Ներկայիս†Ընթացիկ հասցե՝ OX11 0DE, Մեծ Բրիտանիա, Դայմոնդ Բիլդինգ, Հարվելի գիտության և նորարարության այգի, Դիթքոթ, Օքսֆորդշիր, Մեծ Բրիտանիա, Diamond Light Source Co., Ltd., էլեկտրոնային կենսաբանական պատկերման կենտրոն։
Ռեակցիայի կենտրոնի լույսի կլանող կոմպլեքս 1-ը (RC-LH1) մանուշակագույն ֆոտոտրոֆիկ բակտերիաների ֆոտոսինթետիկ հիմնական բաղադրիչն է: Մենք ներկայացրել ենք Rhodopseudomonas palustris-ից ստացված RC-LH1 կոմպլեքսի երկու կրիոէլեկտրոնային մանրադիտակային կառուցվածքներ: RC-LH114-W կոմպլեքսի 2.65-Å լուծաչափով կառուցվածքը բաղկացած է RC-ն շրջապատող 14 LH1 ենթամիավորներից, որոնք ընդհատվում են W սպիտակուցով, մինչդեռ սպիտակուց-W չունեցող կոմպլեքսը ամբողջությամբ RC կազմով շրջապատված է RC-ով: Փակ 16 ենթամիավոր LH1 օղակ: Այս կառուցվածքների համեմատությունը հնարավորություն է տալիս պատկերացում կազմել RC-LH1 կոմպլեքսում քինոնի դինամիկայի մասին, ներառյալ նախկինում չորոշված ​​կոնֆորմացիոն փոփոխությունները, երբ քինոնը կապվում է RC QB տեղում, ինչպես նաև օժանդակ քինոնի կապման տեղամասերի տեղակայման մասին, որոնք օգնում են դրանք փոխանցել RC-ին: W սպիտակուցի եզակի կառուցվածքը կանխում է LH1 օղակի փակումը, դրանով իսկ ստեղծելով ալիք քինոն/քինոլոն փոխանակումը արագացնելու համար:
Ֆոտոսինթեզի միջոցով տրամադրվող էներգիան կարող է պահպանել Երկրի վրա կյանքի գրեթե ողջ ծավալը, և այն մեծ ներուժ ունի արևային կենսատեխնոլոգիայի համար: Գլոբալ ֆոտոսինթեզի խթանմանը զուգընթաց, մանուշակագույն ֆոտոտրոֆիկ բակտերիաները նաև ցուցաբերում են տարբեր էներգետիկ ռեժիմներ և նյութափոխանակության կարողություններ: Նրանք կարող են խուսափել ֆոտոսինթեզից և մթության մեջ աճել որպես հետերոտրոֆ բակտերիաներ, կարող են կլանել ազոտը և ածխաթթու գազը, արտադրել ջրածին և քայքայել արոմատիկ միացությունները (1-3): Այս գործընթացների համար էներգիա ապահովելու համար լույսը պետք է արագ և արդյունավետորեն վերածվի քիմիական էներգիայի: Այս գործընթացը սկսվում է, երբ լույսը կլանող անտենայի համալիրը կլանում է լույսը և փոխանցում է կլանված էներգիան ռեակցիայի կենտրոնին (RC), այդպիսով սկսելով լիցքի բաժանումը (4-7): Մանուշակագույն ֆոտոտրոֆիկ բակտերիաների ֆոտոսինթեզի հիմնական միավորը կազմված է 2-րդ տիպի RC-ից, որը շրջապատված է լույսը կլանող 1-ին համալիրով (LH1), որը կազմում է RC-LH1 միջուկային համալիրը: LH1-ը ձևավորվում է կոր αβ հետերոդիմերների զանգվածով, որոնցից յուրաքանչյուրը կապում է երկու բակտերիալ քլորոֆիլի (BChl)α մոլեկուլ և մեկ կամ երկու կարոտինոիդ (8-12): Ամենապարզ LH1 անտենան բաղկացած է 16 կամ 17 αβ հետերոդիմերներից, որոնք շրջապատում են RC-ն (9-13) փակ օղակով, սակայն այլ միջուկային համալիրներում թաղանթային պեպտիդները խաթարում են շրջապատող LH1-ի անընդհատությունը, դրանով իսկ խթանելով քինոլ/քինոն դիֆուզիան RC-ի և ցիտոքրոմ bc1 համալիրի միջև (11, 13-15): Մանուշակագույն ֆոտոտրոֆիկ բույս ​​Rhodopseudomonas (Rps.)-ը մոդելային օրգանիզմ է, որը կարող է հասկանալ ֆոտոսինթեզը ապահովող էներգիայի և էլեկտրոնների փոխանցումը: Rps-ի առաջին բյուրեղային կառուցվածքը: Palustris RC-LH1 համալիրի մոդելը RC-ն է, որը շրջապատված է 15 հետերոդիմերային LH1 օղակներով, որոնք ընդհատվում են անհայտ սպիտակուցով՝ «Սպիտակուց W» (14): Սպիտակուց-W-ն հետագայում նույնականացվել է որպես RPA4402, որը չբնութագրված 10.5kDa սպիտակուց է՝ երեք կանխատեսված թաղանթային պարույրներով (TMH) (16): Մենք առաջարկում ենք սպիտակուց W կոդավորող rpa4402 գենը վերանվանել pufW՝ համապատասխանելու համար RC-L, M (pufL, pufM) և LH1α, β (pufA, pufB) ենթամիավորները կոդավորող գեների համար օգտագործվող անվանակարգին: Հետաքրքիր է, որ սպիտակուց-W-ն առկա է RC-LH1-ի միայն մոտ 10%-ում, ինչը ցույց է տալիս, որ Rps. palustris-ը արտադրում է երկու տարբեր RC-LH1 համալիրներ: Այստեղ մենք ներկայացնում ենք երկու հիմնական համալիրների բարձր թույլտվությամբ կրիո-EM (կրիո-EM) կառուցվածքները, որոնցից մեկը սպիտակուց W-ով և 14 αβ հետերոդիմերներով է, մյուսը՝ առանց սպիտակուց W-ի և փակ 16 հետերոդիմեր LH1 օղակով: Մեր կառուցվածքը ներկայացնում է քայլ առ քայլ փոփոխություն Rps. palustris-ի RC-LH1 համալիրի ըմբռնման մեջ, քանի որ մենք վերլուծել ենք յուրաքանչյուր տարբերակի միատարր պոպուլյացիան և ունենք բավարար թույլտվությամբ՝ յուրաքանչյուր պեպտիդը և կապված գունանյութերը, ինչպես նաև դրանց հետ կապված լիպիդներն ու քինոնները հստակորեն վերագրելու համար: Այս կառուցվածքների համեմատությունը ցույց է տալիս, որ երեք TMH սպիտակուց-W-ն, որոնք մինչ այժմ չեն հայտնաբերվել որևէ այլ RC-LH1 համալիրում, առաջացնում են քինոնային ալիք՝ քինոն/քինոլոն փոխանակումը արագացնելու համար: Հայտնաբերվել են մի շարք պահպանված լիպիդային և քինոնային կապման տեղամասեր, և մենք բացահայտել ենք քինոնի և RC-ի համադրությունից հետո նոր կոնֆորմացիոն փոփոխություն, որը կարող է հարմար լինել թթվածնավորված ֆոտոտրոֆիկ օրգանիզմների ֆոտոհամակարգ II (PSII) RC-ի համար: Մեր արդյունքները նոր պատկերացում են տալիս մանուշակագույն ֆոտոտրոֆիկ բակտերիաների RC-LH1 միջուկային համալիրում քինոն/քինոլոն կապման և փոխանակման կինետիկայի վերաբերյալ:
Rps. palustris-ում հայտնաբերված երկու համալիրների մանրամասն ուսումնասիրությունը հեշտացնելու համար մենք կենսաքիմիական մեթոդներով մեկուսացրել ենք յուրաքանչյուր RC-LH1: Սպիտակուց W-ի պակասորդ ունեցող համալիրը (այսուհետ՝ ΔpufW) մաքրվել է pufW գենը չունեցող շտամից (16), և կարող է արտադրվել միայն մեկ RC-LH1 համալիր: Սպիտակուց W պարունակող համալիրը արտադրվում է մեկ շտամով: Այս շտամի սպիտակուց W-ն մոդիֆիկացված է 10x His պիտակով իր C-ծայրում, որպեսզի սպիտակուց W պարունակող համալիրը կարողանա արդյունավետորեն համակցվել սպիտակուց W-ի պակասորդ ունեցող մեծ մասի հետ՝ մետաղը անշարժացնելով: Համալիրը արդյունավետորեն առանձնացվում է (16) աֆինիտային քրոմատոգրաֆիայի (IMAC) միջոցով:
Ինչպես ցույց է տրված նկար 1-ում, երկու կոմպլեքսներն էլ պարունակում են երեք ենթամիավոր RC (RC-L, RC-M և RC-H), որոնք շրջապատված են LH1 ալեհավաքով: Սպիտակուց-W-ից զուրկ կոմպլեքսի 2.80-A կառուցվածքը ցույց է տալիս 16 αβ μεտերոդիմերներ, որոնք ձևավորում են փակ LH1 օղակ, որն ամբողջությամբ շրջապատում է RC-ն, այսուհետ՝ RC-LH116 կոմպլեքս: Սպիտակուց-W պարունակող կոմպլեքսի 2.65 Å կառուցվածքն ունի 14-հետերոդիմեր LH1, որը ընդհատվում է սպիտակուց-W-ով, այսուհետ՝ RC-LH114-W:
(A և B) Միացության մակերեսային ներկայացումը։ (C և D) Կապված գունանյութեր, որոնք արտահայտված են ձողիկներով։ (E և F) Ցիտոպլազմային մակերեսից դիտարկվող համալիրների պեպտիդներն ու LH1 ենթամիավորները ներկայացված են մուլտֆիլմերով և համարակալված են սպիտակուց-W ճեղքից ժամացույցի սլաքի ուղղությամբ [համապատասխանում է Rba համարակալմանը։ sphaeroides համալիր (13)]: LH1-α-ի դեպքում սպիտակուցային ենթամիավորի գույնը դեղին է. LH1-β-ի դեպքում սպիտակուցային ենթամիավորի գույնը կապույտ է. սպիտակուց-W-ի դեպքում սպիտակուցը կարմիր է. RC-H-ի դեպքում այն ​​երկնագույն է. RC-L-ի դեպքում այն ​​նարնջագույն է. RC-M-ի դեպքում՝ մանուշակագույն։ Կոֆակտորները ներկայացված են ձողիկներով, կանաչը ներկայացնում է BChl և BPh a մոլեկուլները, մանուշակագույնը՝ կարոտինոիդները, իսկ դեղինը` UQ10 մոլեկուլները։ (G և H) Սպիտակուց-W ճեղքի մեծացված պատկերը RC-LH114-W համալիրի (G) և RC-LH116 համալիրի (H) համարժեք շրջանում։ Կոֆակտորները ցուցադրվում են տարածության լրացման տեսքով, քելացված քինոնը՝ կապույտ գույնով: Սպիտակուց-W բացը (G)-ում ընդգծված է կապույտ կետագծով, իսկ փոքր անցքերը, որտեղ քինոնը/քինոլոլը դիֆուզվում է LH116 օղակի վրա, ընդգծված են սև կետագծով (H)-ում:
