանսկրիպցիոն գործոն A գենի (Tfam) հատուկ ոչնչացմամբ (Նկար S6B), PCx-ի էքսպրեսիան նույնպես զգալիորեն բարձրացել էր (31), ինչը ցույց է տալիս, որ հիվանդության առաջացումը կարգավորվում է օրգանիզմում նեյրոնային OXPHOS-ի դիսֆունկցիայի ընթացքում: Հարկ է նշել, որ պարզվել է, որ եզակի ֆերմենտները (32-34), որոնք կարող են արտահայտվել նեյրոններում, որոնք կարող են կապված լինել աթերոսկլերոզի հետ, զգալիորեն բարձրացել են OXPHOS-ից զուրկ ՊՆ-ներում, ինչպիսիք են պրոպիոնիլ-CoA կարբօքսիլազը (PCC-A), մալոնիլ-CoA-ն փոխակերպում է պրոպիոնիլ-CoA-ն սուկցինիլ-CoA-ի և միտոքոնդրիալ խնձորային ֆերմենտ 3-ը (ME3), որի հիմնական դերը մալատից պիրուվատի վերականգնումն է (Նկար 3, A և C) (33, 35): Բացի այդ, մենք հայտնաբերեցինք Pdk3 ֆերմենտի զգալի աճ, որը ֆոսֆորիլացնում և այդպիսով ապաակտիվացնում է PDH-ն (36), մինչդեռ փոփոխություններ չեն հայտնաբերվել PDH-ն ակտիվացնող Pdp1 ֆերմենտում կամ PDH ֆերմենտային համալիրում (Նկար 3Ա): Համապատասխանաբար, Mern2cKO PN-ներում Ser293-ում (հայտնի է, որ արգելակում է PDH-ի ֆերմենտային ակտիվությունը) PDH համալիրի պիրուվատ դեհիդրոգենազ E1 բաղադրիչի α1 ենթամիավորի α (PDHE1α) ենթամիավորի ֆոսֆորիլացումը ուժեղացված էր (Նկար S6C) (Նկար S6C): Պիրուվատը անոթային մուտք չունի:
Վերջապես, մենք պարզեցինք, որ սերինի և գլիցինի կենսասինթեզի գերուղին, դրան առնչվող միտոքոնդրիալ ֆոլատի (1C) ցիկլը և պրոլինի կենսասինթեզը (Նկար 1G և Նկար S5C) զգալիորեն ակտիվանում են, ըստ հաղորդագրությունների, ակտիվացման գործընթացի ընթացքում: Շրջակա հյուսվածքները ակտիվանում են միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի դեպքում (5-7): Այս պրոտեոմիկայի տվյալները հաստատող կոնֆոկալ վերլուծությունը ցույց տվեց, որ OXPHOS-ի բացակայությամբ ծննդաբերության ժամանակ 8 շաբաթական մկների ուղեղիկի կտորները ենթարկվել են սերին հիդրօքսիմեթիլտրանսֆերազ 2-ի (SHMT2) ազդեցությանը, որը միտոքոնդրիալ ֆոլատի ցիկլի հիմնական ֆերմենտ է: Նշանակալից իմունային պատասխան (Նկար S5D): CU-գլյուկոզով ինկուբացված 13 սուր ուղեղիկի կտորներում նյութափոխանակության հետևման փորձերը հետագայում հաստատեցին սերինի և պրոլինի կենսասինթեզի ակտիվացումը՝ ցույց տալով, որ ածխածնի իզոֆորմների հոսքը դեպի սերին և պրոլին ավելացել է (Նկար S5E): Քանի որ GLS-ի և GPT2-ի կողմից խթանվող ռեակցիաները պատասխանատու են գլուտամինից գլուտամատի սինթեզի և գլուտամատի ու α-կետոգլուտարատի միջև տրանսամինացիայի համար, դրանց ակտիվացումը ցույց է տալիս, որ OXPHOS-ի դեֆիցիտ ունեցող նեյրոնները ունեն գլուտամատի ավելի մեծ պահանջարկ։ Սա կարող է նպատակաուղղված լինել պրոլինի ավելացված կենսասինթեզի պահպանմանը (Նկար S5C): Այս փոփոխությունների համեմատ, PN-սպեցիֆիկ Mfn2cKO մկների ուղեղիկի աստրոցիտների պրոտեոմիկ վերլուծությունը ցույց տվեց, որ այս ուղիները (ներառյալ բոլոր հակապերօքսիդազները) էականորեն չեն փոխվել արտահայտման մեջ, այդպիսով ցույց տալով, որ այս նյութափոխանակության վերահասցեավորումը ընտրողական է քայքայված PN-ի նկատմամբ (Նկար S6, D-ից G):
Ամփոփելով՝ այս վերլուծությունները բացահայտեցին ՊՆ-ներում որոշակի նյութափոխանակության ուղիների ժամանակային ակտիվացման զգալիորեն տարբեր օրինաչափություններ: Չնայած նեյրոնային միտոքոնդրիալ ֆունկցիայի աննորմալությունը կարող է հանգեցնել վաղ աթերոսկլերոզի և 1C վերակառուցման (Նկար 3E և Նկար S5C), և նույնիսկ I և IV համալիրների արտահայտման կանխատեսելի փոփոխությունների, սերինի de novo սինթեզի փոփոխությունները միայն ուշ փուլերում են նկատվում: OXPHOS դիսֆունկցիան (Նկար 3E և Նկար S5C): Այս արդյունքները սահմանում են հաջորդական գործընթաց, որի ընթացքում սթրեսից առաջացած միտոքոնդրիալ (1C ցիկլ) և ցիտոպլազմային (սերինի կենսասինթեզ) ռեակցիան սիներգիստորեն արձագանքում է TCA ցիկլում աթերոսկլերոզի աճի հետ՝ վերաձևավորելով նեյրոնային նյութափոխանակությունը:
8 շաբաթական OXPHOS-ի դեֆիցիտով ՊՆ-ները կարող են պահպանել բարձր հաճախականության գրգռման ակտիվություն և ենթարկվել զգալի նյութափոխանակության վերամիավորման՝ միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիան փոխհատուցելու համար: Այս հայտնագործությունը հետաքրքիր հնարավորություն է առաջացնում, որ նույնիսկ այս պահին այս բջիջները կարող են նաև ստանալ թերապևտիկ միջամտություն՝ նեյրոդեգեներացիան հետաձգելու կամ կանխելու համար: Ուշացած: Մենք այս հնարավորությունը լուծել ենք երկու անկախ միջամտությունների միջոցով: Առաջին մեթոդով մենք նախագծել ենք Cre-կախյալ ադենո-կապված վիրուսի (AAV) վեկտոր, որպեսզի MFN2-ը կարողանա ընտրողաբար արտահայտվել OXPHOS-ի դեֆիցիտով ՊՆ-ներում in vivo (Նկար S7A): MFN2 կոդավորող AAV-ն և mCherry ֆլուորեսցենտային ռեպորտերային գենը (Mfn2-AAV) ստուգվել են in vitro առաջնային նեյրոնային կուլտուրաներում, ինչը հանգեցրել է MFN2-ի Cre-կախյալ ձևով արտահայտմանը և փրկել միտոքոնդրիալ ձևաբանությունը, այդպիսով կանխելով նեյրոմուտացիան Mfn2cKO նեյրոններում (Նկար S7, B, D և E): Հաջորդը, մենք in vivo փորձեր անցկացրինք՝ ստերեոտակտիկորեն 8 շաբաթական Mfn2-AAV-ը Mfn2cKO և վերահսկիչ մկների ուղեղիկի կեղևին ներարկելու համար, և վերլուծեցինք 12 շաբաթական մկներին (Նկար 4A): Բուժված Mfn2cKO մկները մահացան (Նկար 1, A և B) (16): Վիրուսային տրանսդուկցիան in vivo հանգեցրեց PN-ի ընտրողական արտահայտման որոշ ուղեղիկի շրջանակներում (Նկար S7, G և H): Միայն mCherry արտահայտող վերահսկիչ AAV-ի ներարկումը (Ctrl-AAV) էական ազդեցություն չունեցավ Mfn2cKO կենդանիների մոտ նեյրոդեգեներացիայի աստիճանի վրա: Ի տարբերություն դրա, Mfn2-AAV-ով տրանսդուկցված Mfn2cKO-ների վերլուծությունը ցույց տվեց PN բջջային շերտի զգալի պաշտպանիչ ազդեցություն (Նկար 4, B և C): Մասնավորապես, նեյրոնների խտությունը, կարծես, գրեթե անզանազանելի է վերահսկիչ կենդանիներից (Նկար 4, B և C, և Նկար S7, H և I): MFN1-ի, բայց ոչ MFN2-ի արտահայտությունը հավասարապես արդյունավետ է նեյրոնների մահը կանխելու համար (Նկար 4C և Նկար S7, C և F), ինչը ցույց է տալիս, որ էկտոպիկ MFN1-ի արտահայտությունը կարող է արդյունավետորեն լրացնել MFN2-ի պակասը: Մեկ ներերակային մկների մակարդակով հետագա վերլուծությունը ցույց տվեց, որ Mfn2-AAV-ը մեծապես վերականգնել է միտոքոնդրիաների ուլտրակառուցվածքը, նորմալացրել է միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի մակարդակը և հակադարձել է հակաանգիոգենեզային PCx մարկերի բարձր արտահայտությունը (Նկար 4, C-ից E): Հանգստի վիճակում փրկված Mfn2cKO մկների տեսողական զննումը ցույց տվեց, որ նրանց կեցվածքը և շարժիչ ախտանիշները (շարժում S1-ից S3) բարելավվել են: Եզրակացնելով՝ այս փորձերը ցույց են տալիս, որ MFN2-ի հետաձգված վերաներդրումը OXPHOS-ով խիստ պակասող ներերակային մկների մեջ բավարար է միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի սպառումը հակադարձելու և աթերոսկլերոզ առաջացնելու համար, այդպիսով կանխելով աքսոնի դեգեներացիան և նեյրոնների մահը in vivo:
(A) Սխեմա, որը ցույց է տալիս MFN2 կոդավորող AAV ներարկման փորձարարական ժամանակացույցը, երբ նշված նյութափոխանակության ուղին ակտիվացված է։ (B) 12 շաբաթական ուղեղիկի կտորների ներկայացուցչական կոնֆոկալ պատկերներ, որոնք տրանսդուկցվել են 8 շաբաթում Mfn2cKO մկների մոտ և նշագրվել հակա-Կալբինդինային հակամարմինով։ Աջ՝ Աքսոնային մանրաթելերի մասշտաբավորում։ Աքսոնային զումի մասշտաբը 450 և 75 մկմ է։ (C) Ձախ՝ Պուրկինյեի բջիջների խտության քանակական որոշումը AAV տրանսդուկցիոն օղակում (AAV+) (վարիացիայի միակողմանի վերլուծություն; n = 3 մկ)։ Աջ՝ mtDNA ֆոկուսի վերլուծություն տրանսդուկցված PN-ում 12 շաբաթում (չզույգված t-փորձ; n = 6 բջիջ երեք մկներից)։ * P <0.05; ** P <0.01։ (D) Mfn2cKO ուղեղիկի կտորների PN-ների ներկայացուցչական փոխանցման էլեկտրոնային միկրոգրաֆիաներ, որոնք տրանսդուկցվել են նշված վիրուսային վեկտորներով։ Վարդագույն դիմակը պատկերում է դենդրիտների զբաղեցրած տարածքը, իսկ դեղին կետավոր քառակուսին՝ աջ կողմում տրված մեծացումը. n-ը ներկայացնում է կորիզը: Մասշտաբի գիծը՝ 1μm: (E)-ն ցույց է տալիս PCx ներկման օրինակ PN-ում, որը տրանսդուկցվել է 12 շաբաթականում: Մասշտաբի գիծը՝ 20μm: OE, գերարտահայտում; FC, ծալքի փոփոխություն:
Վերջապես, մենք ուսումնասիրեցինք պերօքսիդազով ինդուկցված բջիջների գոյատևման կարևորությունը OXPHOS դիսֆունկցիա ունեցած ՊՆ-ներում: Մենք ստեղծեցինք mCherry, որը կոդավորում էր AAV-shRNA (կարճ մազիկավոր ՌՆԹ), որը հատուկ թիրախավորում էր մկան PCx mRNA-ն (AAV-shPCx), և ներարկեցինք վիրուսը կամ դրա խառնված վերահսկիչը (AAV-scr) Mfn2cKO մկների ուղեղիկի մեջ: Ներարկումը կատարվել է չորրորդ շաբաթում (Նկար 5Ա)՝ PCx-ի արդյունավետ նոկդաուն ապահովելու համար այն ժամանակահատվածում, երբ PCx արտահայտությունը մեծացել էր (Նկար 3Գ), և ՊՆ բջջային շերտը դեռևս անվնաս էր (Նկար 1Ա): Հարկ է նշել, որ PCx-ի նոկդաունը (Նկար S8Ա) հանգեցնում է ՊՆ մահվան զգալի արագացման, որը սահմանափակվում է վարակված օղակով (Նկար 5, Բ և Գ): PCx-ի վերակարգմամբ առաջացած նյութափոխանակության էֆեկտների մեխանիզմը հասկանալու համար մենք ուսումնասիրեցինք ՊՆ-ների օքսիդա-վերականգնման վիճակը PCx նոկդաունից և AAV-միջնորդավորված օպտիկական կենսազգայուն Grx1-roGFP2-ի միաժամանակյա արտահայտումից հետո (Նկար S8, B-ից D)՝ գնահատելու գլուտատիոնային պեպտիդային օքսիդա-վերականգնման պոտենցիալի հարաբերական փոփոխությունը (38): Այնուհետև մենք կատարեցինք երկֆոտոնային ֆլուորեսցենտային կյանքի պատկերման մանրադիտակ (FLIM) 7 շաբաթական Mfn2cKO-ի կամ վերահսկիչ ծննդաբերողների սուր ուղեղի կտորներում՝ FLIM պայմանները ստուգելուց հետո ցիտոպլազմային օքսիդա-վերականգնման կարգավիճակի պոտենցիալ փոփոխությունները հայտնաբերելու համար (Նկար S8, E-ից G): Վերլուծությունը ցույց տվեց PCx էքսպրեսիա չունեցող մեկ Mfn2cKO ՊՆ-ների օքսիդացման վիճակի զգալի աճ, որը տարբերվում է վերահսկիչ նեյրոններից կամ Mfn2cKO ՊՆ-ներից, որոնք արտահայտում են միայն խառնված shRNA (Նկար 5, D և E): Երբ PCx էքսպրեսիան նվազեց, բարձր օքսիդացված վիճակ ցուցաբերող Mfn2cKO PN-ների տոկոսը մեծացավ ավելի քան երեք անգամ (Նկար 5E), ինչը ցույց է տալիս, որ PCx-ի բարձրացումը պահպանեց դեգեներացված նեյրոնների օքսիդա-վերականգնման կարողությունը։