Նկար 1-ը (A և B) ցույց է տալիս RC-ն՝ շրջապատված LH1αβ հետերոդիմերների բաց կամ փակ զանգվածներով, որոնցից յուրաքանչյուրը կապվում է երկու BChl և մեկ կարոտինոիդի հետ (Նկար 1, C և D): Նախորդ ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ Rps-ը LH1 համալիրն է: Սպիրուլինայի քսանթինի կենսասինթետիկ ուղում այս տեսակները պարունակում են կարոտինոիդների խառը պոպուլյացիաներ (17): Այնուամենայնիվ, սպիրոպիրոքսանտինը գերիշխող կարոտինոիդն է, և դրա խտությունը բավարար է: Հետևաբար, մենք որոշեցինք մոդելավորել սպիրոքսանտինը LH1-ի բոլոր կապման տեղամասերում: Ալֆա և բետա պոլիպեպտիդները կարճ թաղանթային արտաքին շրջաններով միակ TMH-ներ են (Նկար 1, A, B, E և F): Չնայած C-ծայրամասում 17 մնացորդների խտությունը չի դիտարկվել, ալֆա պոլիպեպտիդը երկու համալիրներում էլ կտրվել է Met1-ից Ala46: β պոլիպեպտիդը վերականգնվել է Gly4-ից մինչև Tyr52 RC-LH116-ում, իսկ Ser5-ից մինչև Tyr52 RC-LH114-W-ում: 3 կամ 4 N-ծայրային կամ 13 C-ծայրային մնացորդների խտություն չի նկատվել (Նկար S1): Վայրի տիպի շտամից պատրաստված խառը RC-LH1 համալիրի զանգվածային սպեկտրոմետրիայի վերլուծությունը ցույց է տվել, որ բացակայող շրջանը այս պեպտիդների հետերոլոգ կտրման արդյունք է (Նկար S1 և S2): Նկատվել է նաև α-Met1-ի N-ծայրային ֆորմիլացում (զ): Վերլուծությունը ցույց է տվել, որ α-պեպտիդը բաղկացած է fMet1-ից մինչև Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 մնացորդներից, իսկ β-պեպտիդը՝ Ser2-ից մինչև Ala53 մնացորդներից, ինչը լավ համապատասխանում է ցածր ջերմաստիճանի EM խտության քարտեզին:
α-His29-ի և β-His36-ի կոորդինացիան BChl-ները դարձնում է դեմ առ դեմ. յուրաքանչյուր αβ հետերոդիմեր հավաքվում է իր հարևանների հետ՝ RC-LH114-W էքսիտոնային միացված գունանյութերի զանգվածի շուրջ բաց օղակ (RC-LH114-W) կամ փակ օղակ (RC-LH116) ձևավորելու համար (Նկար 1, C և D): RC-LH114-W-ի 877 նմ գոտու համեմատ, RC-LH116-ի 880 նմ կլանման կարմիր շեղումը 3 նմ է (Նկար 2A): Այնուամենայնիվ, շրջանաձև դիքրոիզմի սպեկտրը գրեթե նույնն է (Նկար 2B), ինչը ցույց է տալիս, որ չնայած բաց և փակ օղակների միջև կա հստակ տարբերություն, BChl-ների տեղական միջավայրը շատ նման է: Կլանման կարմիր շեղումը կարող է լինել փակ օղակի վրա ջերմային շարժման նվազման և կայունության բարձրացման արդյունք (18, 19), փակ օղակի պատճառով գունանյութերի միացման փոփոխության (20, 21) կամ այս երկու էֆեկտների համադրության արդյունք (11):
(A) Ուլտրամանուշակագույն/տեսանելի/մոտ-ինֆրակարմիր կլանման սպեկտր, որի գագաթները նշված են համապատասխան գունանյութերով և նորմալացված են BPh գագաթնակետին 775 նմ-ում։ (B) Շրջանաձև դիքրոիզմի սպեկտր, նորմալացված է BChl կլանման համար 805 նմ-ում։ (C և D) Ընտրված ΔA սպեկտրներ RC-LH114-W կոմպլեքսի (C) և RC-LH116 կոմպլեքսի (D) ժամանակի լուծմամբ կլանման սպեկտրներից։ Ավելի լավ համեմատության համար բոլոր սպեկտրները նորմալացված են −A-ի ΔA-ին 0.2 ps-ում։ (E) Ցիտոքրոմ c2 օքսիդացման արագությունը ճառագայթումից հետո UQ2-ի տարբեր կոնցենտրացիաների առկայությամբ (տե՛ս նկար S8-ը՝ նախնական տվյալների համար)։ (F) Ցածր, միջին կամ բարձր ինտենսիվության լույսի տակ աճեցված բջիջներում (համապատասխանաբար՝ 10, 30 կամ 300μMm-2 s-1), սպիտակուցային W և RC-L ենթամիավորները մաքրված կոմպլեքսում և առանձնացված թաղանթի հարաբերակցությունը։ Որոշեք սպիտակուցի մակարդակը SDS-պոլիակրիլամիդային գել էլեկտրոֆորեզի և իմունավերլուծության միջոցով (տե՛ս S9 նկարը՝ նախնական տվյալների համար): Որոշեք հարաբերակցությունը մաքրված RC-LH114-W համալիրի նկատմամբ: Համալիրի RC-L-ի և սպիտակուց-W-ի ստոխիոմետրիկ հարաբերակցությունը 1:1 է:
RC-LH114-W-ի դեֆորմացված αβ14 օղակի 1-ին դիրքում գտնվող BChl-ները (Նկար 1, A, C և E) 6.8 Å-ով ավելի մոտ են RC առաջնային դոնորին (P), քան RC-LH116-ի համարժեք BChl-ները (Նկար 1, B, D և F, և Նկար S3). սակայն երկու կոմպլեքսների անցումային կլանման կինետիկան ցույց է տալիս, որ RC-LH114-W-ի և RC-LH116-ի համար LH1-ից RC գրգռման էներգիայի փոխանցման ժամանակի հաստատունները 40 ±4 և 44 ± 3 պվրկ են (Նկար 2): , C և D, Նկար S4 և Աղյուսակ S2): RC-ի ներսում էլեկտրոնային փոխանցման մեջ նույնպես էական տարբերություն չկա (Նկար S5 և դրան կից լրացուցիչ տեքստ): Մենք կասկածում ենք, որ LH1-ի և RC-P-ի միջև էներգիայի փոխանցման ժամանակի սերտ համապատասխանությունը պայմանավորված է երկու LH1 օղակներում BChl-ների մեծ մասի նման հեռավորությամբ, անկյան և պոտենցիալ էներգիայի առկայությամբ: Թվում է, թե LH1 էներգիայի օրինաչափության ուսումնասիրությունը նվազագույն հեռավորությանը հասնելու համար ավելի արագ չէ, քան ենթաօպտիմալ վայրերից RC ուղիղ էներգիայի փոխանցումը: RC-LH114-W-ի բաց օղակաձև LH1 օղակը կարող է նաև աննշան ջերմային շարժման ենթարկվել ցածր ջերմաստիճանի պայմաններում՝ կառուցվածքային վերլուծության համար, և սենյակային ջերմաստիճանում βBChls-ի պիգմենտացիայի հեռավորությունից ավելի երկար αβ14 օղակաձև կոնֆորմացիա կա RC 1 դիրքում:
RC-LH116 համալիրը պարունակում է 32 BChl և 16 կարոտինոիդ, և դրա ընդհանուր դասավորությունը նույնն է, ինչ որ ստացվել է Thermochromatium (Tch.) piddipudum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 շտամից (PDB ID 7C9R) (12) և կանաչ ջրիմուռներից (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10): Հավասարեցումից հետո αβ հետերոդիմերների դիրքերում նկատվել են միայն փոքր շեղումներ, մասնավորապես 1-5, 15 և 16 (Նկար S6): Սպիտակուց-W-ի առկայությունը զգալի ազդեցություն ունի LH1-ի կառուցվածքի վրա: Դրա երեք TMH-ները միացված են կարճ օղակներով, որտեղ N-ծայրը գտնվում է համալիրի լուսանցքային կողմում, իսկ C-ծայրը՝ ցիտոպլազմային կողմում (Նկարներ 1A և 3, A-ից D): Սպիտակուց-W-ն մեծ մասամբ հիդրոֆոբ է (Նկար 3B), և TMH2-ը և TMH3-ը փոխազդում են LH1αβ-14-ի հետ՝ ձևավորելով թաղանթային մակերես (Նկար 3, B և E-ից մինչև G): Միջերեսը հիմնականում կազմված է Phe, Leu և Val մնացորդներից թաղանթային շրջանում: Այս մնացորդները կուտակված են հիդրոֆոբ ամինաթթուների և αβ-14 գունանյութերի հետ: Որոշ բևեռային մնացորդներ նույնպես նպաստում են փոխազդեցությանը, այդ թվում՝ W-Thr68-ի և β-Trp42-ի միջև ջրածնային կապը բարդ խոռոչի մակերեսին (Նկար 3, F և G): Ցիտոպլազմայի մակերեսին Gln34-ը հարակից է αβ-14 կարոտինոիդների կետո խմբին: Բացի այդ, n-դոդեցիլ β-d-մալտոզիդ (β-DDM) մոլեկուլը լուծվել է, և դրա հիդրոֆոբ պոչը ձգվել է մինչև սպիտակուց-W-ի և αβ-14-ի միջև միջերեսը, և լիպիդային պոչը կարող է գտնվել մարմնում: Մենք նաև նկատեցինք, որ սպիտակուց W-ի և RCH-ի C-ծայրային լուծաչափի շրջանները շատ մոտ են, բայց չեն կազմում հատուկ փոխազդեցություններ (Նկար 1, A և E): Այնուամենայնիվ, կարող են լինել փոխազդեցություններ այս երկու սպիտակուցների չլուծված C-ծայրային ամինաթթուներում, որոնք կարող են մեխանիզմ ապահովել սպիտակուց-W-ի հավաքագրման համար RC-LH114-W համալիրի հավաքագրման ընթացքում:
(A) Սպիտակուց-W-ն, որը մուլտֆիլմի տեսքով նայում է LH1αβ14-ի հետ միջերեսին, ունի ձողաձև կողմնային շղթա (կարմիր), որը պատկերված է էլեկտրաստատիկ պոտենցիալի դիագրամի մի մասում (թափանցիկ մոխրագույն մակերես՝ 0.13 կոնտուրային մակարդակով): (B) Սպիտակուց-W-ն ներկայացված է հիդրոֆոբ գունավոր մակերեսով: Բևեռային և լիցքավորված տարածքները պատկերված են երկնագույնով, հիդրոֆոբ տարածքները՝ սպիտակով, իսկ ուժեղ հիդրոֆոբ տարածքները՝ նարնջագույնով: (C և D) Սպիտակուց-W-ն ներկայացված է մուլտֆիլմով, դրա կողմնորոշումը նույնն է, ինչ (A) (C)-ում, և պտտված է 180°-ով (D): Հաջորդականության մեջ դիրքի համաձայն, տարբերակվող մնացորդները ընդունում են ծիածանի գունային սխեմա, որտեղ N-ծայրը կապույտ է, իսկ C-ծայրը՝ կարմիր: (E) Սպիտակուց-W-ն նույն տեսքով, ինչ (A)-ում, և սպիտակուց-W:LH1 միջերեսի մնացորդները ներկայացված են ձողիկներով՝ կցված նշաններով: (F) Մուլտֆիլմային ներկայացման մեջ սպիտակուց-W-ն պտտված է 90°-ով՝ (E)-ի և LH1αβ14-ի նկատմամբ, իսկ սյունակային ներկայացման մեջ՝ միջերեսային մնացորդների նկատմամբ։ Բետա պոլիպեպտիդից կախված մնացորդները նշված են։ Կոֆակտորը ցույց է տրված նկար 1-ի գույնին համապատասխանող սյունակի տեսքով, քայքայված β-DDM-ը՝ մոխրագույնով, իսկ թթվածինը` կարմիրով։ (G) (F)-ի պատկերը պտտված է 180°-ով՝ նշված ալֆա պոլիպեպտիդի աչքի ընկնող մնացորդներով։
Սպիտակուց-W-ն փոխարինում է αβ հետերոդիմերին (15-րդը՝ նկար 1F-ում), այդպիսով կանխելով օղակի փակումը և առաջին երեք αβ հետերոդիմերների թեքությունը։ Նկատվել է, որ առաջին αβ-1 հետերոդիմերի առավելագույն թեքության անկյունը թաղանթի նորմայի նկատմամբ կազմել է 25°-ից 29° (Նկար 1, A և E), որը ձևավորվել է αβ-1-ի 2°-ից 8° թեքության պատճառով RC A սուր հակադրության մեջ գտնվող LH116-ում (Նկար 1, B և F): Երկրորդ և երրորդ հետերոդիմերները թեքված են համապատասխանաբար 12°-ից 22° և 5°-ից 10°: RC-ի ստերիկ խոչընդոտի պատճառով αβ-1-ի թեքությունը չի ներառում αβ-ի երկրորդ զույգը (որը համապատասխանում է նկար 1F-ում 16-րդ αβ-ին), այդպիսով առաջացնելով հստակ բաց LH1 օղակում (Նկար 1, A և E): Երկու αβ հետերոդիմերի բացակայության, ինչպես նաև չորս BChl և երկու կարոտինոիդների կորստի պատճառով, կարոտինոիդներից ոչ մեկը չի կապվում ոլորված αβ-1 ենթամիավորին, ինչի արդյունքում առաջանում է LH114-W օղակ, որը պարունակում է 13 կարոտինոիդ (վեգետարիանական) և 28 BChl: αβ1-ից 7 շրջաններում գտնվող երկու համալիրների տեղային լուծաչափի գնահատականները ցածր են, քան LH1 օղակի մնացած մասի գնահատականները, ինչը կարող է արտացոլել RC QB տեղամասին հարող LH1 ենթամիավորի ներքին պլաստիկությունը (Նկար 4):
RC-LH114-W (A և B) և RC-LH116 (C և D) լուսանկարները ներկայացված են նույն վերևից/կողմնակի տեսքից (A և B) (A և C) և խոռոչի մակերեսից, ինչպես նկար 1-ում (B և D): Գունավոր ստեղները ներկայացված են աջ կողմում:
1:14 ստոխիոմետրիկ հարաբերակցությամբ միակ այլ բնորոշ միջուկային համալիրը Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX դիմերն է (13): Այնուամենայնիվ, սպիտակուց W-ն և PufX-ը ակնհայտ համանմանություն չունեն և զգալի ազդեցություն ունեն իրենց համապատասխան LH1 կառուցվածքների վրա: PufX-ը միակ TMH-ն է՝ N-ծայրային ցիտոպլազմային տիրույթով, որը փոխազդում է RC-H ենթամիավորի ցիտոպլազմային կողմի հետ (13)՝ Rps. palustris LH116αβ-16-ին համապատասխանող դիրքում: PufX-ը ստեղծում է անցք RC-LH1-ի և ցիտոքրոմ bcl համալիրի միջև քինոն/քինոլոն փոխանակման համար և առկա է բոլոր Rba. sphaeroides միջուկային համալիրներում (13): Չնայած մոնոմեր-մոնոմեր միջերեսը գտնվում է Rba-ում: Sphaeroides RC-LH1-PufX դիմերը գտնվում է RC-LH114-W սպիտակուցի W կապման դիրքում, և PufX-ի և սպիտակուց-W-ի կողմից առաջացած բացը գտնվում է համարժեք դիրքում (Նկար S7A): RC-LH114-W-ի բացը նույնպես համընկնում է Pseudomonas rosea LH1-ի հիպոթետիկ քինոնային անցուղու (8) հետ, որը ձևավորվում է W սպիտակուցի կամ PufX-ի հետ կապ չունեցող պեպտիդներով (Նկար S7B): Բացի այդ, Blc-ի քինոնային անցուղին: Մեկ γ ենթամիավորը (7) բացառելով ձևավորված զմրուխտագույն կանաչ LH1-ը գտնվում է նմանատիպ դիրքում (Նկար S7C): Չնայած տարբեր սպիտակուցներով միջնորդված լինելուն, այս քինոն/քինոլոլ անցուղիների RC-LH1 համալիրում ընդհանուր դիրքում հայտնվելը, կարծես, կոնվերգենտ էվոլյուցիայի օրինակ է, ինչը ցույց է տալիս, որ W սպիտակուցի կողմից ստեղծված բացը կարող է գործել որպես քինոնային անցուղու դեր:
LH114-W օղակի ճեղքը թույլ է տալիս ձևավորել անընդհատ թաղանթային շրջան RC-LH114-W համալիրի ներքին տարածության և ծավալային թաղանթի միջև (Նկար 1G), այլ ոչ թե երկու տիրույթները միացնել սպիտակուցային ծակոտիով, ինչպես սպիտակուցների դեպքում։ RC-LH116 համալիրը նման է փակ Tch. ասեղանման համալիրի (22) (Նկար 1H): Քանի որ քինոնի դիֆուզիան թաղանթի միջով ավելի արագ է, քան դիֆուզիան նեղ սպիտակուցային ալիքով, բաց LH114-W օղակը կարող է թույլ տալ RC-ի ավելի արագ շրջանառություն, քան փակ LH116 օղակը, և քինոնի դիֆուզիան RC-ի մեջ կարող է ավելի սահմանափակ լինել: Որպեսզի ստուգենք, թե արդյոք սպիտակուց W-ն ազդում է քինոնների փոխակերպման վրա RC-ի միջոցով, մենք կատարեցինք ցիտոքրոմի օքսիդացման փորձարկում ուբիքինոն 2-ի (UQ2) որոշակի կոնցենտրացիայի վրա (բնական UQ10-ի անալոգ՝ ավելի կարճ իզոպրենային պոչով) (Նկար 2E): Չնայած քելացված քինոնի առկայությունը խոչընդոտում է Միքայելիսի ակնհայտ հաստատունի ճշգրիտ որոշմանը (RC-LH114-W-ն և RC-LH116-ը հարմար են համապատասխանաբար 0.2±0.1μM և 0.5±0.2μM-ի համար), RC-LH114-W-ի առավելագույն արագությունը (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) 28±5%-ով մեծ է RC-LH116-ի (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) համեմատ։
Սկզբում մենք գնահատեցինք, որ սպիտակուց-W-ն առկա է միջուկային համալիրի մոտ 10%-ում (16). այստեղ ցածր լույսի, միջին լույսի և բարձր լույսի պայմաններում աճի բջիջների զբաղվածության մակարդակները համապատասխանաբար կազմում են 15±0.6%, 11±1% և 0.9±0.5% (Նկար 2F): Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի քանակական համեմատությունը ցույց տվեց, որ հիստիդինային պիտակի ավելացումը չի նվազեցրել սպիտակուց-W-ի հարաբերական առատությունը՝ համեմատած վայրի տիպի շտամների հետ (P = 0.59), ուստի այս մակարդակները փոփոխված սպիտակուց-W-ի արտեֆակտ չեն (Նկար S10): Այնուամենայնիվ, սպիտակուց-W-ի այս ցածր զբաղվածությունը RC-LH1 համալիրում կարող է թույլ տալ որոշ RC-ների արագացված տեմպով շրջվել, դրանով իսկ մեղմելով քինոն/քինոլոնային դանդաղ փոխանակումը RC-LH116 համալիրում: Մենք նկատեցինք, որ լույսի բարձր զբաղվածության մակարդակը անհամատեղելի է վերջին տրանսկրիպտոմիկայի տվյալների հետ, ինչը ցույց է տալիս, որ pufW գենի արտահայտությունը մեծանում է ուժեղ լույսի ներքո (Նկար S11) (23): pufW տրանսկրիպցիայի և RC-LH1 համալիրի մեջ սպիտակուց-W-ի ինտեգրման միջև տարբերությունը շփոթեցնող է և կարող է արտացոլել սպիտակուցի բարդ կարգավորումը։
RC-LH114-W-ում տեղակայվել և մոդելավորվել են 6 կարդիոլիպին (CDL), 7 ֆոսֆատիդիլխոլին (POPC), 1 ֆոսֆատիդիլգլիցերին (POPG) և 29 β-DDM մոլեկուլներ՝ 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG և 12 βDDM: RC-LH116 (Նկար 5, A և B): Այս երկու կառուցվածքներում CDL-ն գրեթե տեղակայված է համալիրի ցիտոպլազմային կողմում, մինչդեռ POPC-ն, POPG-ն և β-DDM-ն հիմնականում տեղակայված են լուսային կողմում: RC-LH114-W համալիրի αβ-1-ից αβ-6 շրջանում մեկուսացվել են երկու լիպիդային և լվացող նյութի մոլեկուլներ (Նկար 5A), իսկ հինգը՝ RC-LH116-ի համարժեք շրջանում (Նկար 5B): Կոմպլեքսի մյուս կողմում հայտնաբերվել են ավելի շատ լիպիդներ, հիմնականում CDL, որոնք կուտակվել են RC-ի և αβ-7-ից մինչև αβ-13-ը (Նկար 5, A և B): Այլ կառուցվածքային առումով լուծված լիպիդներ և դետերգենտներ գտնվում են LH1 օղակից դուրս, և լավ լուծված ացիլային շղթաները տարածվում են LH1 ենթամիավորների միջև, որոնք RC-LH114-W-ում նախնականորեն նշանակվել են որպես β-DDM, իսկ RC-ում՝ որպես β-DDM: β-DDM-ի և POPC-LH116-ի խառնուրդ: Մեր կառուցվածքում քելացնող լիպիդների և դետերգենտների նմանատիպ դիրքերը ցույց են տալիս, որ դրանք ֆիզիոլոգիապես համապատասխան կապման տեղամասեր են (Նկար S12A): Tch-ում համարժեք մոլեկուլների դիրքերը նույնպես լավ հետևողականություն ունեն: Gentle և Trv. Շտամ 970 RC-LH1s-ը (Նկար S12, B-ից E) (9, 12) և լիպիդային գլխային խմբի ջրածնային կապերի մնացորդները ցույց տվեցին բավականին լավ պահպանվածություն հաջորդականության դասավորության մեջ (Նկար S13), ինչը ցույց է տալիս, որ պահպանված CDL-ը, որը կապվում է RC-ի հետ (24), այս տեղամասերը կարող են պահպանված լինել RC-LH1 համալիրում։
(A և B) RC-LH114-W (A) և RC-LH116 (B) պեպտիդները ներկայացված են մուլտֆիլմերով, իսկ գունանյութերը՝ ձողիկներով՝ օգտագործելով նկար 1-ում ներկայացված գունային սխեման: Լիպիդները ցույց են տրված կարմիրով, իսկ լվացող նյութերը՝ մոխրագույնով: RC QA և QB տեղամասերին կապված UQ-ն դեղին է, մինչդեռ մեկուսացված UQ-ն՝ կապույտ: (C և D) Նույն պատկերները, ինչ (A) և (B), լիպիդները բաց են թողնված: (E-ից G) RC-LH116-ից Q1(E), Q2(F) և Q3(G)-ի մեծացված պատկերը՝ միմյանց վրա ազդող կողմնակի շղթաներով: Ջրածնային կապերը ցույց են տրված սև կետագծերով:
RC-LH116-ում, ինչպես RC QA-ն, այնպես էլ QB UQ-ն, որոնք մասնակցում են լիցքի բաժանման գործընթացում էլեկտրոնների փոխանցմանը, քայքայվում են իրենց կապման տեղամասերում: Սակայն, RC-LH114-W-ում QB քինոնը չի լուծվել և մանրամասն կքննարկվի ստորև: Բացի QA-ից և QB քինոններից, RC-LH114-W կառուցվածքում տեղաբաշխված են երկու քելացված UQ մոլեկուլներ (գտնվում են RC և LH1 օղակների միջև)՝ ըստ իրենց լավ լուծված գլխային խմբերի (գտնվում են համապատասխանաբար Q1-ում և Q2-ում): Նկար 5C): Q1-ին վերագրվում են երկու իզոպրենային միավորներ, և խտության քարտեզը լուծարում է Q2-ի ամբողջական 10 իզոպրենային պոչերը: RC-LH116-ի կառուցվածքում լուծվել են երեք քելացված UQ10 մոլեկուլներ (Q1-ից Q3, Նկար 5D), և բոլոր մոլեկուլներն ունեն հստակ խտություն ամբողջ պոչում (Նկար 5, D-ից G): Երկու կառուցվածքներում Q1-ի և Q2-ի քինոնային գլխային խմբերի դիրքերը գերազանց հետևողականություն ունեն (Նկար S12F), և դրանք փոխազդում են միայն RC-ի հետ։ Q1-ը գտնվում է RC-LH114-W-ի W ճեղքի մուտքի մոտ (Նկար 1G և 5, C, D և E), իսկ Q2-ը՝ QB կապման տեղամասի մոտ (Նկար 5, C, D) և F): Պահպանված L-Trp143 և L-Trp269 մնացորդները շատ մոտ են Q1-ին և Q2-ին և ապահովում են π-stacking փոխազդեցությունների պոտենցիալ հնարավորություն (Նկար 5, E և F, և Նկար S12): L-Gln88-ը, որը գտնվում է Q1-ի դիստալ թթվածնից 3.0 Å հեռավորության վրա, ապահովում է ուժեղ ջրածնային կապ (Նկար 5E). այս մնացորդը պահպանված է բոլոր RC-ներում, բացառությամբ ամենահեռավոր կապի (Նկար S13): L-Ser91-ը պահպանողականորեն փոխարինում է Thr-ին մյուս RC-ների մեծ մասում (Նկար S13), Q1-ի մեթիլ թթվածնից 3.8 անգստրեմ հեռավորության վրա է և կարող է ապահովել թույլ ջրածնային կապեր (Նկար 5E): Q3-ը, կարծես, չունի սպեցիֆիկ փոխազդեցություն, բայց գտնվում է RC-M ենթամիավորի և LH1-α ենթամիավորների 5-ից 6-ի միջև գտնվող հիդրոֆոբ շրջանում (Նկար 5, D և G): Q1-ը, Q2-ը և Q3-ը կամ մոտակա քելացված քինոնները նույնպես լուծվել են Tch. Gentle, Trv. Strain 970 և Blc-ում: Ծիածանաթաղանթի կառուցվածքը (9, 10, 12) մատնանշում է RC-LH1 համալիրում պահպանված օժանդակ քինոնի կապման տեղամաս (Նկար S12G): RC-LH116-ում հինգ քայքայված UQ-ները լավ համապատասխանում են բարձր արդյունավետությամբ հեղուկ քրոմատոգրաֆիայի (HPLC) միջոցով որոշված ​​յուրաքանչյուր կոմպլեքսի 5.8±0.7-ին, մինչդեռ RC-LH114-W-ում երեք քայքայված UQ-ները ցածր են, քան 6.2±0.3 չափված արժեքը (Նկ. S14) ցույց է տալիս, որ կառուցվածքում կան չլուծված UQ մոլեկուլներ։