(A) Սխեմա, որը ցույց է տալիս shPCx կոդավորող AAV ներարկման փորձարարական ժամանակացույցը, երբ նշված նյութափոխանակության ուղին ակտիվացված է։ (B) Mfn2cKO մկների 8 շաբաթական ուղեղիկի հատվածների ներկայացուցչական կոնֆոկալ լուսանկարներ, որոնք տրանսդուկցվել և նշագրվել են հակակալցինեուրինային հակամարմինով 4 շաբաթում։ Չափսերի սյունակ, 450 մկմ։ (C) Պուրկինյեի բջիջների խտության քանակական որոշումը AAV-տրանսդուկցված օղակներում (վարիացիայի միակողմանի վերլուծություն; n = 3-ից 4 մկներ)։ Տվյալները արտահայտվում են որպես միջին ± SEM; ***P<0.001։ (D) Ներկայացուցչական FLIM նկարը ցույց է տալիս 7 շաբաթական PN-ի միջին կյանքի տևողությունը, որը արտահայտում է գլուտատիոնային օքսիդա-վերականգնման սենսոր Grx1-roGFP2 նշված փորձարարական պայմաններում։ LUT (փնտրման աղյուսակ) հարաբերակցություն. գոյատևման ժամանակի միջակայք (պիկոսայրկյաններով)։ Չափսերի սյունակ, 25 մկմ։ (E) Հիստոգրամը ցույց է տալիս Grx1-roGFP2 կյանքի տևողության արժեքների բաշխումը (D)-ից (n=158-ից մինչև 368 բջիջ երկու մկների մոտ՝ յուրաքանչյուր պայմանի դեպքում): Յուրաքանչյուր հիստոգրամի վերևում գտնվող շրջանաձև դիագրամը ցույց է տալիս զգալիորեն ավելի երկար (կարմիր, օքսիդացված) կամ ավելի կարճ (կապույտ, կրճատված) կյանքի տևողության արժեքներ ունեցող բջիջների քանակը, որոնք գերազանցում են CTRL-AAV-scr-ում կյանքի տևողության միջին արժեքի 1 ստանդարտ շեղումը: (F) Առաջարկվող մոդելը ցույց է տալիս նեյրոնային PCx-ի ակտիվացման պաշտպանիչ ազդեցությունը:
Ամփոփելով՝ այստեղ ներկայացված տվյալները ցույց են տալիս, որ MFN2-ի վերարտահայտումը կարող է լիովին փրկել առաջադեմ ծայրամասային ծայրամասային հիվանդությունը՝ OXPHOS-ի ծանր անբավարարությամբ, mtDNA-ի ծանր սպառմամբ և ծայրահեղ աննորմալ իստա-անման ձևաբանությամբ, այդպիսով ապահովելով շարունակական առաջընթաց նույնիսկ առաջադեմ հիվանդությունների դեպքում: Նեյրոդեգեներացիան բջջային մահվան նախորդ փուլի շրջելի ապացույց է: Նյութափոխանակության ճկունության այս աստիճանը ավելի է ընդգծվում նեյրոնների աթերոսկլերոզ (TCA ցիկլի վերաձևավորում) առաջացնելու ունակությամբ, որը կանխում է PCx արտահայտությունը OXPHOS չունեցող ծայրամասային բջիջներում և ուժեղացնում բջջային մահը՝ այդպիսով խաղալով պաշտպանիչ դեր (Նկար 5F):
Այս ուսումնասիրության մեջ մենք ապացույցներ տրամադրեցինք, որ նեյրոնների OXPHOS դիսֆունկցիայի նկատմամբ արձագանքը աստիճանաբար զուգամիտվում է TCA ցիկլի աթերոսկլերոզի հետ՝ նյութափոխանակության ծրագրերի կողմից ակտիվացված դիֆերենցիալ ակտիվացման ուղու միջոցով: Մենք հաստատեցինք պրոտեոմիկ վերլուծությունը բազմաթիվ լրացուցիչ մեթոդներով և բացահայտեցինք, որ ծանր միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի դեպքում նեյրոններն ունեն նյութափոխանակության առաձգականության նախկինում անհայտ ձև: Մեր զարմանքին, վերամիավորման ամբողջ գործընթացը պարտադիր չէ, որ նշի նեյրոդեգեներացիային ուղեկցող վերջնական նյութափոխանակության վիճակը աստիճանաբար և անդառնալիորեն, բայց մեր տվյալները ենթադրում են, որ այն կարող է լինել պահպանման նեյրոն նույնիսկ բջջային մահվան նախորդող փուլում: Ֆունկցիոնալ փոխհատուցման մեխանիզմ: Այս հայտնագործությունը ցույց է տալիս, որ նեյրոնները մարմնում ունեն նյութափոխանակության պլաստիկության զգալի աստիճան: Այս փաստը ապացուցում է, որ MFN2-ի հետագա վերականգնումը կարող է հակադարձել հիմնական նյութափոխանակության մարկերների արտահայտությունը և կանխել նեյրոնների դեգեներացիան: Ընդհակառակը, այն կանխում է աթերոսկլերոզը և արագացնում նյարդերի աճը:
Մեր հետազոտության ամենահետաքրքիր արդյունքներից մեկն այն է, որ OXPHOS-ից զուրկ ներերակային բջիջները կարող են փոփոխել TCA ցիկլի նյութափոխանակությունը՝ բարձրացնելով այն ֆերմենտները, որոնք հատուկ խթանում են աթերոսկլերոզը: Նյութափոխանակության վերադասավորումը քաղցկեղի բջիջների տարածված առանձնահատկությունն է, որոնցից մի քանիսը ապավինում են գլուտամինին՝ TCA ցիկլի միջանկյալ նյութերը լրացնելու համար՝ վերականգնող համարժեքներ արտադրելու համար, որոնք խթանում են շնչառական շղթան և պահպանում լիպիդային և նուկլեոտիդային կենսասինթեզի նախորդների արտադրությունը (39, 40): Վերջերս կատարված ուսումնասիրությունը ցույց է տվել, որ OXPHOS դիսֆունկցիա ունեցող ծայրամասային հյուսվածքներում գլուտամինի/գլուտամատի նյութափոխանակության վերամիացումը նույնպես ակնառու առանձնահատկություն է (5, 41), որտեղ գլուտամինի TCA ցիկլ մուտք գործելու ուղղությունը կախված է OXPHOS վնասվածքի ծանրությունից (41): Այնուամենայնիվ, օրգանիզմում նեյրոնային նյութափոխանակության պլաստիկության որևէ նմանության և հիվանդության համատեքստում դրա հնարավոր նշանակության վերաբերյալ հստակ ապացույցներ չկան: Վերջերս կատարված in vitro ուսումնասիրության մեջ ցույց է տրվել, որ առաջնային կեղևային նեյրոնները մոբիլիզացնում են գլուտամատի պաշարները նեյրոհաղորդման համար, դրանով իսկ խթանելով օքսիդատիվ նյութափոխանակությունը և աթերոսկլերոզը նյութափոխանակության սթրեսի պայմաններում (42): Հարկ է նշել, որ TCA ցիկլի սուկցինատ դեհիդրոգենազ ֆերմենտի դեղաբանական արգելակման պայմաններում, ենթադրվում է, որ պիրուվատի կարբօքսիլացումը պահպանում է օքսալոացետատի սինթեզը ուղեղիկի հատիկավոր նեյրոններում (34): Այնուամենայնիվ, այս մեխանիզմների ֆիզիոլոգիական նշանակությունը ուղեղի հյուսվածքի համար (որտեղ, ենթադրվում է, որ աթերոսկլերոզը հիմնականում սահմանափակվում է աստրոցիտներով) դեռևս ունի կարևոր ֆիզիոլոգիական նշանակություն (43): Այս դեպքում մեր տվյալները ցույց են տալիս, որ OXPHOS-ի կողմից մարմնում վնասված նեյրոնները կարող են անցնել BCAA քայքայման և պիրուվատի կարբօքսիլացման, որոնք TCA ֆոնդի միջանկյալ նյութերի լրացման երկու հիմնական աղբյուրներն են: Չնայած առաջարկվել է BCAA կատաբոլիզմի ենթադրյալ ներդրումը նեյրոնային էներգիայի նյութափոխանակության մեջ, գլուտամատի և GABA-ի դերից բացի նեյրոհաղորդման համար (44), դեռևս չկան ապացույցներ այս մեխանիզմների վերաբերյալ in vivo: Հետևաբար, հեշտ է ենթադրել, որ դիսֆունկցիոնալ նեյրոնները կարող են ավտոմատ կերպով փոխհատուցել TCA միջանկյալ նյութերի սպառումը, որը պայմանավորված է ասիմիլյացիայի գործընթացով՝ մեծացնելով աթերոսկլերոզը: Մասնավորապես, PCx-ի ակտիվացումը կարող է անհրաժեշտ լինել ասպարգինաթթվի աճող պահանջարկը պահպանելու համար, ինչը ենթադրվում է միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիա ունեցող բազմացող բջիջներում (45): Այնուամենայնիվ, մեր մետաբոլոմիկական վերլուծությունը չի բացահայտել Mfn2cKO PN-ներում ասպարգինաթթվի կայուն մակարդակի որևէ էական փոփոխություն (Նկար S6A), որը, ենթադրաբար, արտացոլում է ասպարգինաթթվի տարբեր նյութափոխանակային օգտագործումը բազմացող բջիջների և հետմիտոտիկ նեյրոնների միջև: Չնայած դիսֆունկցիոնալ նեյրոններում PCx-ի ակտիվացման ճշգրիտ մեխանիզմը in vivo դեռ պետք է բնութագրվի, մենք ցույց տվեցինք, որ այս վաղաժամ արձագանքը կարևոր դեր է խաղում նեյրոնների օքսիդա-վերականգնման վիճակի պահպանման գործում, ինչը ցույց է տրվել ուղեղիկի կտորների վրա FLIM փորձերի ժամանակ: Մասնավորապես, PN-ների կողմից PCx-ի ակտիվացումը կանխելը կարող է հանգեցնել ավելի օքսիդացված վիճակի և արագացնել բջջային մահը: BCAA-ի քայքայման ակտիվացումը և պիրուվատի կարբօքսիլացումը միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի ծայրամասային հյուսվածքները բնութագրելու միջոցներ չեն (7): Հետևաբար, դրանք, կարծես, OXPHOS-ի դեֆիցիտ ունեցող նեյրոնների առաջնահերթ առանձնահատկությունն են, նույնիսկ եթե ոչ միակ առանձնահատկությունը, որը կարևոր է նեյրոդեգեներացիայի համար։
Ուղեղիկի հիվանդությունը նեյրոդեգեներատիվ հիվանդության տարասեռ տեսակ է, որը սովորաբար դրսևորվում է որպես ատաքսիա և հաճախ վնասում է ուղեղիկի բջիջները (46): Այս նեյրոնային պոպուլյացիան հատկապես խոցելի է միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի նկատմամբ, քանի որ մկների մոտ դրանց ընտրողական դեգեներացիան բավարար է մարդու սպինոցերեբելյար ատաքսիային բնորոշ շատ շարժիչ ախտանիշներ վերարտադրելու համար (16, 47, 48): Ըստ հաղորդագրությունների, մուտանտ գենով տրանսգենային մկան մոդելը կապված է մարդու սպինոցերեբելյար ատաքսիայի հետ և ունի միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիա (49, 50), ինչը ընդգծում է OXPHOS անբավարարության հետևանքների ուսումնասիրության կարևորությունը ուղեղիկի բջիջների ամբողջական պոպուլյացիայի դեպքում: Հետևաբար, հատկապես հարմար է այս եզակի նեյրոնային պոպուլյացիան արդյունավետորեն մեկուսացնել և ուսումնասիրել: Այնուամենայնիվ, հաշվի առնելով, որ ուղեղիկի բջիջները շատ զգայուն են ճնշման նկատմամբ և կազմում են ամբողջ ուղեղիկի բջջային պոպուլյացիայի ցածր մասը, օմիկայի վրա հիմնված շատ ուսումնասիրությունների համար դրանց ընտրողական բաժանումը որպես ամբողջական բջիջներ դեռևս մարտահրավեր է: Չնայած գրեթե անհնար է հասնել այլ բջջային տեսակների (հատկապես չափահաս հյուսվածքների) աղտոտման բացարձակ բացակայությանը, մենք համատեղեցինք արդյունավետ դիսոցիացիայի քայլը FACS-ի հետ՝ ստանալով բավարար քանակությամբ կենսունակ նեյրոններ հոսանքն ի վար պրոտեոմիկայի վերլուծության համար, և ստացանք բավականին բարձր սպիտակուցային ծածկույթ (մոտ 3000 սպիտակուց)՝ համեմատած ամբողջ ուղեղիկի առկա տվյալների հավաքածուի հետ (51): Պահպանելով ամբողջական բջիջների կենսունակությունը, այստեղ ներկայացված մեր մեթոդը թույլ է տալիս մեզ ոչ միայն ստուգել միտոքոնդրիաների նյութափոխանակության ուղիների փոփոխությունները, այլև ստուգել դրանց ցիտոպլազմային համապատասխանների փոփոխությունները, ինչը լրացնում է միտոքոնդրիալ թաղանթային պիտակների օգտագործումը՝ բջջային տեսակը հարստացնելու համար: Նոր մեթոդ՝ բարդ հյուսվածքներում միտոքոնդրիաների քանակի համար (52, 53): Մեր նկարագրած մեթոդը կապված է ոչ միայն Պուրկինյեի բջիջների ուսումնասիրության հետ, այլև կարող է հեշտությամբ կիրառվել ցանկացած տեսակի բջջի վրա՝ հիվանդ ուղեղներում նյութափոխանակության փոփոխությունները, ներառյալ միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի այլ մոդելները լուծելու համար:
Վերջապես, մենք այս նյութափոխանակության վերադասավորման գործընթացում բացահայտել ենք թերապևտիկ պատուհան, որը կարող է ամբողջությամբ շրջել բջջային սթրեսի հիմնական նշանները և կանխել նեյրոնների դեգեներացիան: Հետևաբար, այստեղ նկարագրված վերահղման ֆունկցիոնալ հետևանքների ըմբռնումը կարող է հիմնարար պատկերացում տալ միտոքոնդրիալ դիսֆունկցիայի ժամանակ նեյրոնների կենսունակությունը պահպանելու հնարավոր բուժումների վերաբերյալ: Անհրաժեշտ են ապագա հետազոտություններ, որոնք ուղղված կլինեն ուղեղի այլ բջիջների էներգետիկ նյութափոխանակության փոփոխությունների վերլուծությանը՝ այս սկզբունքի կիրառելիությունը այլ նյարդաբանական հիվանդությունների դեպքում լիովին բացահայտելու համար:
MitoPark մկները նախկինում նկարագրվել են (31): C57BL/6N մկները, որոնք ունեն loxP-ի կողմնային Mfn2 գեները, նախկինում նկարագրվել են (18) և խաչասերվել են L7-Cre մկների հետ (23): Արդյունքում ստացված կրկնակի հետերոզիգոտ սերունդները այնուհետև խաչասերվել են հոմոզիգոտ Mfn2loxP/Mfn2loxP մկների հետ՝ Mfn2-ի համար Պուրկինյեի հատուկ գեների նոկաուտներ առաջացնելու համար (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre): Զուգավորման ենթաբազմության մեջ Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP ալելը (stop-mtYFP) ներմուծվել է լրացուցիչ խաչասերման միջոցով (20): Կենդանիների վրա կատարված բոլոր ընթացակարգերը կատարվել են եվրոպական, ազգային և ինստիտուցիոնալ ուղեցույցներին համապատասխան և հաստատվել են Գերմանիայի Հյուսիսային Հռենոս-Վեստֆալիայի Ումվելտի և Վերբրաուխերշուտցի LandesamtfürNatur-ի կողմից: Կենդանիների վրա աշխատանքը նաև հետևում է Լաբորատոր կենդանիների գիտությունների եվրոպական ասոցիացիաների ֆեդերացիայի ուղեցույցներին:
Հղի կնոջ պարանոցային հոդախախտը անզգայացնելուց հետո մկան սաղմը մեկուսացվել է (E13): Կեղևը դիսեկցվել է Հենքսի հավասարակշռված աղի լուծույթում (HBSS), որը լրացվել է 10 մՄ Hepes-ով, և տեղադրվել է Dulbecco-ի փոփոխված Eagle's միջավայրում, որը պարունակում է պապաին (20 ՄՄ/մլ) և ցիստեին (1 մկգ/մլ): Հյուսվածքը ինկուբացվել է DMEM-ում և դիսոցացվել է ֆերմենտատիվ մարսմամբ (Ml) 37°C ջերմաստիճանում 20 րոպե, ապա մեխանիկորեն մանրացվել է DMEM-ում, որը լրացվել է 10% պտղի խոշոր եղջերավոր անասունի շիճուկով: Բջիջները ցանվել են պոլիլիզինով պատված ապակե ծածկոցների վրա՝ 6 սմ կուլտուրայի ամանի համար 2×106 խտությամբ կամ 0.5×105 բջիջ/սմ2 խտությամբ՝ պատկերագրական վերլուծության համար: 4 ժամ անց միջավայրը փոխարինվել է Neurobasal շիճուկից զերծ միջավայրով, որը պարունակում է 1% B27 հավելում և 0.5 մՄ GlutaMax: Այնուհետև նեյրոնները պահպանվել են 37°C ջերմաստիճանում և 5% CO2-ի պայմաններում ողջ փորձի ընթացքում և սնուցվել են շաբաթը մեկ անգամ: In vitro ռեկոմբինացիան ինդուկցելու համար, in vitro երկրորդ օրը նեյրոնները բուժելու համար օգտագործվել է հետևյալ AAV9 վիրուսային վեկտորի 3 մկլ (24-փոսանի կուլտուրայի աման) կամ 0.5 մկլ (24-փոսանի աման)՝ AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, կատալոգի համար 105530-AAV9) և AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, կատալոգի համար 105545-AAV9):
Մկան Mfn1 և Mfn2 լրացուցիչ ԴՆԹ-ն (ստացված համապատասխանաբար Addgene #23212 և #23213 պլազմիդներից) նշված են V5 հաջորդականությամբ (GKPIPNPLLGLDST) C-ծայրամասում և միաձուլված են mCherry-ի հետ T2A հաջորդականության միջոցով։ Grx1-roGFP2-ը Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum)-ի նվեր է։ tdTomato կասետը փոխարինելով ավանդական կլոնավորման մեթոդներով, կասետը ենթակլոնավորվել է pAAV-CAG-FLEX-tdTomato հիմնական շղթայում (Addgene հղման համար 28306)՝ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 և pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 վեկտորներ ստանալու համար։ Նմանատիպ ռազմավարություն է կիրառվել pAAV-CAG-FLEX-mCherry վերահսկիչ վեկտորը ստանալու համար: AAV-shPCx կոնստրուկտը ստանալու համար անհրաժեշտ է պլազմիդային AAV վեկտոր (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), որը պարունակում է մկան PCx-ին ուղղված shRNA-ն կոդավորող ԴՆԹ հաջորդականությունը (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′): U6 պրոմոտորի վերահսկողության ներքո mCherry-ն օգտագործվում է CMV պրոմոտորի վերահսկողության ներքո: Օժանդակ AAV վեկտորների արտադրությունը իրականացվել է արտադրողի հրահանգների համաձայն (Cell Biolabs): Հակիրճ ասած, օգտագործեք mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) պարունակող փոխանցման պլազմիդ։ 293AAV բջիջների՝ T2A-MFN1-V5, mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) կամ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) կոդավորող գենի ժամանակավոր տրանսֆեկցիա, ինչպես նաև AAV1 կապսիդային սպիտակուցը և լրացուցիչ սպիտակուցը փաթեթավորող պլազմիդային պլազմիդը՝ օգտագործելով կալցիումի ֆոսֆատի մեթոդը։ Վիրուսի հում վերին շերտը ստացվել է սառեցման-հալեցման ցիկլերով չոր սառույցի/էթանոլի լոգարանում և լիզացվել է ֆոսֆատային բուֆերային աղաջրում (PBS): AAV վեկտորը մաքրվել է անընդհատ յոդիքսանոլի գրադիենտային ուլտրակենտրոնացման միջոցով (24 ժամ 32,000 պտ/րոպե արագությամբ և 4°C ջերմաստիճանում) և խտացվել է Amicon ultra-15 կենտրոնախույս ֆիլտրի միջոցով: AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 գենոմի պատճեն (ԳԿ)/մլ], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 ԳԿ/մլ), AAV1-CAG-FLEX-ի գենոմի տիտրը կատարվել է նախկինում նկարագրվածի պես (54), չափվել է իրական ժամանակի քանակական ՊՇՌ (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 ԳԿ/մլ) և AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 ԳԿ/մլ) միջոցով:
Առաջնային նեյրոնները քերիչով հեռացվել են սառցե 1x PBS լուծույթում, հատիկավորվել և այնուհետև հոմոգենացվել են 0.5% Triton X-100 / 0.5% նատրիումի դեօքսիխոլատ/PBS լիզիսի բուֆերում, որը պարունակում է ֆոսֆատազ և պրոտեազի ինհիբիտոր (Roche): Սպիտակուցների քանակական որոշումը կատարվել է բիցինխինինաթթվի անալիզով (Thermo Fisher Scientific): Այնուհետև սպիտակուցները բաժանվել են SDS-պոլիակրիլամիդային գել էլեկտրոֆորեզով, ապա բլոտացվել են պոլիվինիլիդեն ֆտորիդային թաղանթի վրա (GE Healthcare): Բլոկային ոչ սպեցիֆիկ տեղամասերը փակել և ինկուբացել առաջնային հակամարմնի հետ (տե՛ս աղյուսակ S1 մանրամասները) 5% կաթի մեջ TBST-ում (Tris-բուֆերացված աղային լուծույթ Tween-ով), լվացման փուլերը և երկրորդային հակամարմինը TBST ինկուբատում: Ինկուբացել առաջնային հակամարմնի հետ գիշերը +4°C ջերմաստիճանում: Լվանալուց հետո երկրորդային հակամարմինը քսել 2 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում: Հետագայում, նույն բլոտը հակա-β-ակտինային հակամարմնի հետ ինկուբացելով, հաստատվել է նույն բեռնվածությունը: Հայտնաբերում՝ քեմիլյումինեսցենցիայի փոխակերպման և քեմիլյումինեսցենցիայի ուժեղացման միջոցով (GE Healthcare):
Ապակե ծածկոցների վրա նախկինում ցանված նեյրոնները ֆիքսվել են 4% պարաֆորմալդեհիդով (PFA)/PBS-ով նշված ժամանակահատվածում սենյակային ջերմաստիճանում 10 րոպե։ Ծածկոցները նախ ներծծվել են 0.1% Triton X-100/PBS-ով 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում, ապա՝ արգելափակող բուֆերում [3% խոշոր եղջերավոր անասունների շիճուկային ալբումին (BSA)/PBS]։ Երկրորդ օրը ծածկոցները լվացվել են արգելափակող բուֆերով և ինկուբացվել համապատասխան ֆլուորոֆոր-կոնյուգացված երկրորդային հակամարմնի հետ 2 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում։ Վերջապես, նմուշները մանրակրկիտ լվացվել են PBS-ում 4',6-դիամիդինո-2-ֆենիլինդոլով (DAPI), որը հականերկվել է, ապա ֆիքսվել են մանրադիտակի սահիկի վրա Aqua-Poly/Mount-ով։