Կեղծ-սիմետրիկ L և M պոլիպեպտիդներից յուրաքանչյուրը պարունակում է հինգ TMH և կազմում է հետերոդիմեր, որը համատեղում է մեկ BChl դիմեր, երկու BChl մոնոմեր, երկու բակտերիոֆագի (BPh) մոնոմեր, մեկ ոչ հեմ երկաթ և մեկ կամ երկու UQ10 մոլեկուլ: Վերջնական կետոնային խմբի վրա ջրածնային կապերի առկայության և Rps-ում դրա հայտնի կուտակման միջոցով կարոտինոիդները ներառվում են M-ենթամիավորի մեջ, որը կոչվում է ցիս-3,4-դեհիդրոօրհոդոպին: Տեսակ (25): RC-H-ի արտաքին թաղանթային տիրույթը ամրացված է թաղանթին մեկ TMH-ով: Ընդհանուր RC կառուցվածքը նման է հարակից տեսակների (օրինակ՝ Rba) երեք ենթամիավոր RC-ին: sphaeroides (PDB ID: 3I4D): BChl-ի և BPh-ի մակրոցիկլները, կարոտինոիդային հիմքը և ոչ հեմ երկաթը համընկնում են այս կառուցվածքների լուծաչափի սահմաններում, ինչպես նաև UQ10 գլխավոր խումբը QA տեղում և QB քինոնը RC-LH116-ում (Նկար S15):
Երկու RC կառուցվածքների առկայությունը՝ տարբեր QB տեղամասերի զբաղեցման մակարդակներով, նոր հնարավորություն է տալիս ուսումնասիրելու QB քինոնի կապմանը ուղեկցող հետևողական կոնֆորմացիոն փոփոխությունները: RC-LH116 համալիրում QB քինոնը գտնվում է լիովին կապված «մոտակա» դիրքում (26), բայց RC-LH114-W-ի բաժանումը QB քինոն չունի: RC-LH114-W-ում QB քինոն չկա, ինչը զարմանալի է, քանի որ համալիրն ակտիվ է, ավելի ակտիվ, քան RC-LH116 համալիրը՝ կառուցվածքային առումով լուծված QB քինոնով: Չնայած երկու LH1 օղակները քելացնում են մոտ վեց քինոն, հինգը կառուցվածքային առումով լուծված են փակ RC-LH116 օղակում, մինչդեռ միայն երեքն են կառուցվածքային առումով սահմանափակված բաց RC-LH114-W օղակում: Այս աճող կառուցվածքային խանգարումը կարող է արտացոլել RC-LH114-W QB տեղամասերի ավելի արագ փոխարինումը, համալիրում քինոնի ավելի արագ կինետիկան և LH1 օղակը հատելու հավանականության աճը: Մենք ենթադրում ենք, որ RC-LH114-W-ի RC QB կենտրոնում UQ-ի բացակայությունը կարող է լինել ավելի բարդ և ավելի ակտիվ համալիրի արդյունք, և RC-LH114-W-ի QB կենտրոնը անմիջապես սառեցվել է UQ շրջանառության մեջ։ Հատուկ փուլը (QB կենտրոնի մուտքը փակվել է) արտացոլում է այս ակտիվության կոնֆորմացիան։
Առանց QB-ի, L-Phe217-ի ուղեկցող պտույտը դեպի UQ10 կապման հետ անհամատեղելի դիրք, քանի որ դա կառաջացնի տարածական բախում պոչի առաջին իզոպրենային միավորի հետ (Նկար 6Ա): Բացի այդ, ակնհայտ են հիմնական կոնֆորմացիոն փոփոխությունները, մասնավորապես պարույրը (կարճ պարույր TMH D-ի և E-ի միջև օղակում), որտեղ L-Phe217-ը տեղաշարժվում է դեպի QB կապման գրպանը, և L-Tyr223-ի պտույտը (Նկար 6Ա)՝ M-Asp45 շրջանակի հետ ջրածնային կապը խզելու և QB կապման տեղամասի մուտքը փակելու համար (Նկար 6Բ): Պարույրը պտտվում է իր հիմքում, L-Ser209-ի Cα-ն տեղաշարժվում է 0.33 Å-ով, մինչդեռ L-Val221Cα-ն տեղաշարժվում է 3.52 Å-ով: TMH D-ում և E-ում դիտարկելի փոփոխություններ չկան, որոնք վերադրվում են երկու կառուցվածքներում էլ (Նկար 6Ա): Ինչքան մեզ հայտնի է, սա բնական RC-ի առաջին կառուցվածքն է, որը փակում է QB տեղը։ Ամբողջական (QB-կապված) կառուցվածքի հետ համեմատությունը ցույց է տալիս, որ նախքան քինոնի վերականգնումը, անհրաժեշտ է կոնֆորմացիոն փոփոխություն, որպեսզի այն մտնի քինոնի մեջ։ L-Phe217-ը պտտվում է՝ քինոնի գլխային խմբի հետ π-stacking փոխազդեցություն առաջացնելու համար, և պարույրը տեղաշարժվում է դեպի դուրս, ինչը թույլ է տալիս L-Gly222-ի կմախքին և L-Tyr223-ի կողմնային շղթային ձևավորել ջրածնային կապերի ցանց՝ կայուն ջրածնային կապերի կառուցվածքով (Նկար 6, Ա և Գ):
(A) Հոլոգրամի (L շղթա, նարնջագույն/M շղթա, մանուշակագույն) և apo (մոխրագույն) կառուցվածքի համընկնող մուլտֆիլմ, որտեղ հիմնական մնացորդները ներկայացված են ձողանման ներկայացման տեսքով: UQ10-ը ներկայացված է դեղին շերտով: Կետավոր գիծը ցույց է տալիս ամբողջ կառուցվածքում առաջացած ջրածնային կապերը: (B և C) Ապոլիպոպրոտեինի և ամբողջ օղակաձև կառուցվածքի մակերեսային ներկայացումը, որը համապատասխանաբար առանձնացնում է L-Phe217-ի կողմնակի շղթայի թթվածինը կապույտով և L-Tyr223-ի կարմիրով: L ենթամիավորը նարնջագույն է. M և H ենթամիավորները գունավորված չեն: (D և E) Ապոլիպոպրոտեինի (D) և ամբողջական (E) RC QB տեղամասեր [համապատասխանաբար գունավորել (A)-ով] և Thermophilus thermophilus PSII (կանաչ, կապույտ՝ պլաստիկ քինոնով; PDB ID: 3WU2) Հավասարեցնել (58):
Անսպասելիորեն, չնայած QB-ի դեֆիցիտով RC-ների մի քանի կառուցվածքներ, որոնք չունեն LH1, այս ուսումնասիրության մեջ դիտարկված կոնֆորմացիոն փոփոխությունները նախկինում չեն հաղորդվել: Դրանք ներառում են Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) և Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) QB-ի սպառման կառուցվածքը, որոնք բոլորը գրեթե նույնն են, ինչ իրենց ընդհանուր QB կառուցվածքը: 3PRC-ի մանրակրկիտ ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ LDAO (լաուրիլ դիմեթիլ ամին օքսիդ) լվացող միջոցի մոլեկուլները կապվում են QB դիրքի մուտքի մոտ, ինչը կարող է կանխել վերադասավորումը փակ կոնֆորմացիայի մեջ: Չնայած LDAO-ն չի քայքայվում նույն դիրքում 1EYS-ում կամ 1OGV-ում, այս RC-ները պատրաստվում են նույն լվացող միջոցի օգտագործմամբ և, հետևաբար, կարող են նույն ազդեցությունը առաջացնել: Rba-ի բյուրեղային կառուցվածքը: Ցիտոքրոմ c2-ի հետ համատեղ բյուրեղացված Sphaeroides RC-ն (PDB ID: 1L9B) նույնպես, կարծես, ունի փակ QB տեղամաս։ Սակայն, այս դեպքում, RC-M պոլիպեպտիդի N-ծայրային շրջանը (Q պարույրի վրա Tyr մնացորդի H կապի միջոցով QB կապող տեղամասի հետ փոխազդելով) ընդունում է անբնական կոնֆորմացիա, և QB կոնֆորմացիոն փոփոխությունը հետագայում չի ուսումնասիրվում (30): Հուսադրող է այն, որ մենք չենք տեսել M պոլիպեպտիդի այս տեսակի դեֆորմացիա RC-LH114-W կառուցվածքում, որը գրեթե նույնն է, ինչ RC-LH116 RC-ի N-ծայրային շրջանը։ Պետք է նաև նշել, որ լվացքի միջոցի վրա հիմնված LH1 անտենայի հեռացումից հետո PDB-ում ապոլիպոպրոտեին RC-ները լուծվել են, ինչը վերացրել է ներքին քինոնային պաշարները և լիպիդները RC-ի և շրջակա LH1 օղակի ներքին մակերեսի միջև ընկած բացվածքում (31, 32): RC-ն մնում է ֆունկցիոնալ, քանի որ այն պահպանում է բոլոր կոֆակտորները, բացառությամբ քայքայվող QB քինոնի, որը պակաս կայուն է և հաճախ կորչում է պատրաստման գործընթացում (33): Բացի այդ, հայտնի է, որ LH1-ի և բնական ցիկլիկ լիպիդների հեռացումը RC-ից կարող է ազդեցություն ունենալ այնպիսի գործառույթների վրա, ինչպիսիք են լիցքով բաժանված P+QB վիճակի կրճատված կյանքի տևողությունը (31, 34, 35): Հետևաբար, մենք ենթադրում ենք, որ RC-ն շրջապատող տեղային LH1 օղակի գոյությունը կարող է պահպանել QB «փակ» տեղանքը, այդպիսով պահպանելով QB-ի մոտ գտնվող տեղային միջավայրը:
Չնայած ապոլիպոպրոտեինը (առանց QB քինոնի) և ամբողջական կառուցվածքը ներկայացնում են QB տեղամասի շրջադարձի միայն երկու պատկեր, այլ ոչ թե իրադարձությունների շարք, կան ցուցումներ, որ կապումը կարող է կարգավորվել՝ հիդրոքինոնի կողմից վերկապումը կանխելու համար՝ սուբստրատի արգելակումը կանխելու համար: Քինոլոլի և քինոնի փոխազդեցությունը ապոլիպոպրոտեինի QB տեղամասի մոտ կարող է տարբեր լինել, ինչը հանգեցնում է դրա մերժմանը RC-ի կողմից: Վաղուց ենթադրվել է, որ կոնֆորմացիոն փոփոխությունները դեր են խաղում քինոնների կապման և վերականգնման մեջ: Սառեցված RC-ների՝ մթության մեջ ադապտացիայից հետո քինոնները վերականգնելու ունակությունը խաթարված է (36). ռենտգենյան բյուրեղագրությունը ցույց է տալիս, որ այս վնասը պայմանավորված է նրանով, որ QB քինոնները գտնվում են «դիստալ» կոնֆորմացիայի մեջ՝ ակտիվ պրոքսիմալ դիրքից մոտ 4.5 Å հեռավորության վրա (26), 37): Մենք ենթադրում ենք, որ այս դիստալ կապման կոնֆորմացիան ապոլիպոպրոտեինի և ամբողջական օղակաձև կառուցվածքի միջև միջանկյալ վիճակի պատկեր է, որը հաջորդում է քինոնի հետ սկզբնական փոխազդեցությանը և QB տեղամասի բացմանը:
Որոշակի լուսատրոֆիկ բակտերիաների և ցիանոբակտերիաների, ջրիմուռների և բույսերի PSII համալիրում հայտնաբերված II տիպի RC-ն ունի կառուցվածքային և ֆունկցիոնալ պահպանություն (38): Նկար 6-ում (D և E) ներկայացված կառուցվածքային դասավորվածությունը ընդգծում է PSII RC-ների և բակտերիալ RC համալիրի QB տեղամասի միջև նմանությունը: Այս համեմատությունը վաղուց ի վեր մոդել է հանդիսացել քինոնի կապման և վերականգնման սերտորեն կապված համակարգերի ուսումնասիրության համար: Նախորդ հրապարակումները ենթադրում էին, որ կոնֆորմացիոն փոփոխությունները ուղեկցվում են քինոնների PSII վերականգնմամբ (39, 40): Հետևաբար, հաշվի առնելով RC-ի էվոլյուցիոն պահպանությունը, այս նախկինում չդիտարկված կապման մեխանիզմը կարող է կիրառելի լինել նաև PSII RC-ի QB տեղամասի համար թթվածնավորված լուսատրոֆիկ բույսերում:
Rps ΔpufW (չնշագրված pufW ջնջում) և PufW-His (C-ծայրային 10x His-նշագրված սպիտակուց-W, որը արտահայտված է բնական pufW լոկուսից) շտամներ: palustris CGA009-ը նկարագրվել է մեր նախորդ աշխատանքում (16): Այս շտամները և իզոգեն վայրի տիպի ծնողը վերականգնվել են սառնարանից՝ PYE (յուրաքանչյուրը 5 գ լիտր -1) (պահված LB-ում -80°C ջերմաստիճանում, պարունակող 50% (w/v) գլիցերին) սպիտակուց, խմորիչի քաղվածք և սուկցինատ) ագար [1.5% (w/v)] ագար [1.5% (w/v)] ափսեի վրա փոքր քանակությամբ բջիջներ շերտավորելով: Թիթեղը գիշերը ինկուբացվել է մթության մեջ սենյակային ջերմաստիճանում՝ անաէրոբ պայմաններում, ապա լուսավորվել է OSRAM 116-W հալոգենային լամպերի (RS Components, Մեծ Բրիտանիա) կողմից ապահովված սպիտակ լույսով (~50 μmolm-2 s-1) 3-ից 5 օր, մինչև մեկ գաղութի հայտնվելը: Մեկ գաղութ օգտագործվել է 10 մլ M22+ միջավայր (41)՝ լրացված 0.1% (w/v) կազամինաթթուներով (այսուհետ՝ M22): Մշակույթը աճեցվել է թթվածնի ցածր պարունակությամբ պայմաններում մթության մեջ՝ 34°C ջերմաստիճանում՝ 180 պտ/րոպե արագությամբ թափահարելով 48 ժամ, ապա 70 մլ մշակույթը նույն պայմաններում 24 ժամ շարունակ: 1 մլ ծավալով կիսաաէրոբ մշակույթն օգտագործվել է 30 մլ M22 միջավայրը 30 մլ ունիվերսալ պտուտակավոր կափարիչով թափանցիկ ապակե շշի մեջ ներծծելու և ստերիլ մագնիսական ուժով խառնիչ ձողով 48 ժամ շարունակ խառնիչով (~50μմոլմ-2 վրկ-1) ճառագայթելու համար: Այնուհետև 30 մլ մշակույթը նույն պայմաններում ներծծվել է մոտ 1 լիտր մշակույթով, որն այնուհետև օգտագործվել է մոտ 200 մմոլմ-2 վրկ-1 լուսավորված մոտ 9 լիտր մշակույթ 72 ժամ շարունակ ներծծելու համար: Բջիջները հավաքվել են 7132 RCF ջերմաստիճանում 30 րոպե ցենտրիֆուգացման միջոցով, վերասուզվել են մոտ 10 մլ 20 մՄ տրիս-HCl (pH 8.0) լուծույթի մեջ և պահվել -20°C ջերմաստիճանում մինչև անհրաժեշտության դեպքում։
Հալեցնելուց հետո վերստին սուսպենդացված բջիջներին ավելացրեք դեզօքսիռիբոնուկլեազ I-ի (Merck, Մեծ Բրիտանիա) մի քանի բյուրեղներ, լիզոզիմ (Merck, Մեծ Բրիտանիա) և երկու Roche հոլոէնզիմ պրոտեազի ինհիբիտորային հաբեր (Merck, Մեծ Բրիտանիա): 20,000 psi ֆրանսիական ճնշման խցիկում (Aminco, ԱՄՆ) բջիջները քայքայվել են 8-12 անգամ: Չկոտրված բջիջները և անլուծելի մնացորդները 4°C ջերմաստիճանում 15 րոպե 18,500 RCF ջերմաստիճանում ցենտրիֆուգացման միջոցով հեռացնելուց հետո, մեմբրանը նստեցվել է գունանյութային լիզատից 43,000°C ջերմաստիճանում 113,000 RCF ջերմաստիճանում 2 ժամ ցենտրիֆուգացման միջոցով: Հեռացրեք լուծվող ֆրակցիան և գունավոր մեմբրանը վերստին սուսպենդացրեք 100-200 մլ 20 մՄ տրիս-HCl (pH 8.0) լուծույթում և համասեռացրեք մինչև տեսանելի ագրեգատներ չլինեն: Կախովի թաղանթը ինկուբացվել է 20 մՄ տրիս-HCl (pH 8.0) (Anatrace, ԱՄՆ) լուծույթում, որը պարունակում է 2% (w/v) β-DDM, մթության մեջ 4°C ջերմաստիճանում՝ մեղմ խառնելով։ Այնուհետև ցենտրիֆուգացվել է 70°C ջերմաստիճանում՝ 1 ժամ 4°C ջերմաստիճանում 150,000 RCF լուծելու համար՝ մնացորդային անլուծելի նյութերը հեռացնելու համար։
ΔpufW շտամից ստացված լուծելի թաղանթը տեղադրվել է 50 մլ DEAE Sepharose իոնափոխանակիչ սյան վրա՝ կապող բուֆերի երեք սյունակի ծավալով (CV) [20 մՄ տրիս-HCl (pH 8.0) պարունակող 0.03% (w/v) β-DDM]: Սյունակը լվանալ երկու CV կապող բուֆերներով, ապա լվանալ երկու կապող բուֆերներով, որոնք պարունակում են 50 մՄ NaCl: RC-LH116 կոմպլեքսը էլյուացվել է 150-ից 300 մՄ NaCl գծային գրադիենտով (կապող բուֆերում) 1.75 CV-ի վրա, իսկ մնացած կապող կոմպլեքսը էլյուացվել է 300 մՄ NaCl պարունակող կապող բուֆերով 0.5 CV-ի վրա: Հավաքեք կլանման սպեկտրը 250-ից 1000 նմ միջակայքում, պահեք այն ֆրակցիան, որի կլանման հարաբերակցությունը (A880/A280) մեծ է 1-ից 880-ից 280 նմ-ի վրա, երկու անգամ նոսրացրեք այն կապող բուֆերում և կրկին օգտագործեք նույն ընթացակարգը DEAE սյան վրա: Մաքրման ժամանակ նոսրացրեք այն ֆրակցիաները, որոնց A880/A280 հարաբերակցությունը 1.7-ից բարձր է, իսկ A880/A805 հարաբերակցությունը՝ 3.0-ից բարձր, կատարեք իոնափոխանակման երրորդ փուլը և պահեք այն ֆրակցիաները, որոնց A880/A280 հարաբերակցությունը 2.2-ից բարձր է, իսկ A880/A805 հարաբերակցությունը՝ 5.0-ից բարձր: Մասնակիորեն մաքրված կոմպլեքսը խտացվել է մինչև մոտ 2 մլ Amicon 100,000 մոլեկուլային քաշի սահմանային (MWCO) կենտրոնախույս ֆիլտրում (Merck, Մեծ Բրիտանիա) և բեռնվել է Superdex 200 16/600 չափի բացառման սյան վրա (GE Healthcare, ԱՄՆ), որը պարունակում է 200 մՄ NaCl բուֆեր, ապա էլուացվել է նույն բուֆերում 1.5 CV-ով: Հավաքեք չափի բացառման ֆրակցիայի կլանման սպեկտրները և կենտրոնացրեք կլանման սպեկտրները A880/A280 հարաբերակցությամբ՝ 2.4-ի և A880/A805 հարաբերակցությամբ՝ 5.8-ից 100 A880 հարաբերակցությամբ, և անմիջապես օգտագործեք դրանք կրիո-TEM ցանցի պատրաստման կամ պահպանման համար: Պահեք -80°C ջերմաստիճանում մինչև անհրաժեշտության դեպքում:
PufW-His շտամի լուծելի թաղանթը տեղադրվել է 20 մլ HisPrep FF Ni-NTA Sepharose սյան վրա (20 մՄ տրիս-HCl (pH 8.0) պարունակող 200 մՄ NaCl և 0.03% (w/w)) IMAC բուֆերում (GE Healthcare): v) β-DDM]: Սյունը լվացվել է IMAC բուֆերի հինգ CV-ով, ապա 10 մՄ հիստիդին պարունակող IMAC բուֆերի հինգ CV-ով: Միջուկային կոմպլեքսը էլուացվել է սյունակից 100 մՄ հիստիդին պարունակող հինգ IMAC բուֆերներով: RC-LH114-W կոմպլեքս պարունակող ֆրակցիան խտացվել է մինչև մոտ 10 մլ Amicon 100,000 MWCO ֆիլտրով (Merck, Մեծ Բրիտանիա) հագեցած խառնվող բաքում, 20 անգամ նոսրացվել է կապող բուֆերով, ապա ավելացվել է 25 մլ: DEAE Sepharose սյունակում նախապես օգտագործվում են բուֆերին կապված չորս CV: Սյունակը լվանալ չորս CV կապող բուֆերներով, այնուհետև էլուացնել կոմպլեքսը ութ CV-ների վրա՝ 0-ից 100 մՄ NaCl գծային գրադիենտի վրա (կապող բուֆերում), իսկ մնացած չորս CV-ները պարունակում են 100 մՄ կապող բուֆեր։ Նատրիումի քլորիդի վրա էլուացված մնացորդային կոմպլեքսները, որոնք համակցված են 2.4-ից բարձր A880/A280 հարաբերակցության և 4.6-ից բարձր A880/A805 հարաբերակցության ֆրակցիաների հետ, խտացվել են մինչև մոտ 2 մլ Amicon 100,000 MWCO կենտրոնախույս ֆիլտրում և լցվել են 1.5 CV IMAC նախապես բուֆերով հավասարակշռված Superdex 200 16/600 չափի բացառման սյունակով, ապա էլուացվել են նույն բուֆերում 1.5 CV-ով։ Հավաքեք չափի բացառման ֆրակցիաների կլանման սպեկտրները և կենտրոնացրեք կլանման սպեկտրները՝ A880/A280 հարաբերակցությամբ՝ 2.1-ի և A880/A805 հարաբերակցությամբ՝ 4.6-ից մինչև 100 A880 հարաբերակցությամբ, որոնք անմիջապես օգտագործվում են սառեցված TEM ցանցի պատրաստման համար կամ պահվում են -80°C ջերմաստիճանում մինչև անհրաժեշտությունը։
Leica EM GP ընկղմվող սառնարանը օգտագործվել է ցածր ջերմաստիճանի TEM ցանցեր պատրաստելու համար: Կոմպլեքսը նոսրացվել է IMAC բուֆերում մինչև 50 A880, ապա 5 մկլ-ը տեղադրվել է նոր լուսարձակող QUANTIFOIL 1.2/1.3 ածխածնով պատված պղնձե ցանցի վրա (Agar Scientific, Մեծ Բրիտանիա): Ցանցը ինկուբացվել է 20°C ջերմաստիճանում և 60% հարաբերական խոնավության պայմաններում 30 վայրկյան, այնուհետև չորացվել է 3 վայրկյան, ապա մարվել հեղուկ էթանի մեջ -176°C ջերմաստիճանում:
RC-LH114-W համալիրի տվյալները գրանցվել են eBIC-ում (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source)՝ Titan Krios մանրադիտակով, որն աշխատում է 300 կՎ արագացնող լարման տակ, 130,000× անվանական մեծացմամբ և 20 էՎ էներգիայով։ Տվյալներ հավաքելու համար հաշվարկի ռեժիմով պատկերներ գրանցելու համար օգտագործվել է Gatan 968 GIF Quantum՝ K2 պիկային դետեկտորով։ Կալիբրացված պիքսելի չափը 1.048 Å է, իսկ դոզայի արագությունը՝ 3.83 e-Å-2s-1։ Ֆիլմը հավաքվել է 11 վայրկյանում և բաժանվել 40 մասի։ Մանրադիտակը վերակենտրոնացնելու համար օգտագործվել է ածխածնով պատված տարածքը, ապա յուրաքանչյուր անցքի համար հավաքվել է երեք ֆիլմ։ Ընդհանուր առմամբ հավաքվել է 3130 ֆիլմ՝ -1-ից -3 մկմ դեֆոկուսի արժեքներով։
RC-LH116 համալիրի տվյալները հավաքագրվել են նույն մանրադիտակի միջոցով Աստերբերիի կենսակառուցվածքային լաբորատորիայում (Լիդսի համալսարան, Մեծ Բրիտանիա): Տվյալները հավաքագրվել են հաշվարկման ռեժիմով՝ 130 կՎ մեծացմամբ, իսկ պիքսելների չափը տրամաչափվել է մինչև 1.065 Å՝ 4.6 e-Å-2s-1 դեղաչափով: Ֆիլմը ձայնագրվել է 12 վայրկյանում և բաժանվել 48 մասի: Ընդհանուր առմամբ հավաքագրվել է 3359 ժապավեն՝ -1-ից -3 մկմ դեֆոկուսի արժեքներով:
Բոլոր տվյալների մշակումը կատարվում է Relion 3.0 խողովակաշարում (42): Օգտագործեք Motioncorr 2 (43)-ը՝ ճառագայթի շարժումը դեղաչափի կշռման միջոցով շտկելու համար, ապա օգտագործեք CTFFIND 4.1 (44)-ը՝ CTF (կոնտրաստի փոխանցման ֆունկցիա) պարամետրը որոշելու համար: Այս նախնական մշակման փուլերից հետո բնորոշ լուսանկարչական միկրոլուսանկարները ներկայացված են նկար 2-ում: S16: Ավտոմատ ընտրության ձևանմուշը ստեղծվում է՝ 250 պիքսելանոց շրջանակում 1000 մասնիկի մոտ 250 պիքսել ձեռքով ընտրելով և առանց հղման երկչափ (2D) դասակարգման, այդպիսով մերժելով այն դասակարգումները, որոնք համապատասխանում են նմուշի աղտոտմանը կամ չունեն որևէ տարբերակելի բնութագրեր: Այնուհետև, բոլոր միկրոլուսանկարների վրա ավտոմատ ընտրություն է կատարվել, և RC-LH114-W-ն կազմել է 849,359 մասնիկ, իսկ RC-LH116 համալիրը՝ 476,547 մասնիկ: Բոլոր ընտրված մասնիկները ենթարկվել են ոչ հղման 2D դասակարգման երկու փուլի, և յուրաքանչյուր փորձարկումից հետո մերժվում են այն մասնիկները, որոնք համապատասխանում են ածխածնային տարածքին, ունեն նմուշի աղտոտվածություն, չունեն ակնհայտ առանձնահատկություններ կամ ուժեղ համընկնող մասնիկներ, ինչի արդյունքում RC-LH114-W և RC-LH116-ի եռաչափ դասակարգման համար օգտագործվում են համապատասխանաբար 772,033 (90.9%) և 359,678 (75.5%) մասնիկներ: Սկզբնական եռաչափ հղման մոդելը ստեղծվել է ստոխաստիկ գրադիենտային անկման մեթոդով: Սկզբնական մոդելը որպես հղման օգտագործելով՝ ընտրված մասնիկները դասակարգվում են չորս կատեգորիաների 3D-ում: Այս կատեգորիայի մոդելը որպես հղման օգտագործելով՝ կատարեք եռաչափ մշակում ամենամեծ կատեգորիայի մասնիկների վրա, այնուհետև օգտագործեք սկզբնական 15 Å ցածր հաճախականության ֆիլտրը՝ լուծիչի տարածքը ծածկելու համար, ավելացրեք 6 պիքսել փափուկ եզրեր և հետմշակեք պիքսելները՝ վերին դետեկտորի Gatan K2 գագաթնակետային մոդուլյացիայի փոխանցման ֆունկցիան շտկելու համար: RC-LH114-W տվյալների բազմության համար այս սկզբնական մոդելը փոփոխվել է՝ հեռացնելով դիմակի եզրերին գտնվող ուժեղ խտությունը (որը անջատված է UCSF Chimera-ի միջուկային կոմպլեքսի խտությունից): Արդյունքում ստացված մոդելները (RC-LH114-W-ի և RC-LH116-ի լուծաչափերը համապատասխանաբար 3.91 և 4.16 Å են) օգտագործվում են որպես 3D դասակարգման երկրորդ փուլի հղում: Օգտագործված մասնիկները խմբավորված են սկզբնական 3D դասում և չեն պարունակում հարևանության հետ ուժեղ կապ: Համընկնում կամ ակնհայտ կառուցվածքային առանձնահատկությունների բացակայություն: 3D դասակարգման երկրորդ փուլից հետո ընտրվել է ամենաբարձր լուծաչափով կատեգորիան [RC-LH114-W-ի համար մեկ կատեգորիան 377,703 մասնիկ է (44.5%), RC-LH116-ի համար կան երկու կատեգորիաներ՝ ընդհանուր 260,752 մասնիկ (54.7%), որտեղ դրանք նույնն են միայն սկզբնական պտույտից հետո փոքր տարբերությամբ հավասարեցման դեպքում]: Ընտրված մասնիկները վերստին արդյունահանվում են 400 պիքսելանոց տուփի մեջ և զտվում 3D զտման միջոցով: Լուծիչի դիմակը ստեղծվում է սկզբնական 15 Å ցածր հաճախականության ֆիլտրի, 3 պիքսելային քարտեզի ընդլայնման և 3 պիքսելային փափուկ դիմակի միջոցով: Մասնիկի հաշվով CTF զտման, մասնիկի հաշվով շարժման ուղղման և մասնիկի հաշվով CTF զտման երկրորդ փուլի միջոցով, յուրաքանչյուր քայլից հետո կատարվում են 3D զտում, լուծիչի դիմակավորում և հետմշակում՝ արդյունքում ստացված հյուսվածքը հետագայում զտելու համար: Օգտագործելով FSC (Ֆուրիեի շերտի կորելյացիայի գործակից) 0.143 սահմանային արժեքը, RC-LH114-W և RC-LH116 վերջնական մոդելների լուծաչափերը համապատասխանաբար 2.65 և 2.80 Å են: Վերջնական մոդելի FSC կորը ներկայացված է նկար 2-ում: S17:
Բոլոր սպիտակուցային հաջորդականությունները ներբեռնվել են UniProtKB-ից՝ LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3): SWISS-MODEL (45)-ը օգտագործվել է RC-ի հոմոլոգիայի մոդել կառուցելու համար, որը պարունակում է RC-L, RC-M և RC-H սպիտակուցային հաջորդականությունները և Rba.sphaeroides-ի բյուրեղային կառուցվածքը: RC-ն օգտագործվել է որպես ձևանմուշ (PDB ID: 5LSE) (46): Օգտագործեք UCSF Chimera-ի «համապատասխանեցման քարտեզ» գործիքը՝ ստեղծված մոդելը քարտեզին (47) համապատասխանեցնելու, սպիտակուցի կառուցվածքը բարելավելու և կոֆակտորը [4×BChl a (մոնոմերային գրադարանի մնացորդի անվանումը = BCL), 2×BPh a (BPH), UQ10-ի մեկ կամ երկու տեսակ (U10), մեկ ոչ հեմային երկաթ (Fe) և մեկ 3,4-դիհիդրոհեքսակարբոնիլխոլին (QAK)] ավելացնելու համար օգտագործեք Coot (48) գործիքը։ Քանի որ QAK-ն մոնոմերային գրադարանում հասանելի չէ, այն պարամետրացվել է PHENIX-ի (49) eLOW գործիքի միջոցով։
Հաջորդը, կառուցվեց LH1 ենթամիավորը: Սկզբում PHENIX (49)-ում ավտոմատ կառուցման գործիքն օգտագործվեց LH1 հաջորդականության մի մասը ավտոմատ կերպով կառուցելու համար՝ օգտագործելով քարտեզը և LH1-α և LH1-β սպիտակուցային հաջորդականությունները որպես մուտքային տվյալներ: Ընտրեք ամենաամբողջական LH1 ենթամիավորը, արդյունահանեք այն և բեռնեք այն Coot-ում, ձեռքով ավելացրեք դրանում բացակայող հաջորդականությունը և ձեռքով զտեք ամբողջ կառուցվածքը՝ նախքան երկու BCls a (BCL) և սպիրիլոքսանտին (CRT) ավելացնելը [ըստ համապատասխան Rps LH1 համալիրի խտության և հայտնի կարոտինոիդների պարունակության: Տեսակներ (17)]: Պատճենեք ամբողջական LH1 ենթամիավորը և օգտագործեք UCSF Chimera «Docking Map Tool»-ը՝ LH1 խտության հարակից ոչ մոդելային տարածքում ամրացնելու համար, ապա զտեք այն Coot-ում. կրկնեք գործընթացը մինչև բոլոր LH1 ենթամիավորները մոդելավորվեն: RC-LH114-W կառուցվածքի համար, Coot-ում չբաշխված խտությունը արդյունահանելով, սպիտակուցը բաժանվում է USCF Chimera քարտեզի մնացած ոչ սպիտակուցային բաղադրիչներից, և Autobuild գործիքն օգտագործվում է սկզբնական մոդելը հաստատելու և մնացած ենթամիավորների (պրոտեին-W) մոդելավորման համար: PHENIX (49)-ում: Coot (48)-ում ստացված մոդելին ավելացրեք ցանկացած բացակայող հաջորդականություն, ապա ձեռքով կատարելագործեք ամբողջ ենթամիավորը: Մնացած չբաշխված խտությունը համապատասխանում է լիպիդների (PDB մոնոմերային գրադարանի ID-ն՝ CDL = CDL, POPC = 6PL և POPG = PGT), β-DDM լվացող միջոցի (LMT) և UQ10 մոլեկուլների (U10) համադրությանը: Օգտագործեք PHENIX օպտիմալացումը (49) և ձեռքով օպտիմալացումը Coot (48)-ում՝ ամբողջական սկզբնական մոդելը կատարելագործելու համար, մինչև մոդելի վիճակագրությունը և համապատասխանության տեսողական որակը չկարողանան հետագայում բարելավվել: Վերջապես, օգտագործեք LocScale (50)՝ տեղական քարտեզը սրելու համար, ապա կատարեք չբաշխված խտության մոդելավորման և ավտոմատ և ձեռքով օպտիմալացման մի քանի այլ ցիկլեր:
Համապատասխան պեպտիդները, կոֆակտորները և այլ լիպիդներն ու քինոնները, որոնք ամրացված են իրենց համապատասխան խտությունների շրջանակներում, ներկայացված են նկար 1-ում և 2-ում։ S18-ից մինչև S23։ Վերջնական մոդելի վիճակագրական տեղեկատվությունը ներկայացված է աղյուսակ S1-ում։