Մկներին (արու և էգ) անզգայացրել են կետամինի (130 մգ/կգ) և քսիլազինի (10 մգ/կգ) ներորովայնային ներարկմամբ և ենթամաշկային ներարկել են կարպրոֆեն ցավազրկող (5 մգ/կգ) և տեղադրել ստերեոտաքսիկ սարքի (Kopf) մեջ, որը հագեցած է տաք բարձիկով։ Բացել գանգը և ատամնաբուժական փորվածքով բարակեցնել ուղեղիկի կեղևի այն մասը, որը համապատասխանում է միս ոսկորին (լամբդայից՝ պոչ 1.8, կողմնային 1, որը համապատասխանում է IV և V լոբուլներին)։ Կոր ներարկիչի ասեղի միջոցով զգուշորեն փոքրիկ անցք է բացվում գանգի վրա՝ ներքևի անոթային համակարգի խաթարումը կանխելու համար։ Այնուհետև բարակ գծված ապակե մազանոթը դանդաղորեն տեղադրվում է միկրոանցքի մեջ (կարծր թաղանթի որովայնային կողմում՝ -1.3-ից մինչև -1), և 200-300 նլ AAV ներարկվում է միկրոինյեկտորի (Narishige) մեջ ձեռքի ներարկիչներով (Narishige) մի քանի անգամ ցածր ճնշման տակ՝ 10-20 րոպե ընդմիջումներով։ Ներարկումից հետո մազանոթը տեղադրեք ևս 10 րոպե, որպեսզի վիրուսը լիովին տարածվի: Մազանոթները հանելուց հետո մաշկը զգուշորեն կարվում է՝ վերքի բորբոքումը նվազագույնի հասցնելու և կենդանուն վերականգնվելու հնարավորություն տալու համար: Վիրահատությունից հետո մի քանի օր կենդանիները բուժվել են ցավազրկողներով (կասպոֆեն), որի ընթացքում նրանց ֆիզիկական վիճակը ուշադիր մոնիթորինգի է ենթարկվել, ապա նշանակված ժամին ենթարկվել են էվթանազիայի: Բոլոր ընթացակարգերը կատարվել են եվրոպական, ազգային և ինստիտուցիոնալ ուղեցույցներին համապատասխան և հաստատվել են Գերմանիայի Հյուսիսային Հռենոս-Վեստֆալիայի Բնության դաշնային ծառայության կողմից:
Կենդանիներին անզգայացրել են կետամինով (100 մգ/կգ) և քսիլազինով (10 մգ/կգ), իսկ սիրտը նախ պերֆուզիայի է ենթարկվել 0.1 Մ PBS-ով, ապա՝ 4% PFA-ով PBS-ի մեջ։ Հյուսվածքը դիսեկցիայի է ենթարկվել և ֆիքսացվել է 4% PFA/PBS-ի մեջ գիշերը 4°C ջերմաստիճանում։ PBS-ի մեջ ֆիքսված ուղեղից սագիտալ հատվածներ (50 մկմ հաստությամբ) պատրաստելու համար օգտագործվել է թրթռացող դանակ (Leica Microsystems GmbH, Վիեննա, Ավստրիա)։ Եթե այլ բան նշված չէ, ազատ լողացող հատվածների ներկումը կատարվել է վերը նկարագրվածի պես (13) սենյակային ջերմաստիճանում և խառնելով։ Ամփոփելով՝ նախ ստացված կտորները թափանցելի են դարձել 0.5% Triton X-100/PBS-ով 15 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում. որոշ էպիտոպների (Pcx և Shmt2) համար՝ տրիս-EDTA բուֆերում 80°C ջերմաստիճանում (PH 9), այս քայլի փոխարեն կտորները տաքացնել 25 րոպե։ Հաջորդը, կտրվածքները ինկուբացվեցին առաջնային հակամարմնի հետ (տե՛ս աղյուսակ S1) արգելափակող բուֆերի մեջ (3% BSA/PBS) 4°C ջերմաստիճանում՝ ամբողջ գիշեր խառնելով։ Հաջորդ օրը կտրվածքները լվացվեցին արգելափակող բուֆերով և ինկուբացվեցին համապատասխան ֆտորոֆոր-կոնյուգացված երկրորդային հակամարմնի հետ 2 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում։ Վերջապես, կտրվածքները մանրակրկիտ լվացվեցին PBS-ում, հականերկվեցին DAPI-ով, ապա ֆիքսվեցին AquaPolymount-ով մանրադիտակի սահիկի վրա։
Նմուշը պատկերելու համար օգտագործվել է լազերային սկանավորող կոնֆոկալ մանրադիտակ (TCS SP8-X կամ TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), որը հագեցած է սպիտակ լույսի լազերով և 405 դիոդային ուլտրամանուշակագույն լազերով: Ֆլուորոֆորը գրգռելով և ազդանշանը հավաքելով Հիբրիդային դետեկտորով (HyDs), LAS-X ծրագիրը օգտագործվել է Նիկվիստի նմուշառմանը համապատասխան կույտավորված պատկերներ հավաքելու համար հաջորդական ռեժիմով. ոչ քանակական վահանակների համար դրանք բարձր դինամիկ ազդանշաններ են (օրինակ՝ սոմատիկ բջիջներում և դենդրիտներում) (mtYFP): HyD-ն օգտագործվում է PN-ների քանակը BrightR ռեժիմում հայտնաբերելու համար): Ֆոնը նվազեցնելու համար կիրառվում է 0.3-ից մինչև 6 նվ դարպաս:
Տեսակավորված բջիջների իրական ժամանակի պատկերացում։ 1% B27 հավելանյութ և 0.5 մՄ GlutaMax պարունակող Neurobasal-A միջավայրում տեսակավորումից հետո բջիջները անմիջապես տեղադրվեցին պոլի-L-լիզինով պատված ապակե սլայդների վրա (μ-Slide8 Well, Ibidi, կատալոգի համար 80826), այնուհետև պահվեցին 37°C ջերմաստիճանում և 5% CO2 պայմաններում 1 ժամ, որպեսզի բջիջները նստեն։ Իրական ժամանակի պատկերումը կատարվեց Leica SP8 լազերային սկանավորող կոնֆոկալ մանրադիտակի վրա, որը հագեցած էր սպիտակ լազերով, HyD-ով, 63×[1.4 թվային ապերտուրայով (NA)] յուղային օբյեկտիվով և տաքացման աստիճանով։
Մկան արագ անզգայացվեց ածխաթթու գազով և գլխատվեց, ուղեղը արագ հեռացվեց գանգից և կտրվեց 200 մկմ հաստությամբ (13C մակնշման փորձի համար) կամ 275 մկմ հաստությամբ (երկու ֆոտոնային փորձերի համար) սագիտալ հատվածի, որը լցված էր հետևյալ նյութերով։ Պաղպաղակը (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Գերմանիա) լցված է հետևյալ նյութերով՝ 125 մՄ սառցե, ածխածնով հագեցած (95% O2 և 5% CO2) ցածր Ca2 + արհեստական ​​​​ուղեղ-ողնուղեղային հեղուկ (ACSF) NaCl, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆեր, 25 մՄ NaHCO3, 25 մՄ գլյուկոզ, 0.5 մՄ CaCl2 և 3.5 մՄ MgCl2 (օսմոտիկ ճնշում՝ 310-ից 330 մմոլ)։ Ստացված ուղեղի կտորները տեղափոխեք նախաինկուբացիոն խցիկ, որը պարունակում է ավելի բարձր Ca2 + ACSF (125.0 մՄ NaCl, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆեր, 25.0 մՄ NaHCO3, 25.0 մՄ d-գլյուկոզ, 1.0 մՄ CaCl2 և 2.0 մՄ MgCl2) Միջավայր (pH 7.4 և 310-ից 320 մմոլ):
Պատկերման գործընթացի ընթացքում կտորները տեղափոխվել են հատուկ պատկերման սենյակ, և փորձը կատարվել է անընդհատ ACSF պերֆուզիայի պայմաններում՝ 32°-ից 33°C հաստատուն ջերմաստիճանում: Կտորների պատկերման համար օգտագործվել է բազմաֆոտոնային լազերային սկանավորող մանրադիտակ (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), որը հագեցած է Leica 25x օբյեկտիվ ոսպնյակով (NA 0.95, ջուր), Ti: Sapphire լազեր (Chameleon Vision II, Coherent): FLIM մոդուլ (PicoHarp300, PicoQuant):
Grx1-roGFP2-ի FLIM: ՊՆ-ների ցիտոպլազմային օքսիդա-վերականգնման վիճակի փոփոխությունները չափվել են երկֆոտոնային FLIM-ով սագիտալ ուղեղի կտորներում, որտեղ Grx1-roGFP2 կենսասենսորը թիրախավորել է ՊՆ-ները: ՊՆ շերտում ձեռքբերման դաշտը ընտրվում է կտորի մակերեսից մոտ 50-80 մկմ ներքև՝ ապահովելու համար, որ կա կենսունակ ՊՆ (այսինքն՝ դենդրիտների երկայնքով ուլունքաձև կառուցվածքի կամ նեյրոնային ձևաբանական փոփոխությունների բացակայություն) և կրկնակի դրական roGFP2 սենսորը և AAV-ն, որոնք կոդավորում են shRNA PCx-ը կամ դրա վերահսկիչ հաջորդականությունը (յուրաքանչյուրը համատեղ արտահայտում է mCherry): Հավաքեք միաշերտ պատկերները 2x թվային մեծացմամբ [գրգռման ալիքի երկարություն՝ 890 նմ; 512 նմ 512 պիքսել]: Հայտնաբերում. ներքին HyD, ֆլուորեսցեինի իզոտիոցիանատի (FITC) ֆիլտրի խումբ] և պատկերի միջինացումը 2-3 րոպեի ընթացքում օգտագործվում են՝ ապահովելու համար, որ հավաքվեն բավարար ֆոտոններ (ընդհանուր առմամբ 1000 ֆոտոն) կորի համապատասխանեցման համար: Grx1-roGFP2 զոնդի զգայունությունը և FLIM պայմանների ստուգումը կատարվել են՝ մոնիթորինգ անելով roGFP2-ի կյանքի տևողության արժեքը՝ պերֆուզիայի ACSF-ին էկզոգեն 10 մՄ H2O2 ավելացնելիս (օքսիդացումը մեծացնելու, ինչը հանգեցնում է կյանքի տևողության ավելացման), ապա 2 մՄ դիթիոթրեիտոլ ավելացնելիս (նվազեցնում է վերականգնման աստիճանը, ինչը հանգեցնում է կյանքի տևողության նվազմանը) (Նկար S8, D-ից G): Ստացված արդյունքները վերլուծելու համար օգտագործեք FLIMfit 5.1.1 ծրագիրը, ամբողջ պատկերի միակ էքսպոնենցիալ քայքայման կորը համապատասխանեցրեք չափված IRF-ին (սարքի արձագանքման ֆունկցիա), և χ2-ը մոտավորապես 1 է: Մեկ PN-ի կյանքի տևողությունը հաշվարկելու համար ձեռքով գծվել է նյարդային մարմնի շուրջը գտնվող դիմակը, և քանակականացման համար օգտագործվել է յուրաքանչյուր դիմակի միջին կյանքի տևողությունը:
Միտոքոնդրիալ պոտենցիալի վերլուծություն։ Սուր հատվածը 30 րոպե ինկուբացվելուց հետո, երբ այն անմիջապես ավելացվել է պերֆուզացված ACSF-ին, ՊՆ-ների միտոքոնդրիալ պոտենցիալի փոփոխությունները չափվել են երկֆոտոնային մանրադիտակով։ TMRM պատկերումը կատարվել է զոնդը 920 նմ-ում գրգռելով և ներքին HyD (տետրամեթիլռոդամինի իզոտիոցիանատ՝ 585/40 նմ) ​​օգտագործելով ազդանշաններ հավաքելու համար. mtYFP-ն պատկերելու համար օգտագործելով նույն գրգռման ալիքի երկարությունը, բայց տարբեր ներքին HyD (FITC :525/50)։ Օգտագործեք ImageJ-ի Image Calculator հավելվածը՝ միաբջջային մակարդակում միտոքոնդրիալ պոտենցիալը գնահատելու համար։ Հակիրճ ասած, հավելվածի հավասարումը՝ ազդանշան = րոպե (mtYFP, TMRM), օգտագործվում է համապատասխան ալիքի միակողմանի կոնֆոկալ պատկերում Պուրկինյեի սոմալիով TMRM ազդանշանը ցույց տվող միտոքոնդրիալ շրջանը նույնականացնելու համար։ Այնուհետև ստացված դիմակի պիքսելային մակերեսը քանակականացվում է, ապա նորմալացվում mtYFP ալիքի համապատասխան շեմային միաշերտ պատկերի վրա՝ միտոքոնդրիալ պոտենցիալը ցույց տվող միտոքոնդրիալ ֆրակցիան ստանալու համար։
Պատկերը վերլուծվել է Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) ծրագրով։ Սալիկների սկանավորված նկարների համար մեկ սալիկի մոնտաժը կատարվում է LAS-X ծրագրաշարի կողմից տրամադրված ավտոմատ կարման ալգորիթմի միջոցով։ Պատկերի կարգաբերումից հետո ImageJ-ը և Adobe Photoshop-ը օգտագործվում են պատկերը հետագա մշակելու և պայծառությունն ու հակադրությունը միատարր կարգավորելու համար։ Գրաֆիկական պատրաստման համար օգտագործվում է Adobe Illustrator-ը։
Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի ֆոկուսային վերլուծություն: Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի վնասվածքների քանակը քանակականացվել է ԴՆԹ-ի դեմ հակամարմիններով նշված ուղեղիկի հատվածների վրա՝ կոնֆոկալ մանրադիտակի միջոցով: Յուրաքանչյուր թիրախային տարածք ստեղծվել է բջջային մարմնի և յուրաքանչյուր բջջի կորիզի համար, և համապատասխան տարածքը հաշվարկվել է Multi Measure հավելվածի միջոցով (ImageJ ծրագրակազմ): Բջջային մարմնի տարածքից հանեք միջուկային տարածքը՝ ցիտոպլազմային տարածքը ստանալու համար: Վերջապես, Analyze Particles հավելվածը (ImageJ ծրագրակազմ) օգտագործվել է շեմային պատկերի վրա միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն ցույց տվող ցիտոպլազմային ԴՆԹ կետերը ավտոմատ կերպով քանակականացնելու համար, և ստացված արդյունքները նորմալացվել են CTRL մկների PN միջինին: Արդյունքները արտահայտվում են որպես բջջի մեջ նուկլեոզիդների միջին քանակ:
Սպիտակուցի արտահայտման վերլուծություն: Օգտագործեք ImageJ-ի Image Calculator հավելվածը՝ PN-ում սպիտակուցի արտահայտումը մեկ բջջային մակարդակում գնահատելու համար: Հակիրճ ասած, համապատասխան ալիքի միաշերտ կոնֆոկալ պատկերում, ազդանշան = min (mtYFP, հակամարմին) հավասարման միջոցով, նույնականացվում է միտոքոնդրիալ շրջանը, որը ցույց է տալիս իմունառեակտիվություն Պուրկինայի որոշակի հակամարմնի նկատմամբ: Այնուհետև ստացված դիմակի պիքսելային տարածքը քանակականացվում է, ապա նորմալացվում mtYFP ալիքի համապատասխան շեմային միաշերտ պատկերի վրա՝ ցուցադրված սպիտակուցի միտոքոնդրիալ մասնաբաժինը ստանալու համար:
Պուրկինյեի բջիջների խտության վերլուծություն: ImageJ-ի Cell Counter հավելվածն օգտագործվել է Պուրկինյեի խտությունը գնահատելու համար՝ հաշվարկված Պուրկինյեի բջիջների քանակը բաժանելով հաշվարկված բջիջների կողմից զբաղեցված ուղեղիկի օղակի երկարության վրա:
Նմուշի պատրաստում և հավաքում։ Վերահսկիչ խմբի և Mfn2cKO մկների ուղեղները ֆիքսվել են 2% PFA/2.5% գլուտարալդեհիդում՝ 0.1 Մ ֆոսֆատային բուֆերում (PB), ապա պսակաձև կտրվածքները պատրաստվել են թարթիչների միջոցով (Leica Mikrosysteme GmbH, Վիեննա, Ավստրիա) (Հաստությունը՝ 50-ից 60 մկմ): Այնուհետև ֆիքսվել են PB բուֆերում՝ 1% os tetraoxide-ում և 1.5% կալիումի ֆերոցիանիդում սենյակային ջերմաստիճանում 1 ժամ: Կտրվածքները լվացվել են երեք անգամ թորած ջրով, ապա ներկվել են 70% էթանոլով, որը պարունակում է 1% ուրանիլացետատ 20 րոպե: Այնուհետև կտրվածքները ջրազրկվել են աստիճանավորված սպիրտի մեջ և ներդրվել Durcupan ACM (Araldite casting resin M) էպօքսիդային խեժում (Electron Microscopy Sciences, կատալոգի համար 14040) սիլիցիումապատ ապակե սլայդների միջև, և վերջապես 60°C ջերմաստիճանում պոլիմերացվել են ջեռոցում 48 ժամ: Ընտրվել է ուղեղիկի կեղևի հատվածը, և Leica Ultracut-ի (Leica Mikrosysteme GmbH, Վիեննա, Ավստրիա) վրա կտրվել են 50 նմ գերբարակ հատվածներ, որոնք վերցվել են պոլիստիրոլային թաղանթով պատված 2×1 մմ պղնձե ճեղքային ցանցի վրա։ Կտրվածքները ներկվել են H2O-ի մեջ 4% ուրանիլացետատի լուծույթով 10 րոպե, մի քանի անգամ լվացվել H2O-ով, ապա 10 րոպե H2O-ի մեջ Ռեյնոլդսի կապարի ցիտրատով, ապա մի քանի անգամ լվացվել H2O-ով։ Միկրոսկոպները կատարվել են Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Ուոլթհեմ, Մասաչուսեթս, ԱՄՆ) թափանցելի էլեկտրոնային մանրադիտակով՝ օգտագործելով TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 թվային տեսախցիկ (TVIPS GmbH, Գաուտինգ, ԱՄՆ)։ Գերմանիա)։
AAV-ով վարակված մկների ուղեղը բաժանվել և կտրվել է 1 մմ հաստությամբ սագիտալ հատվածի, իսկ ուղեղիկը հետազոտվել է ֆլուորեսցենտային մանրադիտակով՝ AAV-ով վարակված օղակը (այսինքն՝ mCherry արտահայտող) նույնականացնելու համար: Օգտագործվել են միայն այն փորձերը, որոնցում AAV ներարկումը հանգեցնում է Պուրկինյեի բջջային շերտի (այսինքն՝ գրեթե ամբողջ շերտի) շատ բարձր տրանսդուկցիոն արդյունավետության առնվազն երկու հաջորդական ուղեղիկի օղակներում: AAV-ով տրանսդուկցված օղակը միկրոդիսեկցիայի է ենթարկվել գիշերային հետֆիքսացիայի համար (4% PFA և 2.5% գլուտարալդեհիդ 0.1 Մ կոկոատ բուֆերում) և հետագա մշակման: EPON ներդրման համար ֆիքսված հյուսվածքը լվացվել է 0.1 Մ նատրիումի կոկոատ բուֆերով (Applichem) և ինկուբացվել 2% OsO4-ով (os, Science Services; Caco) 0.1 Մ նատրիումի կոկոատ բուֆերում (Applichem) 4 ժամ, ապա լվացվել 2 ժամ: Կրկնել 3 անգամ 0.1 Մ կոկամիդային բուֆերով: Հետագայում, էթանոլի աճող շարքը օգտագործվել է յուրաքանչյուր էթանոլի լուծույթը 4°C ջերմաստիճանում 15 րոպե ինկուբացելու համար՝ հյուսվածքը չորացնելու համար: Հյուսվածքը տեղափոխվել է պրոպիլենօքսիդի մեջ և գիշերը ինկուբացվել է EPON-ում (Sigma-Aldrich) 4°C ջերմաստիճանում: Հյուսվածքը տեղադրվել է թարմ EPON-ի մեջ սենյակային ջերմաստիճանում 2 ժամ, ապա տեղադրվել է 62°C ջերմաստիճանում 72 ժամ: Օգտագործելով ուլտրամիկրոտոմ (Leica Microsystems, UC6) և ադամանդե դանակ (Diatome, Biel, Շվեյցարիա)՝ 70 նմ գերբարակ հատվածներ կտրելու համար, ապա ներկել 1.5% ուրանիլացետատով 37°C ջերմաստիճանում 15 րոպե, ապա ներկել կապարի ցիտրատի լուծույթով 4 րոպե: Էլեկտրոնային միկրոֆոտոները կատարվել են JEM-2100 Plus թափանցող էլեկտրոնային մանրադիտակի (JEOL) միջոցով, որը հագեցած է Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) և DigitalMicrograph ծրագրակազմով (Gatan): Վերլուծության համար էլեկտրոնային միկրոֆոտոները ստացվել են 5000× կամ 10,000× թվային խոշորացմամբ։
Միտոքոնդրիաների մորֆոլոգիական վերլուծություն: Բոլոր վերլուծությունների համար առանձին միտոքոնդրիաների ուրվագծերը ձեռքով ուրվագծվել են թվային պատկերների վրա՝ օգտագործելով ImageJ ծրագիրը: Վերլուծվել են տարբեր մորֆոլոգիական պարամետրեր: Միտոքոնդրիալ խտությունը արտահայտվում է որպես տոկոս, որը ստացվում է յուրաքանչյուր բջջի միտոքոնդրիալ ընդհանուր մակերեսը ցիտոպլազմայի մակերեսին (ցիտոպլազմայի մակերես = բջջի մակերես-բջջի կորիզի մակերես) × 100 բաժանելով: Միտոքոնդրիաների կլորությունը հաշվարկվում է [4π∙(մակերես/պարիմետր 2)] բանաձևով: Միտոքոնդրիաների այս ձևաբանությունը վերլուծվել և բաժանվել է երկու կատեգորիայի («խողովակային» և «փուչիկ»)՝ ըստ դրանց հիմնական ձևերի:
Աուտոֆագոսոմների/լիզոսոմների քանակի և խտության վերլուծություն: Օգտագործեք ImageJ ծրագիրը՝ թվային պատկերում յուրաքանչյուր աուտոֆագոսոմի/լիզոսոմի ուրվագծերը ձեռքով ուրվագծելու համար: Աուտոֆագոսոմի/լիզոսոմի մակերեսը արտահայտվում է որպես տոկոս, որը հաշվարկվում է՝ յուրաքանչյուր բջջի աուտոֆագոսոմի/լիզոսոմի ընդհանուր կառուցվածքի մակերեսը բաժանելով ցիտոպլազմայի մակերեսի վրա (ցիտոպլազմայի մակերես = բջջի մակերես - միջուկի մակերես)×100: Աուտոֆագոսոմների/լիզոսոմների խտությունը հաշվարկվում է՝ ընդհանուր թիվը բաժանելով բջջի վրա աուտոֆագոսոմների/լիզոսոմների կառուցվածքների քանակի վրա (ցիտոպլազմային մակերեսի առումով) (ցիտոպլազմային մակերես = բջջի մակերես - միջուկի մակերես):
Սուր կտրվածքի և նմուշի պատրաստման պիտակավորում: Գլյուկոզային պիտակավորում պահանջող փորձերի համար սուր ուղեղի կտորները տեղափոխեք նախնական ինկուբացիոն խցիկ, որը պարունակում է հագեցած ածխածին (95% O2 և 5% CO2), բարձր Ca2 + ACSF (125.0 մՄ NaCl, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆեր, 25.0 մՄ NaHCO3, 25.0 մՄ d-գլյուկոզ, 1.0 մՄ CaCl2 և 2.0 մՄ MgCl2, pH 7.4-ի և 310-ից 320 մՕսմ-ի ճշգրտված), որում գլյուկոզը 13C6- գլյուկոզի փոխարինող է (Eurisotop, կատալոգի համար CLM-1396): Պիրուվատով նշագրման պահանջող փորձերի համար սուր ուղեղի կտորները տեղափոխեք ավելի բարձր Ca2 + ACSF (125.0 մՄ NaCl, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆեր, 25.0 մՄ NaHCO3, 25.0 մՄ d-գլյուկոզ, 1.0 մՄ CaCl2 և ավելացրեք 2.0 մՄ MgCl2, pH-ը կարգավորեք մինչև 7.4 և 310-ից մինչև 320 մՕսմ), և ավելացրեք 1 մՄ 1-[1-13C]պիրուվատ (Eurisotop, կատալոգի համար CLM-1082): Կտրվածքները ինկուբացրեք 90 րոպե 37°C ջերմաստիճանում: Փորձի ավարտին կտրվածքները արագ լվացվեցին 75 մՄ ամոնիումի կարբոնատ պարունակող ջրային լուծույթով (pH 7.4), ապա համասեռացվեցին 40:40:20 (v:v:v) ացետոնիտրիլ (ACN): մեթանոլ: ջուր հարաբերակցությամբ: Հատվածները սառույցի վրա 30 րոպե ինկուբացվելուց հետո, նմուշները ցենտրիֆուգացվել են 21,000 գ-ի տակ 10 րոպե 4°C ջերմաստիճանում, և թափանցիկ վերին շերտը չորացվել է SpeedVac կոնցենտրատորում: Արդյունքում ստացված չորացրած մետաբոլիտի գնդիկը պահվել է -80°C ջերմաստիճանում մինչև վերլուծությունը:
13 C-նշված ամինաթթուների հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-զանգվածային սպեկտրոմետրիայի վերլուծություն: Հեղուկ քրոմատոգրաֆիա-զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (LC-MS) վերլուծության համար մետաբոլիտի գնդիկը վերստին լուծվել է 75 մկլ LC-MS որակի ջրում (Honeywell): 4°C ջերմաստիճանում 21,000 գ-ում 5 րոպե ցենտրիֆուգացումից հետո, ամինաթթուների հոսքի վերլուծության համար օգտագործվել է 20 մկլ պարզեցված վերին շերտ, մինչդեռ մնացած քաղվածքը անմիջապես օգտագործվել է անիոնային վերլուծության համար (տե՛ս ստորև): Ամինաթթուների վերլուծությունը կատարվել է նախկինում նկարագրված բենզոիլ քլորիդի դերիվատացման արձանագրության միջոցով (55, 56): Առաջին քայլում 20 մկլ մետաբոլիտի քաղվածքին ավելացվել է 10 մկլ 100 մՄ նատրիումի կարբոնատ (Sigma-Aldrich), ապա LC որակի ACN-ին ավելացվել է 10 մկլ 2% բենզոիլ քլորիդ (Sigma-Aldrich): Նմուշը կարճ ժամանակով պտտեցվել է, ապա ցենտրիֆուգացվել է 21,000 գ-ի տակ 5 րոպե 20°C ջերմաստիճանում: Մաքրված վերին շերտը տեղափոխել 2 մլ տարողությամբ ավտոնմուշառման սրվակի մեջ՝ կոնաձև ապակե ներդիրով (200 մկլ ծավալով): Նմուշները վերլուծվել են Acquity iClass գերբարձր արդյունավետության LC համակարգի (Waters) միջոցով, որը միացված է Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) բարձր թույլտվությամբ ճշգրիտ զանգվածային սպեկտրոմետրին (Thermo Fisher Scientific): Վերլուծության համար 2 մկլ դերիվատացված նմուշը ներարկվել է 100×1.0 մմ բարձր ամրության սիլիցիումային T3 սյան (Waters) մեջ, որը պարունակում է 1.8 մկմ մասնիկներ: Հոսքի արագությունը 100 մկլ/րոպե է, իսկ բուֆերային համակարգը բաղկացած է բուֆեր A-ից (10 մՄ ամոնիումի ֆորմատ և 0.15% մրջնաթթու ջրում) և բուֆեր B-ից (ACN): Գրադիենտը հետևյալն է՝ 0%B 0 րոպեում; 0%B: 0-ից 15% B՝ 0-ից 0.1 րոպեում; 15-ից 17% B՝ 0.1-ից 0.5 րոպեում; B՝ 17-ից 55%՝ 0.5-ից 14 րոպեում; B՝ 55-ից 70%՝ 14-ից 14.5 րոպեում; 14.5-ից 70-ից 100% B՝ 18 րոպեում; 100% B՝ 18-ից 19 րոպեում; 100-ից 0% B՝ 19-ից 19.1 րոպեում; 0% B՝ 19.1-ից 28 րոպեում (55, 56): QE-HF զանգվածային սպեկտրոմետրը գործում է դրական իոնացման ռեժիմով՝ m/z (զանգված/լիցք հարաբերակցություն) զանգվածի 50-ից մինչև 750 միջակայքում: Կիրառվող լուծաչափը 60,000 է, իսկ ստացված ուժեղացման կառավարման (AGC) իոնային թիրախը՝ 3×106, իսկ առավելագույն իոնային ժամանակը՝ 100 միլիվայրկյան: Տաքացվող էլեկտրոցողման իոնացման (ESI) աղբյուրը գործում է 3.5 կՎ ցողման լարման, 250°C մազանոթային ջերմաստիճանի, 60 ԱՄ (կամայական միավորներ) թաղանթային օդային հոսքի և 20 ԱՄ (կամայական միավորներ) օժանդակ օդային հոսքի պայմաններում: S ոսպնյակը կարգավորված է 60 ԱՄ-ի վրա:
13C-ով նշագրված օրգանական թթուների անիոնային քրոմատոգրաֆիա-MS վերլուծություն: Մնացած մետաբոլիտի նստվածքը (55 մկլ) վերլուծվել է Dionex իոնային քրոմատոգրաֆիայի համակարգի (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) միջոցով, որը միացված է QE-HF զանգվածային սպեկտրոմետրին (Thermo Fisher Scientific): Ամփոփելով՝ մետաբոլիտի քաղվածքի 5 մկլ ներարկվել է Dionex IonPac AS11-HC սյան մեջ, որը հագեցած է HPLC-ով (2 մմ × 250 մմ, մասնիկի չափսը՝ 4 մկմ, Thermo Fisher Scientific)՝ 1 լրացման հարաբերակցությամբ: Dionex IonPac AG11-HC պաշտպանիչ սյուն (2 մմ x 50 մմ, 4 մկմ, Thermo Fisher Scientific): Սյունակի ջերմաստիճանը պահպանվում է 30°C-ի վրա, իսկ ինքնանմուշառիչը՝ 6°C-ի վրա: Էլյուենտի գեներատորի միջոցով կալիումի հիդրօքսիդի գրադիենտ ստանալու համար օգտագործվում է ապաիոնացված ջրով ապահովված կալիումի հիդրօքսիդի փամփուշտ: Մետաբոլիտների բաժանում 380 մկլ/րոպե հոսքի արագությամբ՝ կիրառելով հետևյալ գրադիենտը՝ 0-ից 3 րոպե, 10 մՄ KOH; 3-ից 12 րոպե, 10-ից 50 մՄ KOH; 12-ից 19 րոպե, 50-ից 100 մՄ KOH; 19-ից 21 րոպե, 100 մՄ KOH; 21-ից 21.5 րոպե, 100-ից 10 մՄ KOH: Սյունը վերահավսարակշռվել է 10 մՄ KOH-ի տակ 8.5 րոպե:
Էլյուացված մետաբոլիտները սյունակից հետո միացվում են 150 մկլ/րոպե իզոպրոպանոլի լրացուցիչ հոսքի հետ, ապա ուղղորդվում են բարձր թույլտվությամբ զանգվածային սպեկտրոմետրի, որը գործում է բացասական իոնացման ռեժիմով: MS-ը վերահսկում է զանգվածի միջակայքը m/z 50-ից մինչև 750՝ 60,000 թույլտվությամբ: AGC-ն սահմանված է 1×106-ի վրա, իսկ առավելագույն իոնային ժամանակը պահպանվում է 100 մվրկ-ի վրա: Տաքացված ESI աղբյուրը աշխատել է 3.5 կՎ ցողման լարման տակ: Իոնային աղբյուրի մյուս կարգավորումներն են՝ մազանոթային ջերմաստիճան՝ 275°C, թաղանթային գազի հոսք՝ 60 ԱՄ, օժանդակ գազի հոսք՝ 20 ԱՄ 300°C-ում, և S ոսպնյակի կարգավորում՝ 60 ԱՄ:
13C-ով նշագրված մետաբոլիտների տվյալների վերլուծություն: Իզոտոպների հարաբերակցության տվյալների վերլուծության համար օգտագործեք TraceFinder ծրագիրը (տարբերակ 4.2, Thermo Fisher Scientific): Յուրաքանչյուր միացության ինքնությունը ստուգվել է հուսալի հղման միացությամբ և անկախ վերլուծվել: Իզոտոպային հարստացման վերլուծություն կատարելու համար յուրաքանչյուր 13C իզոտոպի (Mn) արդյունահանված իոնային քրոմատոգրամի (XIC) մակերեսը արդյունահանվել է [M + H]+-ից, որտեղ n-ը թիրախային միացության ածխածնի թիվն է, որն օգտագործվում է ամինաթթուները վերլուծելու համար, կամ [MH]+-ը՝ անիոնները վերլուծելու համար: XIC-ի զանգվածային ճշգրտությունը պակաս է հինգ մաս միլիոնից, իսկ RT-ի ճշգրտությունը՝ 0.05 րոպե: Հարստացման վերլուծությունը կատարվում է՝ հաշվարկելով յուրաքանչյուր հայտնաբերված իզոտոպի և համապատասխան միացության բոլոր իզոտոպների գումարի հարաբերակցությունը: Այս հարաբերակցությունները տրվում են որպես տոկոսային արժեքներ յուրաքանչյուր իզոտոպի համար, և արդյունքները արտահայտվում են որպես մոլային տոկոսային հարստացում (MPE), ինչպես նկարագրվել է նախկինում (42):
Սառեցված նեյրոնային գնդիկը հոմոգենացվել է սառցե 80% մեթանոլի (v/v) մեջ, պտտեցվել է և ինկուբացվել -20°C ջերմաստիճանում 30 րոպե: Նմուշը կրկին պտտեցվել է և խառնվել +4°C ջերմաստիճանում 30 րոպե: Նմուշը ցենտրիֆուգացվել է 21,000 գ-ի վրա 5 րոպե 4°C ջերմաստիճանում, այնուհետև ստացված վերին շերտը հավաքվել և չորացվել է SpeedVac կոնցենտրատորի միջոցով 25°C ջերմաստիճանում՝ հետագա վերլուծության համար: Ինչպես նկարագրված է վերևում, տեսակավորված բջիջների ամինաթթուների վրա կատարվել է LC-MS վերլուծություն: TraceFinder-ի (տարբերակ 4.2, Thermo Fisher Scientific) միջոցով տվյալների վերլուծությունը կատարվել է յուրաքանչյուր միացության մոնոիզոտոպային զանգվածի միջոցով: Մետաբոլիտների տվյալների քվանտիլային նորմալացումը կատարվել է preprocessCore ծրագրային փաթեթի (57) միջոցով:
Կտորի պատրաստում։ Մկան արագ անզգայացվել է ածխաթթու գազով և գլխատվել, ուղեղը արագ հեռացվել է գանգից, և սառույցով լցված թրթռացող դանակով (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Գերմանիա) այն կտրվել է 300-ից 375 մկմ սագիտալ կտրվածքների։ Սառը ածխածնային գազաֆիկացում (95% O2 և 5% CO2)։ Ցածր Ca2 + ACSF (125.0 մՄ NaCl, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆեր, 25.0 մՄ NaHCO3, 25.0 մՄ d-գլյուկոզ, 1.0 մՄ CaCl2 և 6.0 մՄ MgCl2։ pH-ի կարգավորում մինչև 7.4 և 310-ից 330 մՕսմ)։ Ստացված ուղեղի կտորները տեղափոխեք ավելի բարձր Ca2 + ACSF պարունակող խցիկ (125.0 մՄ NaCl, 2.5 մՄ KCl, 1.25 մՄ նատրիումի ֆոսֆատային բուֆեր, 25.0 մՄ NaHCO3, 25.0 մՄ d-գլյուկոզ, 4.0 մՄ CaCl2 և մՄ 3.5 MgCl2), pH 7.4 և 310-320 մՕսմ): Պահեք կտորները 20-30 րոպե, որպեսզի դրանք կարողանան վերականգնվել ձայնագրումից առաջ:
Ձայնագրում։ Բոլոր ձայնագրությունների համար օգտագործվել է ֆիքսված ձայնագրման խցիկով և 20x ջրային ընկղմամբ օբյեկտիվ ոսպնյակով (Scientifica) հագեցած մանրադիտակի բեմ։ Ենթադրյալ Պուրկինյեի բջիջները նույնականացվել են (i) մարմնի չափսերով, (ii) ուղեղիկի անատոմիական դիրքով և (iii) ֆլուորեսցենտ mtYFP ռեպորտեր գենի արտահայտմամբ։ 5-ից 11 մեգոհմ ծայրային դիմադրություն ունեցող պլաստիրային պիպետը դուրս է բերվում բորոսիլիկատային ապակե մազանոթով (GB150-10, 0.86 մմ × 1.5 մմ × 100 մմ, Science Products, Hofheim, Գերմանիա) և հորիզոնական պիպետով Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA)։ Բոլոր ձայնագրությունները կատարվել են ELC-03XS npi պլաստիրային սեղմակով ուժեղացուցիչով (npi electronic GmbH, Tam, Գերմանիա), որը կառավարվում էր Signal ծրագրաշարով (տարբերակ 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Մեծ Բրիտանիա)։ Փորձը ձայնագրվել է 12.5 կՀց նմուշառման հաճախականությամբ։ Ազդանշանը զտվում է երկու կարճաժամկետ Բեսելյան ֆիլտրերով՝ համապատասխանաբար 1.3 և 10 կՀց կտրման հաճախականություններով: Մեմբրանային և պիպետային տարողունակությունը փոխհատուցվում է փոխհատուցման սխեմայով՝ օգտագործելով ուժեղացուցիչ: Բոլոր փորձերը կատարվել են Orca-Flash 4.0 տեսախցիկի (Համամատսու, Գերդեն, Գերմանիա) կառավարման ներքո, որը կառավարվում էր Hokawo ծրագրաշարով (տարբերակ 2.8, Համամացու, Գերդեն, Գերմանիա):