Եթե ​​այլ կերպ նշված չէ, UV/Vis/NIR կլանման սպեկտրները հավաքվել են Cary60 սպեկտրոֆոտոմետրով (Agilent, ԱՄՆ) 1 նմ ինտերվալներով՝ 250 նմ-ից մինչև 1000 նմ և 0.1 վ ինտեգրման ժամանակով։
Նոսրացրեք նմուշը քվարցե կյուվետի մեջ՝ A880-ի 2 մմ ուղով, որը հավասար է 1-ի, և հավաքեք կլանման սպեկտրը 400-ից 1000 նմ միջակայքում: Շրջանաձև դիքրոիկ սպեկտրները հավաքվել են Jasco 810 սպեկտրոպոլարիմետրի վրա (Jasco, Ճապոնիա) 1 նմ միջակայքերով՝ 400 նմ-ից 950 նմ միջակայքում, 20 նմ/րոպե սկանավորման արագությամբ:
Մոլային մարման գործակիցը որոշվում է միջուկային համալիրը մոտավորապես 50 A880-ի նոսրացնելով: 10 մկլ ծավալը նոսրացրեք 990 մկլ կապող բուֆերի կամ մեթանոլի մեջ և անմիջապես հավաքեք կլանման սպեկտրը՝ BChl-ի քայքայումը նվազագույնի հասցնելու համար: Մեթանոլի յուրաքանչյուր նմուշի BChl պարունակությունը հաշվարկվել է 771 նմ-ում 54.8 մՄ-1 սմ-1 մարման գործակցով, և որոշվել է մարման գործակիցը (51): Չափված BChl կոնցենտրացիան բաժանեք 32-ի (RC-LH114-W) կամ 36-ի (RC-LH116)՝ միջուկային համալիրի կոնցենտրացիան որոշելու համար, որն այնուհետև օգտագործվում է բուֆերում հավաքված նույն նմուշի կլանման սպեկտրը որոշելու համար: Մարման գործակիցը զուգահեռ: Յուրաքանչյուր նմուշի համար կատարվել են երեք կրկնվող չափումներ, և հաշվարկի համար օգտագործվել է BChl Qy առավելագույնի միջին կլանումը: RC-LH114-W-ի մարման գործակիցը, չափված 878 նմ-ում, կազմում է 3280±140 մՄ-1 սմ-1, մինչդեռ RC-LH116-ի մարման գործակիցը, չափված 880 նմ-ում, կազմում է 3800±30 մՄ-1 սմ-1։
UQ10-ը քանակապես որոշվել է (52)-ում նշված մեթոդի համաձայն։ Հակիրճ ասած, հակադարձ փուլի HPLC (RP-HPLC) իրականացվել է Agilent 1200 HPLC համակարգի միջոցով։ Լուծել մոտ 0.02 նմոլ RC-LH116 կամ RC-LH114-W 50 մկլ 50:50 մեթանոլ:քլորոֆորմի մեջ, որը պարունակում է 0.02% (w/v) երկաթի քլորիդ, և ներարկել նախապես հավասարակշռված Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 մմ լուծույթը։ Լուծել 1 մլ-1 րոպե-1-ում 40°C ջերմաստիճանում HPLC լուծիչում (80:20 մեթանոլ:2-պրոպանոլ) ×25 սմ սյան վրա։ Կատարել իզոկրատիկ էլյուցիա HPLC լուծիչում՝ 275 նմ (UQ10), 450 նմ (կարոտինոիդներ) և 780 նմ (BChl) երկարություններում կլանումը վերահսկելու համար 1 ժամ։ 275 նմ քրոմատոգրամի գագաթնակետը 25.5 րոպեում ինտեգրված էր, որը չէր պարունակում որևէ այլ հայտնաբերելի միացություն: Ինտեգրված մակերեսն օգտագործվում է UQ10-ի մոլային քանակը հաշվարկելու համար՝ հղում անելով 0-ից մինչև 5.8 նմոլ մաքուր ստանդարտների ներարկումից հաշվարկված տրամաչափման կորին (Նկար S14): Յուրաքանչյուր նմուշ վերլուծվել է երեք կրկնօրինակով, և հաղորդված սխալը համապատասխանում է միջինի ստանդարտ շեղմանը:
RC-LH1 համալիր պարունակող լուծույթ՝ առավելագույնը 0.1 Qy կլանմամբ, պատրաստվել է 30 μM վերականգնված ձիու սրտի ցիտոքրոմ c2-ով (Merck, Մեծ Բրիտանիա) և 0-ից 50 μMUQ2-ով (Merck, Մեծ Բրիտանիա): Յուրաքանչյուր UQ2 կոնցենտրացիայով պատրաստվել են երեք 1 մլ նմուշներ և ինկուբացվել են գիշերը մթության մեջ 4°C ջերմաստիճանում՝ չափումից առաջ մթությանը լիարժեք հարմարվելու համար: Լուծույթը բեռնվել է OLIS RSM1000 մոդուլային սպեկտրոֆոտոմետրի մեջ, որը հագեցած է 300 նմ բոցի/500 գծի ցանցով, 1.24 մմ մուտքով, 0.12 մմ միջին և 0.6 մմ ելքային ճեղքերով: 600 նմ երկարությամբ անցնող ֆիլտր է տեղադրվել նմուշի ֆոտոխողովակի և հղման ֆոտոբազմապատկիչ խողովակի մուտքի մոտ՝ գրգռման լույսը բացառելու համար: Կլանումը վերահսկվել է 550 նմ-ում 0.15 վ ինտեգրման ժամանակով: Գրգռող լույսը արձակվում է 880 նմ M880F2 լուսադիոդից (լույս արձակող դիոդ) (Thorlabs Ltd., Մեծ Բրիտանիա)՝ օպտիկամանրաթելային մալուխի միջոցով՝ 90% ինտենսիվությամբ, DC2200 կարգավորիչի (Thorlabs Ltd., Մեծ Բրիտանիա) միջոցով, և արձակվում է լույսի աղբյուրին 90° անկյան տակ։ Չափիչ ճառագայթը հակառակ է հայելուն՝ վերադարձնելու համար նմուշի կողմից սկզբնապես չներծծված ցանկացած լույս։ Հետևեք կլանմանը 50 վայրկյան լուսավորությունից 10 վայրկյան առաջ։ Այնուհետև կլանումը հետագայում վերահսկվեց 60 վայրկյան մթության մեջ՝ գնահատելու համար, թե որքանով է քինոլոլը ինքնաբերաբար նվազեցնում ցիտոքրոմ c23+-ը (տե՛ս S8 նկարը՝ նախնական տվյալների համար):
Տվյալները մշակվել են՝ գծային սկզբնական արագությունը 0.5-ից 10 վայրկյանի սահմաններում տեղադրելով (կախված UQ2 կոնցենտրացիայից) և բոլոր երեք նմուշների արագությունները միջինացնելով յուրաքանչյուր UQ2 կոնցենտրացիայի դեպքում: Համապատասխան մարման գործակցով հաշվարկված RC-LH1 կոնցենտրացիան օգտագործվել է արագությունը կատալիտիկ արդյունավետության վերածելու համար, որը գրաֆիկորեն ներկայացված է Origin Pro 2019-ում (OriginLab, ԱՄՆ), և համապատասխանեցվել է Միխաելիս-Մենտեն մոդելին՝ Km և Kcat ակնհայտ արժեքները որոշելու համար:
Անցումային կլանման չափումների համար RC-LH1 նմուշը նոսրացվել է մինչև ~2μM IMAC բուֆերում, որը պարունակում է 50 մՄ նատրիումի ասկորբատ (Merck, ԱՄՆ) և 0.4 մՄ տերբուտին (Merck, ԱՄՆ): Ասկորբինաթթուն օգտագործվում է որպես զոհաբերական էլեկտրոնների դոնոր, իսկ tert-բուտակլոֆենը՝ որպես QB ինհիբիտոր՝ ապահովելու համար, որ հիմնական RC դոնորը մնա նվազեցված (այսինքն՝ չֆոտոքսիդացված) չափման ողջ գործընթացի ընթացքում: Մոտավորապես 3 մլ նմուշ ավելացվում է հատուկ պտտվող խցիկին (մոտ 0.1 մ տրամագծով, 350 պտույտ/րոպե)՝ 2 մմ օպտիկական ուղու երկարությամբ՝ ապահովելու համար, որ լազերային ուղու վրա գտնվող նմուշը բավարար ժամանակ ունենա գրգռման իմպուլսների միջև մթության մեջ ադապտացիայի համար: Օգտագործեք ~100-fs լազերային իմպուլսներ՝ Ti:Sapphire լազերային համակարգը (Spectra Physics, ԱՄՆ) ուժեղացնելու համար՝ նմուշը 880 նմ-ում գրգռելու համար 1 կՀց կրկնության հաճախականությամբ (20 նՋ՝ NIR-ի կամ 100 նՋ՝ Vis-ի համար): Տվյալներ հավաքելուց առաջ նմուշը մոտ 30 րոպե ենթարկեք գրգռման լույսի ազդեցությանը: Ազդեցությունը կհանգեցնի որակի ապահովման ապաակտիվացման (հնարավոր է՝ մեկ կամ երկու անգամ նվազեցնելով որակի ապահովումը): Սակայն խնդրում ենք նկատի ունենալ, որ այս գործընթացը շրջելի է, քանի որ մթության մեջ ադապտացիայի երկար ժամանակահատվածից հետո RC-ն դանդաղորեն կվերադառնա որակի ապահովման ակտիվության: Helios սպեկտրոմետրը (Ultrafast Systems, ԱՄՆ) օգտագործվել է անցողիկ սպեկտրները չափելու համար՝ -10-ից մինչև 7000 պվրկ ուշացման ժամանակով: Օգտագործեք Surface Xplorer ծրագիրը (Ultrafast Systems, ԱՄՆ)՝ տվյալների հավաքածուները խմբավորելու, այնուհետև միավորելու և ստանդարտացնելու համար: Օգտագործեք CarpetView ծրագրային փաթեթը (Light Conversion Ltd., Լիտվա)՝ համակցված տվյալների հավաքածուն օգտագործելու համար՝ քայքայման հետ կապված դիֆերենցիալ սպեկտրներ ստանալու համար, կամ օգտագործեք ֆունկցիա, որը միացնում է բազմաթիվ ցուցիչներ սարքի արձագանքի հետ՝ Origin-ում (OriginLab, ԱՄՆ) մեկ ալիքի երկարության սպեկտրային էվոլյուցիային համապատասխանեցնելու համար:
Ինչպես նշվեց վերևում (53), պատրաստվեց LH1 համալիր պարունակող ֆոտոսինթետիկ թաղանթ, որը զուրկ էր թե՛ RC-ից, թե՛ ծայրամասային LH2 անտենայից: Թաղանթը նոսրացվեց 20 մՄ տրիս լուծույթում (pH 8.0) և այնուհետև տեղադրվեց քվարցե կյուվետի մեջ՝ 2 մմ օպտիկական ուղիով: 30 նՋ լազերային իմպուլս կիրառվեց նմուշը 540 նմ-ում գրգռելու համար՝ -10-ից մինչև 7000 պվրկ ուշացման ժամանակով: Մշակեք տվյալների հավաքածուն, ինչպես նկարագրված է Rps.pal նմուշի համար:
Մեմբրանը ցենտրիֆուգացվել է 150,000 RCF ջերմաստիճանում 2 ժամ 4°C ջերմաստիճանում, ապա դրա 880 նմ երկարությամբ կլանումը վերստին սուսպենդացվել է 20 մՄ տրիս-HCl (pH 8.0) և 200 մՄ NaCl-ում: Լուծել մեմբրանը դանդաղ խառնելով 2% (w/v) β-DDM-ում 1 ժամ մթության մեջ 4°C ջերմաստիճանում: Նմուշը նոսրացվել է 100 մՄ տրիէթիլամոնիումի կարբոնատում (pH 8.0) (TEAB; Merck, Մեծ Բրիտանիա) մինչև 2.5 մգ մլ-1 սպիտակուցի կոնցենտրացիա (Bio-Rad վերլուծություն): Հետագա մշակումը կատարվել է նախկինում հրապարակված մեթոդով (54), սկսելով 50 մկգ սպիտակուցի նոսրացումից ընդհանուր 50 մկլ TEAB-ի մեջ, որը պարունակում է 1% (w/v) նատրիումի լաուրատ (Merck, Մեծ Բրիտանիա): 60 վայրկյան տևողությամբ ուլտրաձայնային մշակումից հետո այն վերականգնվել է 5 մՄ տրիս(2-կարբօքսիէթիլ)ֆոսֆինով (Merck, Մեծ Բրիտանիա) 37°C ջերմաստիճանում 30 րոպե։ S-ալկիլացման համար նմուշը ինկուբացվել է 10 մՄ մեթիլ S-մեթիլթիոմեթանսուլֆոնատով (Merck, Մեծ Բրիտանիա) և ավելացվել է 200 մՄ իզոպրոպանոլի հիմնական լուծույթից 10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում։ Պրոտեոլիտիկ մարսումը իրականացվել է 2 մկգ տրիպսին/էնդոպրոտեինազա Lys-C խառնուրդ (Promega UK) ավելացնելով և ինկուբացվելով 37°C ջերմաստիճանում 3 ժամ։ Լաուրատային մակերևութային ակտիվ նյութը արդյունահանվել է 50 մկլ էթիլ ացետատ և 10 մկլ 10% (v/v) LC կարգի տրիֆտորացախաթթվային թթու (TFA; Thermo Fisher Scientific, Մեծ Բրիտանիա) ավելացնելով և 60 վայրկյան պտտեցնելով։ Ֆազերի բաժանումը խթանվել է ցենտրիֆուգացմամբ 15,700 RCF ջերմաստիճանում 5 րոպե։ Արտադրողի արձանագրության համաձայն, պեպտիդ պարունակող ստորին փուլը զգուշորեն ասպիրացնելու և աղազրկելու համար օգտագործվել է C18 սպինային սյուն (Thermo Fisher Scientific, Մեծ Բրիտանիա): Վակուումային ցենտրիֆուգմամբ չորացնելուց հետո նմուշը լուծվել է 0.5% TFA-ի և 3% ացետոնիտրիլի մեջ, և 500 նգ վերլուծվել է նանոհոսքային RP քրոմատոգրաֆիայի և զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով՝ օգտագործելով նախկինում մանրամասն նկարագրված համակարգի պարամետրերը:
Rps. palustris պրոտեոմների տվյալների բազան որոնելու համար օգտագործեք MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ծրագիրը՝ սպիտակուցի նույնականացման և քանակականացման համար (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426): Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի պրոտեոմիկայի տվյալները պահվել են ProteomeXchange Alliance-ում՝ PRIDE գործընկեր պահոցի միջոցով (http://proteomecentral.proteomexchange.org)՝ PXD020402 տվյալների հավաքածուի նույնականացուցիչի ներքո:
Էլեկտրասփրեյ իոնացման զանգվածային սպեկտրոմետրիայի հետ զուգակցված RPLC մեթոդով վերլուծության համար RC-LH1 համալիրը պատրաստվել է վայրի տիպի Rps-ից: Նախկինում հրապարակված մեթոդը (16) կիրառելով՝ palustris բջիջներում առաջացած սպիտակուցի կոնցենտրացիան կազմել է 2 մգ մլ-1 20 մՄ Hepes (pH 7.8), 100 մՄ NaCl և 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad վերլուծություն) ) DDM լուծույթում: Արտադրողի արձանագրության համաձայն՝ 10 մկգ սպիտակուցը արդյունահանելու համար օգտագործեք 2D մաքրման հավաքածու (GE Healthcare, ԱՄՆ) նստվածքի մեթոդով, և նստվածքը լուծեք 20 մկլ 60% (v/v) մրջնաթթվի (FA), 20% (v/v) ացետոնիտրիլի և 20% (v/v) ջրի մեջ: Հինգ միկրոլիտր վերլուծվել է RPLC (Dionex RSLC) մեթոդով՝ զուգակցված զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (Maxis UHR-TOF, Bruker) լուծույթով: 60°C ջերմաստիճանում և 100 մկլ/րոպե -1 ջերմաստիճանում բաժանման համար օգտագործեք MabPac 1.2×100 մմ սյունը (Thermo Fisher Scientific, Մեծ Բրիտանիա), 85% (v/v) լուծիչ A [0.1% (v/v) FA և 0.02% (V/v) TFA ջրային լուծույթ] գրադիենտով՝ մինչև 85% (v/v) լուծիչ B [0.1% (v/v) FA և 0.02% (v/v) 90% (v/v) ացետոնիտրիլ TFA]: Ստանդարտ էլեկտրոցողման իոնացման աղբյուրը և ավելի քան 60 րոպե լռելյայն պարամետրերը օգտագործելով՝ զանգվածային սպեկտրոմետրը ստանում է 100-ից 2750 մ/զ (զանգված-լիցք հարաբերակցություն): ExPASy կենսաինֆորմատիկայի ռեսուրսների պորտալի FindPept գործիքի (https://web.expasy.org/findpept/) օգնությամբ զանգվածային սպեկտրը քարտեզագրեք կոմպլեքսի ենթամիավորների վրա:
Բջիջները աճեցվել են 72 ժամ 100 մլ ցածր նեյտրալ ֆլյուորեզի (10μMm-2 վրկ-1), միջին (30μMm-2 վրկ-1) կամ բարձր (300μMm-2 վրկ-1) լույսի ներքո: M22 միջավայր (M22 միջավայր, որտեղ ամոնիումի սուլֆատը բացակայում է, իսկ նատրիումի սուկցինատը փոխարինվում է նատրիումի ացետատով) 100 մլ պտուտակավոր կափարիչով շշի մեջ (23): Հինգ 30 վայրկյան տևողությամբ ցիկլերի ընթացքում 0.1 միկրոն ապակե գնդիկներ են մանրացվել 1:1 ծավալային հարաբերակցությամբ՝ բջիջները լիզացնելու համար, և սառեցվել սառույցի վրա 5 րոպե: Անլուծելի նյութը, չկոտրված բջիջները և ապակե գնդիկները հեռացվել են ցենտրիֆուգացման միջոցով 16,000 RCF ջերմաստիճանում 10 րոպե՝ սեղանի վրա դրվող միկրոցենտրիֆուգում: Թաղանթը բաժանվել է Ti 70.1 ռոտորում՝ 100,000 RCF-ով 20 մՄ տրիս-HCl (pH 8.0) լուծույթում՝ 40/15% (w/w) սախարոզի գրադիենտով 10 ժամվա ընթացքում։
Ինչպես նկարագրված է մեր նախորդ աշխատանքում, His պիտակի իմունոդետեկցիա PufW-ի վրա (16): Հակիրճ ասած, մաքրված միջուկային համալիրը (11.8 նՄ) կամ RC-ի նույն կոնցենտրացիան պարունակող թաղանթը (որոշվել է օքսիդացմամբ՝ հանելով նվազեցված տարբերության սպեկտրը և համապատասխանեցնելով ներկված գելի վրա բեռը) 2x SDS բեռնման բուֆերում (Merck, Մեծ Բրիտանիա) երկու անգամ նոսրացվել է: Սպիտակուցները բաժանվել են կրկնօրինակ 12% bis-tris NuPage գելի վրա (Thermo Fisher Scientific, Մեծ Բրիտանիա): Գելը ներկվել է Coomassie Brilliant Blue-ով (Bio-Rad, Մեծ Բրիտանիա)՝ RC-L ենթամիավորը բեռնելու և տեսողականացնելու համար: Երկրորդ գելի վրա գտնվող սպիտակուցը տեղափոխվել է մեթանոլով ակտիվացված պոլիվինիլիդեն ֆտորիդ (PVDF) թաղանթ (Thermo Fisher Scientific, Մեծ Բրիտանիա)՝ իմունավերլուծության համար: PVDF թաղանթը բլոկավորվել է 50 մՄ տրիս-HCl (pH 7.6), 150 մՄ NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 և 5% (w/v) չորացրած կաթի փոշու մեջ, ապա ինկուբացվել է հակա-His առաջնային հակամարմնի հետ (հակամարմինների բուֆերը նոսրացվել է [50 մՄ տրիս-HCl (pH 7.6), 150 մՄ NaCl և 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ԱՄՆ] 4 ժամվա ընթացքում։ Հակամարմինային բուֆերում 3 անգամ 5 րոպե տևողությամբ լվանալուց հետո, մեմբրանը խառնվել է ձիու բողկի պերօքսիդազի (Sigma-Aldrich, Մեծ Բրիտանիա) հակամկան երկրորդային հակամարմնի հետ (նոսրացված հակամարմինային բուֆերում 1:10,000 հարաբերակցությամբ): Ինկուբացվել է հայտնաբերման համար (հակամարմինային բուֆերում 3 լվացումից 5 րոպե անց)՝ օգտագործելով WESTAR ETA C 2.0 քեմիլյումինեսցենցիայի սուբստրատ (Cyanagen, Իտալիա) և Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Մեծ Բրիտանիա):
Նկարելով յուրաքանչյուր ներկված գելի կամ իմունափորձարկման գոտու ինտենսիվության բաշխումը, ինտեգրելով գագաթնակետի տակ գտնվող տարածքը և հաշվարկելով RC-L-ի (ներկված գել) և Protein-W-ի (իմունափորձարկում) ինտենսիվության հարաբերակցությունը, ImageJ (57)-ում մշակեք պատկերը: Այս հարաբերակցությունները վերածվել են մոլային հարաբերակցությունների՝ ենթադրելով, որ մաքուր RC-LH114-W նմուշում RC-L-ի և protein-W-ի հարաբերակցությունը 1:1 է և համապատասխանաբար նորմալացնելով ամբողջ տվյալների հավաքածուն:
Այս հոդվածի լրացուցիչ նյութերի համար այցելեք http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 կայքը։
Սա բաց մատչելիության հոդված է, որը տարածվում է Creative Commons Attribution License-ի պայմաններով: Հոդվածը թույլ է տալիս անսահմանափակ օգտագործում, տարածում և վերարտադրություն ցանկացած միջավայրում՝ պայմանով, որ բնօրինակ աշխատանքը պատշաճ կերպով մեջբերված է:
Նշում. Մենք խնդրում ենք ձեզ տրամադրել ձեր էլեկտրոնային փոստի հասցեն միայն այն դեպքում, եթե այն ձեր կողմից խորհուրդ տրվող անձը իմանա, որ դուք ցանկանում եք, որ նա տեսնի էլեկտրոնային նամակը, և որ այն սպամ չէ: Մենք չենք գրանցի որևէ էլեկտրոնային փոստի հասցե:
Այս հարցն օգտագործվում է ձեր այցելու լինելը ստուգելու և ավտոմատ սպամի ուղարկումը կանխելու համար։
Դեյվիդ Ջ. Ք. Սվեյնսբերի, Պակ Ցյան, Ֆիլիպ Ջ. Ջեքսոն, Քեյթլին Մ. Ֆարիես, Դարիուս Մ. Նիձվեձկի, Էլիզաբեթ Ս. Մարտին, Դեյվիդ Ա. Ֆարմեր, Լորնա Ա. Մալոն, Ռեբեկա Ֆ. Թոմփսոն, Նիլ Ա. Ռանսոն, Դանիել Պ. Քենիֆ, Մարկ Ջ. Դիկման, Դյուի Հոլտեն, Քրիստին Կիրմայեր, Էնդրյու Հիչքոք, Ս. Նիլ Հանթեր
Ռեակցիոն կենտրոնում լույսի թակարդ 1 համալիրի բարձր թույլտվությամբ կառուցվածքը նոր պատկերացում է տալիս քինոնների դինամիկայի մասին։
Դեյվիդ Ջ. Ք. Սվեյնսբերի, Պակ Ցյան, Ֆիլիպ Ջ. Ջեքսոն, Քեյթլին Մ. Ֆարիես, Դարիուս Մ. Նիձվեձկի, Էլիզաբեթ Ս. Մարտին, Դեյվիդ Ա. Ֆարմեր, Լորնա Ա. Մալոն, Ռեբեկա Ֆ. Թոմփսոն, Նիլ Ա. Ռանսոն, Դանիել Պ. Քենիֆ, Մարկ Ջ. Դիկման, Դյուի Հոլտեն, Քրիստին Կիրմայեր, Էնդրյու Հիչքոք, Ս. Նիլ Հանթեր
Ռեակցիոն կենտրոնում լույսի թակարդ 1 համալիրի բարձր թույլտվությամբ կառուցվածքը նոր պատկերացում է տալիս քինոնների դինամիկայի մասին։
©2021 Գիտության առաջընթացի ամերիկյան ասոցիացիա. բոլոր իրավունքները պաշտպանված են: AAAS-ը HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef և COUNTER ընկերությունների գործընկերն է: ScienceAdvances ISSN 2375-2548.