Բջջի ամբողջական կազմաձևման և վերլուծության ռուտինային մեթոդ։ Գրանցումից անմիջապես առաջ պիպետը լցրեք հետևյալ նյութերը պարունակող ներքին լուծույթով՝ 4.0 մՄ KCl, 2.0 մՄ NaCl, 0.2 մՄ EGTA, 135.0 մՄ կալիումի գլյուկոնատ, 10.0 մՄ Hepes, 4.0 մՄ ATP (Mg), 0.5 մՄ գուանոզինի տրիֆոսֆատ (GTP) (Na) և 10.0 մՄ կրեատինինի ֆոսֆատ, pH-ը կարգավորվեց մինչև 7.25, իսկ օսմոտիկ ճնշումը՝ 290 մՕսմ (սախարոզ)։ 0 պԱ ուժ կիրառելուց անմիջապես հետո՝ թաղանթը պատռելու համար, չափվեց հանգստի թաղանթային պոտենցիալը։ Մուտքային դիմադրությունը չափվում է -40, -30, -20 և -10 պԱ հիպերպոլյար հոսանքներ կիրառելով։ Չափեք լարման արձագանքի մեծությունը և օգտագործեք Օմի օրենքը՝ մուտքային դիմադրությունը հաշվարկելու համար։ Ինքնաբուխ ակտիվությունը գրանցվել է լարման սեղմիչում 5 րոպե, և sPSC-ն նույնականացվել և չափվել է Igor Pro-ում (տարբերակ 32 7.01, WaveMetrics, Լեյք Օսվեգո, Օրեգոն, ԱՄՆ)՝ օգտագործելով կիսաավտոմատ ճանաչման սկրիպտ: IV կորը և կայուն վիճակի հոսանքը չափվում են՝ մարտկոցը տարբեր պոտենցիալների վրա սեղմելով (սկսած -110 մՎ-ից) և լարումը 5 մՎ քայլով բարձրացնելով: AP-ի արտադրությունը ստուգվել է դեպոլարիզացնող հոսանք կիրառելով: Բջիջը սեղմել -70 մՎ-ի վրա՝ միաժամանակ կիրառելով դեպոլարիզացնող հոսանքի իմպուլս: Յուրաքանչյուր գրանցման միավորի քայլի չափը կարգավորեք առանձին (10-ից 60 պԱ): Հաշվարկեք AP-ի առավելագույն հաճախականությունը՝ ձեռքով հաշվելով իմպուլսային ցատկերը, որոնք առաջացնում են ամենաբարձր AP հաճախականությունը: AP շեմը վերլուծվում է դեպոլարիզացիայի իմպուլսի երկրորդ ածանցյալի միջոցով, որն առաջինը ակտիվացնում է մեկ կամ մի քանի AP-ներ:
Պերֆորացված բծերի կոնֆիգուրացիա և վերլուծություն: Կատարեք պերֆորացված բծերի գրանցում՝ օգտագործելով ստանդարտ արձանագրություններ: Օգտագործեք ATP-ից և GTP-ից զերծ պիպետ, որը չի պարունակում հետևյալ բաղադրիչները՝ 128 մՄ գլյուկոնատ K, 10 մՄ KCl, 10 մՄ Hepes, 0.1 մՄ EGTA և 2 մՄ MgCl2, և կարգավորեք pH-ը մինչև 7.2 (օգտագործելով KOH): ATP-ն և GTP-ն բաց են թողնվում ներբջջային լուծույթից՝ բջջային թաղանթի անվերահսկելի թափանցելիությունը կանխելու համար: Բծերի պիպետը լցվում է ամֆոտերիցին պարունակող ներքին լուծույթով (մոտավորապես 200-ից 250 մկգ/մլ; G4888, Sigma-Aldrich)՝ դակված բծերի գրանցում ստանալու համար: Ամֆոտերիցինը լուծվել է դիմեթիլսուլֆօքսիդում (վերջնական կոնցենտրացիա՝ 0.1-ից 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich): Օգտագործված DMSO-ի կոնցենտրացիան էական ազդեցություն չի ունեցել ուսումնասիրված նեյրոնների վրա: Ծակման գործընթացի ընթացքում ալիքի դիմադրությունը (Ra) անընդհատ վերահսկվում էր, և փորձը սկսվում էր Ra-ի և AP-ի ամպլիտուդի կայունացումից հետո (20-40 րոպե): Ինքնաբուխ ակտիվությունը չափվում է լարման և/կամ հոսանքի սեղմակով 2-ից 5 րոպե: Տվյալների վերլուծությունը կատարվել է Igor Pro (տարբերակ 7.05.2, WaveMetrics, ԱՄՆ), Excel (տարբերակ 2010, Microsoft Corporation, Ռեդմոնդ, ԱՄՆ) և GraphPad Prism (տարբերակ 8.1.2, GraphPad Software Inc., Լա Ջոլլա, Կալիֆոռնիա) ծրագրերի միջոցով: Ինքնաբուխ AP-ները նույնականացնելու համար օգտագործվում է IgorPro-ի NeuroMatic v3.0c հավելվածը: Ավտոմատ կերպով նույնականացրեք AP-ները՝ օգտագործելով տրված շեմը, որը կարգավորվում է անհատապես յուրաքանչյուր գրառման համար: Օգտագործելով սպիկի միջակայքը, որոշեք սպիկի հաճախականությունը՝ առավելագույն ակնթարթային սպիկի հաճախականությամբ և միջին սպիկի հաճախականությամբ:
ՊՆ մեկուսացում։ Նախկինում հրապարակված արձանագրությանը համապատասխան, ՊՆ-ները մաքրվել են մկան ուղեղիկից որոշակի փուլում (58): Ամփոփելով՝ ուղեղիկը դիսեկցիայի է ենթարկվել և մանրացվել սառցե դիսոցիացիայի միջավայրում [առանց HBSS Ca2+ և Mg2+, լրացված 20 մՄ գլյուկոզով, պենիցիլինով (50 Մ/մլ) և ստրեպտոմիցինով (0.05 մգ/մլ)], ապա միջավայրը մարսվել է պապաինով [HBSS, լրացված 1-ցիստեին·HCl (1 մգ/մլ), պապաինով (16 Մ/մլ) և դեզօքսիռիբոնուկլեազ I (DNase I; 0.1 մգ/մլ)]: Մշակվել է 30 րոպե 30°C ջերմաստիճանում: Սկզբում հյուսվածքները լվացեք HBSS միջավայրում, որը պարունակում է ձվի լորձ (10 մգ/մլ), BSA (10 մգ/մլ) և DNase (0.1 մգ/մլ) սենյակային ջերմաստիճանում՝ ֆերմենտատիվ մարսողությունը կանխելու համար, ապա 20 մՄ գլյուկոզ պարունակող HBSS միջավայրում պենիցիլինը (50 ՄՄ/մլ), ստրեպտոմիցինը (0.05 մգ/մլ) և DNase-ը (0.1 մգ/մլ) նրբորեն մանրացնելով՝ անջատվեցին առանձին բջիջներ: Արդյունքում ստացված բջջային սուսպենզիան զտվեց 70 մկմ բջջային զտիչի միջով, այնուհետև բջիջները հատիկավորվեցին ցենտրիֆուգացման միջոցով (1110 պտ/րոպե, 5 րոպե, 4°C) և վերասուսպենդացվեցին տեսակավորման միջավայրում [HBSS, լրացված 20 մՄ գլյուկոզով, 20% խոշոր եղջերավոր անասունի պտղի շիճուկով, պենիցիլինով (50 ՄՄ/մլ) և ստրեպտոմիցինով (0.05 մգ/մլ)]. գնահատեք բջիջների կենսունակությունը պրոպիդիումի յոդիդով և կարգավորեք բջիջների խտությունը մինչև 1×106-ից մինչև 2×106 բջիջ/մլ: Հոսքային ցիտոմետրիայից առաջ կախույթը զտվել է 50 մկմ բջջային զտիչի միջով։
Հոսքային ցիտոմետր։ Բջիջների տեսակավորումը կատարվել է 4°C ջերմաստիճանում՝ օգտագործելով FACSAria III սարքը (BD Biosciences) և FACSDiva ծրագիրը (BD Biosciences, տարբերակ 8.0.1)։ Բջջային սուսպենզիան տեսակավորվել է 100 մկմ ծայրակալի միջոցով՝ 20 psi ճնշման տակ, մոտ 2800 իրադարձություն/վրկ արագությամբ։ Քանի որ ավանդական դարպասավորման չափանիշները (բջջի չափը, երկմոդալ տարբերակումը և ցրման բնութագրերը) չեն կարող ապահովել PN-ի ճիշտ մեկուսացումը այլ բջիջների տեսակներից, դարպասավորման ռազմավարությունը սահմանվում է mitoYFP+ ​​​​և վերահսկիչ mitoYFP − մկների YFP ինտենսիվության և ավտոֆլուորեսցենցիայի ուղղակի համեմատության հիման վրա։ YFP-ն գրգռվում է նմուշը 488 նմ լազերային գծով ճառագայթելով, և ազդանշանը հայտնաբերվում է 530/30 նմ գոտիական անցման ֆիլտրի միջոցով։ MitoYFP+ ​​​​մկների մոտ Rosa26-mitoYFP ռեպորտեր գենի հարաբերական ուժգնությունը նույնպես օգտագործվում է նեյրոնային մարմնի և աքսոնի բեկորները տարբերակելու համար։ 7-AAD-ն գրգռվում է 561 նմ դեղին լազերով և հայտնաբերվում 675/20 նմ գոտիային ֆիլտրով՝ մահացած բջիջները բացառելու համար: Աստրոցիտները միաժամանակ առանձնացնելու համար բջջային սուսպենզիան ներկվել է ACSA-2-APC-ով, այնուհետև նմուշը ճառագայթվել է 640 նմ լազերային գծով, և ազդանշանը հայտնաբերելու համար օգտագործվել է 660/20 նմ գոտիային ֆիլտր:
Հավաքված բջիջները մանրացվել են ցենտրիֆուգացման միջոցով (1110 պտ/րոպե, 5 րոպե, 4°C) և պահվել -80°C ջերմաստիճանում մինչև օգտագործումը: Mfn2cKO մկները և նրանց ձագերը դասակարգվել են նույն օրը՝ ընթացակարգային փոփոխականությունը նվազագույնի հասցնելու համար: FACS տվյալների ներկայացումը և վերլուծությունը կատարվել են FlowJo ծրագրաշարի միջոցով (FlowJo LLC, Աշլենդ, Օրեգոն, ԱՄՆ):
Ինչպես նշվեց վերևում (59), իրական ժամանակի ՊՇՌ-ն օգտագործվում է տեսակավորված նեյրոններից ԴՆԹ-ն մեկուսացնելու համար՝ հետագա միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ի քանակական որոշման համար: Գծայինությունը և շեմային զգայունությունը սկզբում ստուգվել են տարբեր թվով բջիջների վրա qPCR անցկացնելով: Հակիրճ ասած՝ հավաքեք 300 PN լիզիսի բուֆերի մեջ, որը բաղկացած է 50 մՄ տրիս-HCl (pH 8.5), 1 մՄ EDTA, 0.5% Tween 20 և պրոտեինազ K (200 նգ/մլ) պարունակող նյութերից և ինկուբացեք 55°C ջերմաստիճանում 120 րոպե: Բջիջները հետագայում ինկուբացվեցին 95°C ջերմաստիճանում՝ պրոտեինազ K-ի լիակատար ինակտիվացումն ապահովելու համար: mt-Nd1-ի համար հատուկ TaqMan զոնդ (Thermo Fisher) օգտագործելով, միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ն չափվել է կիսաքանակական ՊՇՌ-ով 7900HT իրական ժամանակի ՊՇՌ համակարգում (Thermo Fisher Scientific): Science, կատալոգի համար՝ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, կատալոգի համար՝ AIVI3E8) և 18S (Thermo Fisher Scientific, կատալոգի համար՝ Hs99999901_s1) գեները։
Պրոտեոմի նմուշի պատրաստում։ Լուծույթը 95°C ջերմաստիճանում 10 րոպե տաքացնելով և ուլտրաձայնային եղանակով լուծողական բուֆերում [6 Մ գուանիդինի քլորիդ, 10 մՄ տրիս(2-կարբօքսիէթիլ) ֆոսֆինի հիդրոքլորիդ, 10 մՄ քլորացետամիդ և 100 մՄ տրիս-լիզ սառեցված նեյրոնային գնդիկներ HCl-ում]։ Bioruptor (Diagenode) սարքի վրա 10 րոպե (30 վայրկյան իմպուլս / 30 վայրկյան դադար)։ Նմուշը նոսրացվել է 1:10 հարաբերակցությամբ 20 մՄ տրիս-HCl-ում (pH 8.0), խառնվել 300 նգ տրիպսին ոսկու (Promega) հետ և ինկուբացվել է գիշերը 37°C ջերմաստիճանում՝ ամբողջական մարսողության հասնելու համար։ Երկրորդ օրը նմուշը ցենտրիֆուգացվել է 20,000 գ-ի վրա 20 րոպե։ Վերին շերտը նոսրացվել է 0.1% մրջնաթթվով, և լուծույթը աղազրկվել է ինքնաշեն StageTips-ով։ Նմուշը չորացվել է SpeedVac սարքում (Eppendorf concentrator plus 5305) 45°C ջերմաստիճանում, որից հետո պեպտիդը կախույթի է ենթարկվել 0.1% մրջնաթթվի մեջ։ Բոլոր նմուշները պատրաստվել են միաժամանակ նույն անձի կողմից։ Աստրոցիտների նմուշները վերլուծելու համար 4 մկգ աղազրկված պեպտիդներ նշվել են տանդեմային զանգվածային պիտակով (TMT10plex, կատալոգի համար 90110, Thermo Fisher Scientific)՝ պեպտիդի և TMT ռեակտիվի 1:20 հարաբերակցությամբ։ TMT նշագրման համար 0.8 մգ TMT ռեակտիվը վերակախույթի է ենթարկվել 70 մկլ անջուր ACN-ի մեջ, իսկ չորացրած պեպտիդը վերականգնվել է 9 մկլ 0.1 Մ TEAB-ի (տրիէթիլամոնիումի բիկարբոնատ) մեջ, որին ավելացվել է 7 մկլ TMT ռեակտիվ ACN-ում։ Կոնցենտրացիան կազմել է 43.75%։ 60 րոպե ինկուբացիայից հետո ռեակցիան մարվել է 2 մկլ 5% հիդրօքսիլամինով։ Նշված պեպտիդները հավաքվել, չորացվել, վերստին լուծվել են 200 մկլ 0.1% մրջնաթթվի (FA) մեջ, բաժանվել են երկու մասի, ապա աղազրկվել են ինքնաշեն StageTips-ի միջոցով: UltiMate 3000 գերբարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆով (UltiMate 3000 գերբարձր արդյունավետության հեղուկ քրոմատոգրաֆ) երկու կեսերից մեկը ֆրակցիացվել է 1 մմ x 150 մմ Acquity քրոմատոգրաֆիկ սյան վրա, որը լցված է 130 Å1.7 մկմ C18 մասնիկներով (Waters, կատալոգի համար՝ SKU: 186006935): Thermo Fisher Scientific): Առանձնացրեք պեպտիդները 30 մկլ/րոպե հոսքի արագությամբ, առանձնացրեք 1%-ից մինչև 50% բուֆեր B-ն 85 րոպե՝ 96 րոպեի աստիճանական գրադիենտով, 50%-ից մինչև 95% բուֆեր B-ն՝ 3 րոպե, ապա 8 րոպե՝ 95% բուֆեր B-ի համար: A բուֆերը պարունակում է 5% ACN և 10 մՄ ամոնիումի բիկարբոնատ (ABC), իսկ B բուֆերը՝ 80% ACN և 10 մՄ ABC: Հավաքեք ֆրակցիաները յուրաքանչյուր 3 րոպեն մեկ և միավորեք դրանք երկու խմբի (1 + 17, 2 + 18 և այլն) և չորացրեք վակուումային ցենտրիֆուգում:
LC-MS/MS վերլուծություն: Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի համար պեպտիդները (համարը r119.aq) առանձնացվել են 25 սմ, 75 մկմ ներքին տրամագծով PicoFrit վերլուծական սյան վրա (նոր օբյեկտիվ, մասի համարը՝ PF7508250), որը հագեցած է 1.9 մկմ ReproSil-Pur 120 C18-AQ միջավայրով (Dr. Maisch, mat), օգտագործելով EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Գերմանիա): Սյունը պահպանվել է 50°C ջերմաստիճանում: A և B բուֆերները համապատասխանաբար 0.1% մրջնաթթու են ջրում և 0.1% մրջնաթթու՝ 80% ACN-ում: Պեպտիդները առանձնացվել են 6%-ից մինչև 31% բուֆեր B-ից 65 րոպե և 31%-ից մինչև 50% բուֆեր B-ից 5 րոպե՝ 200 նլ/րոպե գրադիենտով: Էլյուացված պեպտիդները վերլուծվել են Orbitrap Fusion զանգվածային սպեկտրոմետրի վրա (Thermo Fisher Scientific): Պեպտիդային նախորդի m/z չափումը կատարվում է 120,000 լուծաչափով՝ 350-ից 1500 մ/զ միջակայքում: Օգտագործելով 27% նորմալացված բախման էներգիա, բարձր էներգիայի C թակարդի դիսոցիացիայի (HCD) կտրման համար ընտրվում է ամենաուժեղ նախորդը՝ 2-ից 6 լիցքի վիճակով: Ցիկլի ժամանակը սահմանվում է 1 վայրկյան: Պեպտիդային բեկորի m/z արժեքը չափվել է իոնային թակարդում՝ օգտագործելով 5×104 ամենափոքր AGC թիրախը և 86 մվ առավելագույն ներարկման ժամանակը: Ֆրագմենտացիայից հետո նախորդը տեղադրվել է դինամիկ բացառման ցուցակում 45 վայրկյանով: TMT-ով նշագրված պեպտիդները բաժանվել են 50 սմ, 75 մկմ Acclaim PepMap սյան վրա (Thermo Fisher Scientific, կատալոգի համար՝ 164942), և միգրացիայի սպեկտրները վերլուծվել են Orbitrap Lumos Tribrid զանգվածային սպեկտրոմետրի վրա (Thermo Fisher Scientific), որը հագեցած է բարձր դաշտի ասիմետրիկ ալիքային ձևի իոնների (FAIMS) սարքավորումներով (Thermo Fisher Scientific), որոնք աշխատում են -50 և -70 Վ փոխհատուցման երկու լարումների տակ: TMT հաշվետվության իոնային ազդանշանի չափման համար օգտագործվում է համաժամացման նախորդի հիման վրա ընտրված MS3-ը: Պեպտիդների բաժանումը իրականացվել է EASY-nLC 1200-ի վրա՝ օգտագործելով 90% գծային գրադիենտային էլյուցիա, 6%-ից մինչև 31% բուֆերի կոնցենտրացիայով. բուֆեր A-ն կազմել է 0.1% FA, իսկ բուֆեր B-ն՝ 0.1% FA և 80% ACN: Վերլուծական սյունը գործում է 50°C ջերմաստիճանում: Օգտագործեք FreeStyle (տարբերակ 1.6, Thermo Fisher Scientific)՝ սկզբնական ֆայլը FAIMS փոխհատուցման լարման համաձայն բաժանելու համար:
Սպիտակուցի նույնականացում և քանակական որոշում: Andromeda ինտեգրված որոնողական համակարգի միջոցով, սկզբնական տվյալները վերլուծվել են MaxQuant 1.5.2.8 տարբերակի միջոցով (https://maxquant.org/): Aequorea victoria-ից ստացված Cre ռեկոմբինազային և YFP հաջորդականություններից բացի, պեպտիդային բեկորների սպեկտրները որոնվել են մկան հղման պրոտեոմի կանոնիկ հաջորդականությունը և իզոֆորմային հաջորդականությունը (Proteome ID UP000000589, ներբեռնված UniProt-ից 2017 թվականի մայիսին): Մեթիոնինի օքսիդացումը և սպիտակուցի N-ծայրային ացետիլացումը սահմանվել են որպես փոփոխական փոփոխություններ. ցիստեին կարբամոիլ մեթիլացումը սահմանվել է որպես ֆիքսված փոփոխություններ: Մարսողության պարամետրերը սահմանվել են «յուրահատկություն» և «տրիպսին/P»: Սպիտակուցի նույնականացման համար օգտագործվող պեպտիդների և ածելի պեպտիդների նվազագույն քանակը 1 է. եզակի պեպտիդների նվազագույն քանակը՝ 0: Պեպտիդային քարտեզի համապատասխանեցման պայմաններում սպիտակուցի նույնականացման արագությունը կազմել է 0.01: «Երկրորդ պեպտիդ» տարբերակը միացված է: Օգտագործեք «համապատասխանություն վազքերի միջև» տարբերակը՝ տարբեր սկզբնական ֆայլերի միջև հաջող նույնականացումները փոխանցելու համար: Օգտագործեք LFQ նվազագույն հարաբերակցության 1 հաշվարկը պիտակից զերծ քանակականացման (LFQ) համար (60): LFQ ինտենսիվությունը զտվում է առնվազն երկու վավեր արժեքների համար առնվազն մեկ գենոտիպի խմբում յուրաքանչյուր ժամանակային կետում և էքստրապոլացվում է 0.3 լայնությամբ նորմալ բաշխումից և տեղափոխվում է ներքև 1.8: LFQ արդյունքները վերլուծելու համար օգտագործեք Perseus հաշվողական հարթակը (https://maxquant.net/perseus/) և R-ը (https://r-project.org/): Դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծության համար օգտագործվել է limma ծրագրային փաթեթից երկկողմանի չափավոր t թեստ (61): Հետազոտական ​​տվյալների վերլուծությունը կատարվում է ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally և pheatmap-ի միջոցով: TMT-ի վրա հիմնված պրոտեոմիկայի տվյալները վերլուծվել են MaxQuant 1.6.10.43 տարբերակի միջոցով: Որոնեք պրոտեոմիկայի հում տվյալները UniProt-ի մարդու պրոտեոմիկայի տվյալների բազայից, որը ներբեռնվել է 2018 թվականի սեպտեմբերին: Վերլուծությունը ներառում է արտադրողի կողմից տրամադրված իզոտոպների մաքրության ուղղման գործակիցը: Օգտագործեք limma-ն R-ում՝ դիֆերենցիալ արտահայտման վերլուծության համար: Սկզբնական տվյալները, տվյալների բազայի որոնման արդյունքները, տվյալների վերլուծության աշխատանքային հոսքը և արդյունքները բոլորը պահվում են ProteomeXchange դաշինքում՝ PRIDE գործընկերային պահոցի միջոցով՝ PXD019690 տվյալների հավաքածուի նույնականացուցիչով:
Ֆունկցիոնալ ծանոթագրությունները հարստացնում են վերլուծությունը: Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) գործիքն օգտագործվել է 8 շաբաթվա տվյալների հավաքածուի ֆունկցիոնալ ծանոթագրության տերմինների հարստությունը որոշելու համար (Նկար 1): Ամփոփելով՝ LC-MS/MS (տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրիա) տվյալների վերլուծությունից ստացված քանակական սպիտակուցների ցանկն օգտագործվում է հետևյալ ֆիլտրի չափանիշներով. Mus musculus-ը ընտրվում է որպես տեսակ և ֆոն, իսկ կատեգորիան ցույց է տալիս, որ Benjamini-ի կողմից 0.05 կամ ավելի ցածր հարստացման համար ճշգրտված P արժեքը համարվում է նշանակալի: Այս գրաֆիկի համար ներկայացված են յուրաքանչյուր կլաստերի հինգ ավելցուկային կատեգորիաները՝ ճշգրտված P արժեքի հիման վրա: Բենջամինիի, Կրիգերի և Եկուտիելիի երկաստիճան գծային խթանման ծրագրի (Q = 5%) միջոցով բազմակի t-թեստի միջոցով կատարվում է սպիտակուցի արտահայտման ժամանակային ընթացքի վերլուծություն յուրաքանչյուր կատեգորիայում նույնականացված կարևոր թեկնածուների վրա, և յուրաքանչյուր տող վերլուծվում է առանձին: Անհրաժեշտ չէ ընդունել հետևողական ստանդարտ շեղում:
Այս ուսումնասիրության արդյունքները հրապարակված տվյալների բազաների հետ համեմատելու և նկար 1-ում ներկայացված Վեննի դիագրամը ստեղծելու համար մենք քանակական սպիտակուցների ցանկը համատեղել ենք MitoCarta 2.0 ծանոթագրությունների հետ (24): Դիագրամը ստեղծելու համար օգտագործել ենք Draw Venn Diagram առցանց գործիքը (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/):
Պրոտեոմիկայի վերլուծության համար օգտագործվող վիճակագրական ընթացակարգերի վերաբերյալ մանրամասն տեղեկությունների համար խնդրում ենք դիմել «Նյութեր և մեթոդներ» բաժնի համապատասխան բաժնին: Մնացած բոլոր փորձերի համար մանրամասն տեղեկատվությունը կարելի է գտնել համապատասխան մակագրության մեջ: Եթե այլ բան նշված չէ, բոլոր տվյալները արտահայտված են որպես միջին ± SEM, և բոլոր վիճակագրական վերլուծությունները կատարվել են GraphPad Prism 8.1.2 ծրագրաշարի միջոցով:
Այս հոդվածի լրացուցիչ նյութերի համար այցելեք http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 կայքը։
Սա բաց մատչելիության հոդված է, որը տարածվում է Creative Commons Attribution-Non-Commercial License-ի պայմաններով, որը թույլ է տալիս օգտագործել, տարածել և վերարտադրել ցանկացած միջավայրում, քանի դեռ վերջնական օգտագործումը առևտրային շահույթի համար չէ, և նախադրյալն այն է, որ բնօրինակ աշխատանքը ճիշտ է: Հղում:
Նշում. Մենք խնդրում ենք ձեզ տրամադրել ձեր էլեկտրոնային փոստի հասցեն միայն այն դեպքում, եթե այն ձեր կողմից խորհուրդ տրվող անձը իմանա, որ դուք ցանկանում եք, որ նա տեսնի էլեկտրոնային նամակը, և որ այն սպամ չէ: Մենք չենք գրանցի որևէ էլեկտրոնային փոստի հասցե:
Այս հարցն օգտագործվում է ձեր այցելու լինելը ստուգելու և ավտոմատ սպամի ուղարկումը կանխելու համար։
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Լարսոն
Դիսֆունկցիոնալ նեյրոնների պրոտեոմիկ վերլուծությունը ցույց տվեց, որ նյութափոխանակության ծրագրերը ակտիվանում են նեյրոդեգեներացիային հակազդելու համար։
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Լարսոն
Դիսֆունկցիոնալ նեյրոնների պրոտեոմիկ վերլուծությունը ցույց տվեց, որ նյութափոխանակության ծրագրերը ակտիվանում են նեյրոդեգեներացիային հակազդելու համար։
©2020 Գիտության առաջընթացի ամերիկյան ասոցիացիա. բոլոր իրավունքները պաշտպանված են: AAAS-ը HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef և COUNTER ընկերությունների գործընկերն է: ScienceAdvances ISSN 2375-2548.